procedimientos en electrofisiología i

Procedimientos experimentales en Electrofisiología
El presente capítulo trata de conceptos electrofisiológicos relacionados con análisis
de datos, alcances y limitaciones de ellos así como de protocolos experimentales,
basado en la publicación "Enseñanza en el laboratorio de recuento de canales:
una guía preceptoral en el análisis de la fluctuación de canales iónicos" (Alvarez,
González, Latorre, 2002).
También se harán algunas exposiciones de
resultados contenidos en las publicaciones, que fueron parte de la revisión
bibliográfica anterior.
Conceptos previos
La electrofisiología está en una permanente actualización de conceptos,
dado lo vertiginoso de los avances experimentales como lo complejo del fenómeno
eléctrico de estudio, lo que hace de este campo una fuente continua de nuevo
conocimiento fisiológico.
Un primer principio a considerar, es que la apertura y cierre de los canales
iónicos es un proceso estocástico, que está influído directamente por el potencial
de membrana que inclina la balanza, en el sentido de la apertura o del cierre de
ellos en canales voltaje dependientes (Alvarez, González, Latorre, 2002).
Un segundo concepto a destacar, es que la conductancia de un canal
individual es independiente del potencial de membrana, expresando una relación
lineal entre el potencial de membrana (X) v/s la corriente unitaria en pS (Y), de
acuerdo a un caso particular de la Ley de Ohm, que será tratada posteriormente.
La pendiente de esta gráfica corresponde a la conductancia, que es una constante
(Alvarez, González, Latorre, 2002; Delgado, 1998).
La fluctuación entre estados (open) y (closed) puede representarse por
medio de dos eventos, que expresan variación temporal:
a) evento de apertura (o): el canal se abre y vuelve a cerrarse
b) evento de cierre (c): el canal se cierra y se abre de nuevo
alfa
C ---------> O
C <--------- O
beta
Alfa y beta representan constantes de transición desde un estado al otro.
Por ejemplo cuanto mayor sea el valor de alfa, las aperturas son más frecuentes y
cuanto menor sea el valor de beta, la duración temporal de esas aperturas
aumenta.
Un histograma de duración de aperturas (intervalos de tiempos de aperturas
en milisegundos v/s número relativo de aperturas), exhibe claramente la paradoja
de que en realidad los canales pueden considerarse como permaneciendo siempre
cerrados, pero no herméticamente cerrados y existiendo por ello corrientes iónicas
espontáneas que incrementan su duración en ms, a medida que se despolariza la
membrana en canales voltaje dependientes. De tal forma lo que diferencia a un
canal "cerrado" de uno "abierto" no es propiamente la conductancia iónica a través
de él, que es siempre un valor constante, sino el tiempo de duración de los stocks
y la frecuencia de ocurrencia de estas corrientes (Delgado, 1998).
En los canales "cerrados" los stocks son de muy breve duración y de menor
frecuencia, mientras en los canales "abiertos" se incrementan las aperturas de
larga duración relativa, produciendo una inclinación de la curva de aperturas hacia
la derecha en la gráfica, que resulta exponencial en ambos casos pero desplazada
hacia la izquierda aquella de canales en estado cerrado y hacia la derecha, en
estado abierto (Delgado, 1998).
De estas graficas se obtiene una constante de tiempo (Ta ó alfa) de la
función exponencial, asociada a la distribución de duraciones de eventos de
apertura, como el valor inverso de la constante de transición hacia el estado
cerrado (beta).
Al incrementarse el valor del potencial de membrana,
se incrementan las aperturas y alfa aumenta, mientras disminuye beta (Delgado,
1998).
Corriente macroscópica
La corriente macroscópica está contenida en la expresión I = iNPo, donde :
I = corriente macroscópica (densidad eléctrica por volúmen)
i = corriente del canal i
N = nº total de canales
Po = probabilidad de encontrar el canal abierto
Mediante el análisis de ruido no estacionario es posible encontrar estos
valores, donde Po es dependiente del potencial de membrana (V) y del tiempo (t).
La medición directa a nivel de canales individuales, permite medir la
conductancia del canal, Po y los tiempos de apertura del canal.
En el
caso de corrientes macroscópicas estos datos tienen que ser estimados de forma
indirecta.
La medición de corriente en canales ocurre cuando se despolariza el voltaje
de la membrana por un breve tiempo y se toma el valor de la corriente que fluye
por el canal. El primer pulso ocasiona la apertura de ellos y el segundo pulso o
pulso de prueba el cierre, donde puede medirse la corriente de cola que es
negativa si V < Vx (corriente de revocación que es el voltaje para el cual no hay
Vx).
En una población de canales voltaje-dependiente, se puede medir la
corriente generada por aumento en la amplitud del voltaje aplicado a la membrana
(Alvarez, González, Latorre, 2002).
