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Eliminación de nitrógeno y fósforo
de los efluentes
Conceptos y Técnicas de Biotecnología
- 2011 -
Leonardo Erijman - FBMC
Por qué es necesario eliminar
nitrógeno de los efluentes?
1.
Eutrofización
2. Reducción de oxígeno
3. Toxicidad
4.
Contaminación de
acuíferos
5.
6.
Interferencia en la
desinfección
Colonización y corrosión
Cómo se elimina el nitrógeno de los
efluentes?
Ciclo microbiano del nitrógeno
estado de
oxidación
Procesos de tratamiento de efluentes
retención de biomasa
Cámara de
aireación Sedimentador
Distribuidor rotativo
Lecho de relleno
Digestor
Factores que afectan la nitrificación
• Temperatura
• Concentración de oxígeno disuelto
• pH (óptimo entre 7.5-8.6)
• Relación C/N
• Compuestos inhibitorios
El oxígeno disuelto debe ser suficiente para
asegurar la nitrificación
Graidy, C.P.L., Daigger, G, T., Li, H.C. (1999) Biological Wastewater Treatment, 2nd ed.
Perfil de concentración
de sustratos en el floc
Nutrient Removal. WEF Manual of Practice No. 34 (2010) Water Environment Federation
Oxidación de amonio en AOB
Brock Biology of Microorganisms (2011) 13rd ed
Oxidación de nitrito en NOB
Brock Biology of Microorganisms (2011) 13rd ed
Quién nitrifica en las plantas de
tratamiento de efluentes?
Environmental Engineers Handbook © 1999
David Liu, Bèla Lipták, eds. Chapman & Hall, CRC
Press
Gray, N.F. © 2004 BIOLOGY OF
WASTEWATER TREATMENT 2nd ed,
Imperial College Press, London UK
Fluorescence in situ hybridization
FISH
Microbiología de la nitrificación
Schramm et al., Identification and Activities
In Situ of Nitrosospira and Nitrospira spp. as
Dominant Populations in a Nitrifying
Fluidized Bed Reactor (1998) Applied and
Environmental Microbiology, 64: 3480-3485
Nitrosospira spp.
NH4+
NO2Nitrospira
NO2NO3-
Uso de mecanismos alternativos de
conservación de energía en Nitrospira
14C
HCO3-
acetato
S-G-Ntspa-0662-a-A-18 (rojo)
Daims et al., 2001, Appl. Environ. Microbiol. 67: 5273-5284
piruvato
NEU and Nso1225 (verde, AOB)
Adaptación de Nitrospira defluvi a condiciones
de sustrato limitantes
óxido nitroso reductasa (NXR) inusual,
que se expresa constitutivamente
pathways para el transporte, asimilación de compuestos
orgánicos simples, que le permiten el comportamiento
mixotrófico
Lucker et al., 2010, Proc Natl Acad Sci USA 107: 13479-13484
Clasificación filogenética de
bacterias nitrificantes
Diversidad de nitrificantes
Nitrospira
competencia por NH3
otras AOB
heterótrofos
mu
asimilación
tua
org
lism
o
liberación
SMP
Nitrosococcus mobilis
10 µm
competencia
otros recursos
CSLM
Adaptado de: Daims et al. (2006) Trends in Biotechnology 24, 483489
Se debe seleccionar el tiempo de retención
celular para asegurar la nitrificación
• Las nitrificantes son de crecimiento lento
• Tiende a ser un proceso de “todo o nada”
Graidy, C.P.L., Daigger, G, T., Li, H.C. (1999) Biological Wastewater Treatment, 2nd ed.
Mínimo SRT (días)
Se debe seleccionar el tiempo de retención
celular para asegurar la nitrificación
Nitrificación
Nitrification
No Nitrification
No hay nitrificación
Temperatura (°C)
Como aumentar el tiempo de
retención celular?
Crecimiento en biofilms
Sistemas híbridos: MBBR
También hay arqueas oxidantes de amonio
en plantas de tratamiento de efluentes!
Park et al., Appl Environ Microbiol 72, 5643–5647 (2006)
Cómo se cierra el ciclo?
Desnitrificación
Cómo se cierra el ciclo?
Desnitrificación
La mayoría de desnitrificantes son Proteobacterias
aeróbicas/facultativas y son capaces de reducir
(anaeróbicamente) otros aceptores de electrones
Reacciones redox, equilibrio químico
y energía libre
La cantidad de energía que puede ser
liberada se puede calcular a partir de la
diferencia en los potenciales de reducción
de las 2 reacciones y el número de
electrones transferidos:
Zehnder, A.J.B. and W. Stumm. 1988. Geochemistry and biogeochemistry of anaerobic habitats.
