Efecto del ácido cítrico y del carbón activado en la regeneración de

Efecto del ácido cítrico y del carbón activado en la regeneración de plantas de
orquídeas (Laelia lundii) por cultivo in vitro de semillas
Díaz L. P.1,Namur J .J.1 y Bollati S.A 1
1
Lab. de Cultivo de Tejidos Vegetales. Cát. Caña de Azúcar. Fac. Agr. y Zootecnia. U.N.T.
C.C. 125 (4000) S. M. de Tucumán. R.A.
E-mail: ldiaz@faz.unt.edu.ar
Introducción
El género Laelia Lindl tiene 53 especies y solamente Laelia lundii está representada en la flora
nativa de la Argentina, localizada en Misiones (Iguazú ) y Salta (Jonson, 2001). Es una epifita
mediana, con inflorescencia apical de 1 a 2 flores erguidas, con sépalos y pétalos blancos,
carnosos, delgados y recurvos. El labelo es trilobado, blanco con nervaduras violáceas y base
amarilla (Johnson, 2001).
Debido a las continuas extracciones a que se ve sometida por su valor ornamental, se hace
necesaria la búsqueda de métodos de conservación de germoplasma, la formación de bancos
in vitro y la obtención de protocolos de micropropagación.
La germinación in vivo como el desarrollo posterior de la plántula dependen de la relación
simbiótica con un hongo; sus semillas son pequeñas y contienen poca o ninguna reserva
alimenticia, lo que dificulta la supervivencia de las mismas. En la siembra in vitro es posible
prescindir del hongo sustituyendo su acción por un medio nutritivo de cuya elección adecuada
depende la germinación de la mayor cantidad de semillas (Pierik, 1980). No se conocen
referencias bibliográficas sobre la propagación y la conservación in vitro de esta especie.
Cuando se cultiva in vitro, la oxidación fenólica (Jiménez González, 1998) puede ocasionar
serios problemas en el establecimiento y supervivencia de los explantes de la mayoría de las
especies. Según Preece y Compton (1991) y Hu y Wang (1983) citados por Jiménez González
(1998), cuando los tejidos son dañados se liberan compuestos fenólicos, que se manifiestan
con un ennegrecimiento del medio de cultivo alrededor del explante y que se puede extender
a todo el medio, provocar daños al crecimiento y hasta la muerte del explante.
Una de las prácticas más comunes para contrarrestar el efecto de la oxidación fenólica, es
agregar antioxidantes al medio de cultivo, los que son inhibidores de la polifenoloxidasa o
adsorbentes. Entre los más empleados se pueden citar los ácidos ascórbico, cítrico y málico y
carbón activado. Thorpe et al. (1991) recomiendan la adición de carbón activado, de 0.1- 5 %,
en el medio de cultivo para evitar los efectos de la oxidación de los explantes. En general se
usa para adsorber compuestos tóxicos de la microatmósfera gaseosa o los reguladores de
crecimiento en exceso que están presentes en el medio de cultivo.
El presente trabajo surge como consecuencia de la falta de desarrollo de los explantes
cuando las semillas de Laelia lundii se incubaron inicialmente, debido al oscurecimiento del
medio de cultivo. Por lo que fue necesario analizar la influencia del ácido cítrico y del carbón
activado como sustancias antioxidantes en el cultivo in vitro de semillas de Laelia lundii, a fin
de optimizar la composición del medio de cultivo para su micropropagación y posterior
conservación.
Materiales y métodos
Se realizó el cultivo de semillas de Laelia lundii en medio Murashige y Skoog (MS1) (1962)
con sales a la mitad de la concentración, sacarosa (30 g/l), agar (5 g/l) previa desinfección
superficial del fruto inmaduro en hipoclorito de sodio al 30%, 20 minutos. En el primer
subcultivo, 210 días después de la siembra, se seleccionaron plantas entre 0,5 y 1,2 cm de
altura, con 2-3 raíces y 3 a 5 hojas. Se colocaron 20 plantas por frasco y 4 frascos /
tratamiento en MS1. Los tratamientos fueron: A) ácido cítrico: L1: 50 mg/l, L2: 70 mg/l y L3: 90
mg/l. B) carbón activado (CA): L4: 1 g/l y L5: 2 g/l. C) Testigo: sin antioxidantes. Las
evaluaciones de altura (desde el cuello de la planta al extremo de la hoja más larga) y longitud
de raíces se realizaron a 300 (F1) y 450 días (F2). Se usó un modelo de análisis de la
varianza con submuestreo y test de Tukey.
Resultados y discusión
En el presente trabajo se discute sobre las propiedades del carbón activado, que según Pan y
van Staden, 1998, puede ser usado como promotor o inhibidor de crecimiento in vitro, en
función de la especie y del tipo de explante, establece condiciones de oscuridad, adsorbe
inhibidores, reguladores de crecimiento o libera sustancias promotoras de crecimiento
presentes en el medio o adsorbidas. Sobre el ácido cítrico, hasta el momento no había
referencias sobre su influencia indirecta en el crecimiento in vitro como componente del medio
de cultivo. Pero sí se conocen investigaciones que aconsejan su uso en el establecimiento en
dosis de 100 mg/l (dos días) y 50 mg/l en los días sucesivos. Para evitar la liberación de
polifenoles se aconseja frecuentes subcultivos e inmersión de explantes en dosis de 0,1mg/l
del ácido. Las afirmaciones expuestas se corroboran cuando en la Fig.1 y cuadro 1 se
analizan los efectos indirectos del ácido cítrico y del carbón activado sobre altura de planta
que evidencian diferencias significativas entre los tratamientos y entre las fechas y que no
existe interacción tratamiento fecha. En F2 se alcanzaron alturas mayores para todos los
tratamientos y ningún tratamiento presentó un crecimiento notoriamente mayor.