En la gráfica de I v/s V:
a) Vx corresponde al cruce de la curva en el eje de las X;
b) la pendiente de la cuerda que va desde V=Vx hacia un punto de la curva,
corresponde a la conductancia de la cuerda (NPo) y que equivale a I(t) / (V-Vx), la
cual es asintótica en el caso de altos voltajes.
Sólo una fracción de la conductancia de la cuerda en este valor extremo,
corresponde a la conductancia en función del voltaje.
La conductancia es máxima cuando el valor NPo se maximiza (sin ser Po =
1 necesariamente). Po toma un valor < 1 si los canales son inactivados y
también si la dependencia del voltaje es débil o nula (Alvarez, González, Latorre,
2002).
Como modelo se puede considerar un canal iónico con las siguientes
propiedades:
a) la diferencia de corriente entre estados cerrados y abiertos sea proporcional al
potencial de membrana;
b) la fracción de canales en estado abierto varíe con el incremento del potencial de
membrana, desde 0 a 1;
c) el comportamiento de la apertura de canales tiene comportamiento binomial;
d) una población de canales expresa propiedades voltaje dependientes del
potencial de membrana (comportamiento individual independiente) (Alvarez,
González, Latorre, 2002).
De acuerdo a una simulación por computadora, se puede apreciar que la
probabilidad de apertura es cercana a 0 en 25 mV; próxima a 50 en 45 mV y
cercana a 1 en 65 mV.
Los dos tipos de fluctuaciones o ruido presentes son:
1º fluctuaciones alrededor de la corriente en el canal cerrado y
2º fluctuaciones alrededor de la corriente en la apertura del canal
En el primer caso se trataría del ruido de fondo independiente del estado
abierto o cerrado del canal, sin comprometer el carácter voltaje dependiente del
mismo.
En el segundo caso se trata del pivoteo debido a la apertura del canal y el
retorno al estado cerrado, relacionándose ambos ruidos con los fenómenos de
apertura y cierre del canal.
La intensidad corresponde al número de apertura-cierre por unidad de tiempo.
En este ejemplo se contaron 5 acontecimientos en 25 mV (menor abertura del
canal); 17 en 45 mV y 5 en 65 mV (mayor abertura del canal).
De acuerdo a esto el mayor número de transiciones (ruido), ocurrirá donde la
probabilidad de cambio de estado del canal es también mayor, ya sea hacia el
estado abierto o hacia el estado cerrado. Esta situación se da cuando la
probabilidad de apertura es de 0,5 (y 0,5 la probabilidad de cierre), es decir con un
potencial de membrana de 45 mV en este ejemplo.
El ruido del canal depende entonces de la probabilidad de apertura del
mismo (Po), que es función del potencial de membrana (V) y del tiempo (t): Po
(V,t).
En función del tiempo el ruido es proporcional al número total de canales (N), que
se expresan en la membrana.
La corriente (I) corresponde al campo eléctrico (E) por la conductancia (g)
(Principios de electromagnetismo, ), pero que puede calcularse en el canal abierto
también, como voltaje por conductancia del canal individual (Alvarez, González,
Latorre, 2002).
El ruido gaussiano se adiciona a los demás valores para simular ruido instrumental,
que es filtrado pasivamente.
El otro componente del ruido es la fluctuación actual unitaria (i = V - Vx),
que representa la corriente de un canal individual.
Obtención de los parámetros de Po
Considerando una población homogénea de canales, que se puede reducir a una
membrana con un único canal modelo. Sea p la probabilidad de apertura y q la
probabilidad de cierre (1-p).
La corriente total <I> corresponde a la corriente del canal i, por su probabilidad de
apertura.
La variación de la corriente (I2), es la suma de las desviaciones posibles por la
probabilidad de cada una.
La ausencia de ruido ocurre en dos casos extremos: o bien todos los canales
permanecen cerrados durante todo el tiempo, o todos están abiertos durante ese
lapso.
Esto equivale a decir probabilidades de apertura extremas de 0 y 1.
El mayor ruido corresponde a un valor de Po=0,5 como lo señala la primera
derivada de la ecuación nº 4 (una parábola), que es igual a cero en <I> = i N/2.
La ecuación nº 5 es la pendiente de la parábola y corresponde a la corriente del
canal unitario.
Generalizando el concepto, cualquier pendiente en las
cercanías de una raíz de la parábola, corresponderá a la corriente del canal
unitario (i).
El procedimiento requiere registrar la corriente de estado estacionario en un
potencial de membrana dado, obteniendo valores medios y variación. Luego se
procede a obtener distintas probabilidades de aperturas P, obteniendo de todo ello
la función de una parábola, para luego aplicar las funciones 4 y 5 y obtener
finalmente el valor de i en el canal unitario; el número de canales en la membrana
y la probabilidad máxima de Po.