A.J.B. Zehnder (ed.) Biology of Anaerobic Microorganisms, pp. 1–38
La remoción convencional de N combina
nitrificación aeróbica y desnitrificación anóxica
Nitrificación aeróbica
Materia orgánica
Desnitrificación
heterotrófica
anóxica
Desnitrificación en el sedimentador secundario
Proceso de nitrificacióndesnitrificación
no
xi
A
Líquido
crudo
co
Recirculado de
nitrato
o
c
bi
ro
e
A
Recirculación (RAS)
TN= 8-10 mg/L
Purga de barro
excedente
(WAS)
Proceso de nitrificacióndesnitrificación
A
xi
co
no
ob
r
e
xi
no
A
co
i
co
Líquido
crudo
A
Recirculado de
nitrato
Metanol u otra
fuente de
carbono
Ae
co
i
b
ro
Recirculación (RAS)
TN < 5 mg/L
Purga de barro
excedente
(WAS)
Proceso se nitrificación- desnitrificación
MLE
Methylophilales son los desnitrificantes
dominantes en barros alimentados con metanol
Hyphomicrobium
EUBmix
BET42a-Cy5
DEN67-cy3
EUBmix
BET42a-Cy5
HYP1241-cy3
EUBmix-Fluor
DEN67-cy3
radiographic film at
the same position as
that of panel C.
Ginige et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 588-596
Bardenpho - 4 etapas
Sistemas híbridos: MBBR
Nitrificación-desnitrificación convencional
Nitrificación aeróbica
Materia orgánica
Desnitrificación
heterotrófica anóxica
Single reactor for high ammonia removal over
nitrite (SHARON)
Nitrificación aeróbica
Desnitrificación
heterotrófica anóxica
Qué variables se pueden controlar para parar
la oxidación en nitrito?
Factor
Efecto
Temperatura
T > 15°C
AOB crecen más rápido que NOB
T = 25°C
AOB pueden competir eliminando NOB
pH
7.0-8.0
Rango óptimo para nitrificación
7.9-8.2
Rango óptimo para AOB (Nitrosomonas)
7.2-7.6
Rango óptimo para NOB (Nitrobacter)
NH3 libre
150 mg/L
Inhibición de AOB y NOB
1.0-7.0 mg/L
Inhibición de NOB y acumulación de nitrito
Largo plazo
NOB pueden adaptarse a altas concentraciones de amoníaco
(40 mg/L) y se reduce la acumulación de nitrito
HNO2
> 2.8 mg/L
Inhibición de AOB y NOB
Predicción teórica de la
oxidación anaeróbica de amonio
Z Allg Mikrobiol. 1977;17(6): 491-3.
Mulder A, Van de Graaf AA, Robertson LA& Kuenen JG (1995)
Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized
bed reactor. FEMS Microbiol. Ecol. 16: 177-183
Descubrimiento de anammox
Nuevo paso en el ciclo de nitrógeno
Annamox: aplicaciones biotecnológicas
Caracterización de bacterias
anammox
Anammox: pathway metabólico
Involvement of a novel hydroxylamine oxidoreductase in anaerobic
ammonium oxidation. Biochemistry. 2000 39: 5405-12.
Anammox: pathway metabólico y
maquinaria enzimática
Kartal et al., Molecular mechanism of anaerobic ammonium oxidation (2011) Nature doi:10.1038/nature10453
Maquinaria enzimática de
Kuenenia stuttgartiensis
Cluster Fe-S
Flujo de electrones
B Kartal et al Molecular mechanism of anaerobic ammonium oxidation. Nature (2011) doi:10.1038/nature10453
Anammoxosoma:propiedades de
la membrana
NATURE | VOL 419 | 17 OCTOBER 2002
Filogenia de anammox
M. Schmid et al., Candidatus "Scalindua
brodae", sp. nov., Candidatus "Scalindua
wagneri", sp. nov., two new species of
anaerobic ammonium oxidizing bacteria.Syst
Appl Microbiol. (2003) 26: 529-38.
Candidatus "Anammoxoglobus
propionicus" a new propionate oxidizing
species of anaerobic ammonium
oxidizing bacteria.Syst Appl Microbiol.
(2007) 30: 39-49
Genoma de bacteria anammox
Importancia biogeoquímica de la
oxidación anaeróbica de amonio
NATURE | VOL 422 | 10 APRIL 2003 |
Gránulos de anammox
NH4+ + 1.5O2 = NO2 - + H2O + 2H+
NH4+ + NO2- = N2 + 2H2O
2NH4+ + 1.5O2 = N2 + 3H2O + 2H+
Annamox: aplicaciones biotecnológicas
Anammox: aplicaciones
biotecnológicas
Aplicaciones en escala de anammox
Rotterdam, Holanda
Más de 500 kg N/d
Aplicaciones en escala de anammox
Rotterdam, Holanda
Tiempo de arranque: 3,5 años!
Comparación con métodos
convencionales
Oxidación anaeróbica de amonio (anammox)
Los procesos de oxidación de Nitrospira y K.
stuttgartiensis están relacionados por eventos de
transferencia lateral
Lücker et al, PNAS 107, 13479-13484 (2010)
Completely autotrophic nitrogen removal over
nitrite (CANON)
Oxygen limited autotrophic nitrification plus
denitrification (OLAND)
Ciclo de N incluyendo eliminación autotrófica
Van Hulle et al., Chem. Eng. J. 162 1–20 (2010)
Biological Augmentation
Batch Enhanced (BABE)
Resumen de esquemas
para eliminación de N
Nutrient Removal. Manual of Practice No. 34. (2010) Water Environment Federation, Alexandria, Va
Fósforo: mucho o muy poco?