3,5
Altura de planta
3
2,5
2
F1
1,5
F2
1
0,5
0
L1
L2
L3
L4
L5
T
Tratam iento
Figura 1: Altura de planta de Laelia lundii obtenida por cultivo de semillas en dos fechas y con 6
tratamientos.
Las respuestas a los tratamientos se agrupan en: A) L5: 2 g/l de carbón activado produce los
mayores valores medios. B) L1: 50 mg/l ácido cítrico, produce valores más altos L4: 1 g/l CA y
Testigo arrojan valores intermedios. C) L2 y L3: 70 y 90 mg/l de ácido cítrico, respectivamente,
producen los menores valores.
Cuadro 1: Altura de planta y longitud de raíces de Laelia lundii obtenida por cultivo de semillas.
Tucumán, Argentina. 2006.
Long Raíces
Tratamiento Fecha Altura (cm)
(cm)
F1
1.58 ab
2.16 a
L1
F2
2.41 bc
3.3 b
L2
L3
L4
F1
1.18 a
1.68 a
F2
1.31 a
2.11 a
F1
1.17 a
1.74 a
F2
1.43 a
2.33 a
F1
1.75 ab
1.96 a
L5
T
F2
1.72 ab
2.4 ab
F1
2.8
c
2.28 a
F2
3.19
c
2.53 ab
F1
1.41 a
1.71 a
F2
1.44 a
2.06 a
Letras distintas indican diferencias significativas (p<= 0.05)
En cuanto a los efectos del CA, en el presente trabajo se logró el mejoramiento del
crecimiento in vitro de Laelia lundii, con resultados similares a los obtenidos por Moraes et al.
2005 en orquídeas nativas brasileras para altura de planta y longitud de raíces, para iguales
concentraciones. También Waes v.(2005) trabajó con carbón activado en 18 especies de
orquídeas del Oeste de Europa, durante la fase de germinación y desarrollo in vitro. Los
resultados fueron contradictorios según los géneros de orquídeas analizados, en algunos
casos las respuestas fueron de promoción y en otros casos inhibitorias del crecimiento.
En cuanto a la influencia indirecta del carbón activado y el ácido cítrico en el crecimiento de
raíces se observa en el cuadro1. El ANOVA (cuadro 2) muestra que hay efectos de los
tratamientos y que hay un crecimiento significativo entre las dos fechas. La interacción no
significativa indica que el crecimiento es el mismo en todos los tratamientos . Al respecto la
respuesta a los diferentes tratamientos se puede dividir en: Grupo A) L1y L3: 50 y 90 mg/l de
ácido cítrico, respectivamente; L4 y L5:1 y 2 g/l de carbón activado (CA). Grupo B) L2: 70 mg/l
de ácido cítrico y Testigo.
Cuadro 2: Análisis de la varianza para altura y longitud de raíces de Laelia lundii.
Efecto
Altura
Long. raíces
F
p-valor
F
p-valor
Tratamiento 30.39
<0.0001
5.98
0.0014
Fecha
6.62
0.0177
19.45 0.0002
Tratamiento
1.64
0.1936
1.58
0.2095
X Fecha
No obstante que las interacciones resultaron no significativas se hizo el test de Tukey para
probar la diferencia de crecimiento en L1. Se observó que en L1 hay una diferencia
significativa entre F1 (1,64 a) y F2 (1,86 b), favorables a F2. En los otros tratamientos no hay
diferencias entre F1 y F2. Por lo que se puede sostener que 50 mg/l de ácido cítrico (L1) es
la concentración que más favorece las condiciones de crecimiento en longitud de las raíces,
en F2. A veces, el compuesto que promueve el crecimiento aéreo no necesariamente
favorece el crecimiento radicular. En este trabajo se determinó que el ácido cítrico tiene
influencia indirecta en el crecimiento en altura de plantas y longitud de raíces de Laelia
lundii, probablemente porque afecta la liberación de fenoles en el medio de cultivo.
Conclusiones
El uso de carbón activado en una concentración de 2 g/l en la composición del medio de
cultivo basal favorece en forma indirecta el crecimiento en altura de plantas de Laelia lundii.
El ácido cítrico en la menor concentración empleada en este trabajo (50 mg/l) es la que mas
favorece las condiciones de crecimiento en longitud de raíces de plantas y permite obtener
valores medios de altura de plantas de Laelia lundii. También el carbón activado en L4 (1g/l) y
L5 (2g/l) favorece las condiciones de crecimiento radicular. Por lo que se deberá evaluar el
empleo en la composición del medio de cultivo basal de Laelia lundii del carbón activado en el
primer (F1) y segundo subcultivo (F2) y el ácido cítrico (50 mg/l) en el último subcultivo a fin de
obtener plantas completas con mejor crecimiento aéreo y radicular.
Bibliografía
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plantas por biotecnología. Ed. J.N Pérez Ponce. Instituto de Biotecnología de las Plantas. Santa
Clara, Cuba, p 45-56.
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Moraes, L.M., Faria, R.T. and Cuquel, F.L. 2005. Activated charcoal for in vitro propagation of brazilian
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Pan, M. J. y J. van Staden. 1998. The use of charcoal in in vitro culture – A review. Plant Growth
Regulation. 26:155-163.
Pierik, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mundi-Prensa. Madrid. pp 326.
Thorpe TA, Harry IS y Kumar P.P. 1991. Application of micropropagation to forestry. En:
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