Eliminación biológica de fósforo
Enhanced Biological Phosphorus
Removal (EBPR)
}
ΔPi
Formación de PHA y acumulación
de poli-P
Microscopía
electrónica
PHA
Poly-P
Ls organismos Bio-P oxidan PHA y
remueven P en la zona aeróbica
Los ácidos grasos volátiles (AGV) son
productos finales de fermentación
Residuo
complejo
ácido
propiónico
Formación
de ácido
Formación
de metano
otros
intermediarios
ácido
acético
metano
Si paramos el
proceso acá se
obtienen AGV
Secuencia de reactores aeróbicos y
anaeróbicos
P es retenido por PAO y se elimina del sistema en con el barro
excedente
ANAEROBICO
EFLUENTE
AFLUENTE
ANOXICO AEROBICO
WAS (con exceso de P)
Polyphosphate accumulating
organisms (PAO): Rhodocyclus
Tinción de azul de metileno. La flechas
comunes señalan gránulos de polifosfato, las
células señaladas con flechas con rombos no
contienen polifosfato
SCLM EUB338 y una mezcla de 3 PAO. Por
la superposición se ve amarillo
FISH con sondas EUB338 y PAO651
La células teñidas con azul de metileno
(gránulos de polifosfato) son las mismas que
las amarillas en el panel E panel
Crocetti et al., Identification of Polyphosphate-Accumulating Organisms and Design of 16S rRNA-Directed Probes for Their
Detection and Quantitation Appl. Environ. Microbiol. (2000) 66: 1175-1182
Polyphosphate accumulating
organisms (PAO): Actinobacteria
FISH de EUBmix y PAO revelado
con sonda Actino-658
MAR mostrando PAO Actinobacteria
y algunos PAO Rhodocyclales que
incorporan 33Pi aeróbicamente luego
de preincubación anaeróbica con
casaminoacidos.
PAO Actinobacteria consumen
ácido oleico anaeróbicamente
Kong et al., Identity and Ecophysiology of Uncultured Actinobacterial Polyphosphate-Accumulating Organisms in Full-Scale Enhanced
Biological Phosphorus Removal Plant. Appl. Environ. Microbiol. (2005) 71: 4076-4085
Polyphosphate accumulating
organisms (PAO): tetrasphaera
FISH de EUBmix y PAO revelado
con sondas Tet3- 654 o Tet2-892
MAR
mostrando
Tetrasphaera
(sonda
Tet2-174).
Los
cocos
incorporan 33Pi aeróbicamente luego
de preincubación anaeróbica con
casaminoacidos.
Tet3-654 - PAO Tetrasphaera
consumen glucosa anaeróbicamente
Nguyen et al., High diversity and abundance of putative polyphosphate – accumulating Tetrasphaera- related bacteria in
activated sludge systems FEMS Microbiol Ecol 76 (2011) 256–267
Pathway de glucógeno
Glycogen accumulating organisms
(GAO): Alphaproteobacteria
glucogeno
PHA
propionato
Meyer et al., Putative glycogen-accumulating
organisms belonging to the Alphaproteobacteria
identified through rRNA-based stable isotope
probing Microbiology (2006)152: 419-429
Glycogen accumulating organisms
(GAO): Competibacter
FISH mostrando GAOQ431, GAM42a y
BET42a.
Candidatus Competibacter phosphatis
FISH y tinción de Sudan black B mostrando
GAOQ431 y EUBMIX.
Las células magenta son positivas para
GAOQ431 y contienen PHAs (negros en d)
FISH y tinción de azul de Nilo A
mostrando GAOQ431 y EUBMIX.
Las células amarillas son positivas para
GAOQ431 y contienen PHAs (rojo en d)
Crocetti et al., Microbiology (2002), 148, 3353–3364
GAO predomina sobre PAO cuando…
Diversidad de Candidatus Accumulibacter
en PTE
16S rRNA
polyphosphate kinase 1 (ppk1)
He et al., "Candidatus Accumulibacter" Population Structure in Enhanced Biological Phosphorus Removal Sludges as Revealed by
Polyphosphate Kinase Genes Appl Environ Microbiol 73: (2007) 5865-5874
Metabolismo propuesto de EBPR.
Proteinas asociadas
Proteínas involucradas en la βcon la síntesis de
oxidación de ácidos grasos
Enzimas claves en la glucógeno
producción de PHA
Proteinas asociadas
con la degradación
de glucógeno
Alta expresión de proteínas
del pathway de glioxilato
Sistema de transporte
específico para fosfato
Modelo basado en la reconstrucción de datos proteómicos de
Accumulibacter
Forbes et al., The contribution of ‘omic’- based approaches to the study of enhanced biological phosphorus removal microbiology
FEMS Microbiol Ecol 69 (2009) 1–15
Recuperación de estruvita
Aplicaciones en escala de anammox y
recuperación de fósforo
bacteria
anammox
AOB
Olburgen , Holanda
Abma et al., Water Science & Technology 61, 1725 (2010)