Purificacion de proteinas

Clase 7
Purificación de proteínas
Veamos entonces purificación de proteínas. Hay técnicas Cromatográficas, Técnicas Electroforéticas,
Técnicas de diálisis, Técnicas de precipitación (que es lo que estamos comenzando ahora), Criterios de
Purificación, que son: a) Pureza y Rendimiento, y b) Actividad Total y Actividad Específica. Y de eso
vamos a hablar ahora.
¿Para qué les puede servir a ustedes la purificación de proteínas, si un médico va a comprar todo en polvo,
en una caja…no tiene que purificar nada? Ésta es mi opinión: para leer papers. Porque cuando lean un
artículo científico y estén trabajando con una proteína (sobretodo si es una proteína nueva), va a aparecer
en metodologías cómo se purificó esa proteína, y ustedes tienen que tener los criterios suficientes para
seguir esa metodología y aceptarla o rechazarla o criticarla. Entonces, principalmente, para seguir la
literatura científica de proteínas que son emergentes o de algún artículo clásico en el cual se indique cómo
se purificó el ¿?. Y ¿para qué también les sirve? Es un pretexto para poner en práctica todo lo que hemos
aprendido desde acá hacia atrás.
Veamos la separación de proteínas. A ver, aquí hay dos elementos que son importantes cuando uno separa
una proteína, ¿y de qué la estamos separando? Imagínense, tenemos una célula, las células tienen miles de
proteínas, y miles de tipos de moléculas, que no son proteínas, no todas son proteínas. Lo que nosotros nos
proponemos es aislar UNA proteína, una sola (y probablemente esté en muy baja concentración) para
hacer estudios de funcionalidad y saber esa proteína en qué tipo de proceso biológico está. Aislar esa
proteína tiene un desafío doble: 1) que ojalá pueda aislar mucha proteína, de tal manera que la pueda
manipular fácilmente, o sea hablar de mg. y g. de proteínas purificadas para hacer estudios con esa
proteína, y 2) ojalá que esa proteína que yo aíslo (y que al final la veo en una consistencia que puede ser el
polvo, por ejemplo), esa proteína, tenga la posibilidad, que tenga el atributo de ser pura, es decir, que no
tenga contaminantes. No me sirve una proteína que esté muy contaminada para un estudio de
funcionalidad. Entonces yo necesito criterios de pureza (que es lo último que dije) y de rendimiento
(que es lo primero que dije). El rendimiento tiene que ver con cuánto estoy obteniendo, y la pureza tiene
que ver con qué estoy obteniendo. Entonces todas las técnicas que vamos a ver ahora siempre tienen un
compromiso entre Rendimiento y Pureza, ¿de acuerdo? Y a veces uno para obtener mucho rendimiento, o
sea para obtener gramos de una proteína, necesito sacrificar la pureza de la proteína. Y otras veces para
Separación
precipitación
obtener mucha pureza, necesito
sacrificarpor
el rendimiento
porquesalina
supone hacerla pasar a través líneas
sucesivas de purificación, que hacen que yo vaya perdiendo proteína en el camino, pero me estoy
asegurando que esa proteína va a terminar siendo pura. Por lo tanto, son dos conceptos que a veces se
Cuando
sal, hay
efectos
sobre
contraponen
y porseloagrega
tanto la una
purificación
de dos
la proteína
supone
un la
compromiso entre purificación y
rendimiento.
Entonces,
vamos
a
ver
distintas
técnicas,
y
muchas
de
estas técnicas se utilizan una a
solubilidad de una proteína:
continuación de la otra, de tal manera que me asegure que el producto está puro. Pero probablemente hay
un orden obligado de algunas técnicas y por ejemplo una de las técnicas que primero se aplica en un
- Solubilización
porcual
salado.
compuesto,
en un extracto del
yo quiero purificar una proteína es la Precipitación Salina y les voy a
explicar- por
qué.
Precipitación
por salado.
Precipitació
n Salina
¿Qué es lo
que hay que
hacer primero
si yo quiero
obtener una
proteína?
Vamos
a
poner
un
ejemplo
verídico del que no me debo avergonzar porque forma parte de mi historia personal, así que les diré que
purifiqué una vez la proteína de la alcayota, sí, la alcayota, y es una enzima proteolítica, es decir, capaz de
romper proteínas, es decir, hidroliza el enlace peptídico. Entonces, ¿qué debía hacer yo para purificar la
enzima de la alcayota?
(la enzima proteolítica). Es una enzima ¿ya?, la mayoría de las enzimas son
proteínas. Recientemente se está hablando que hay RNA que tienen actividad enzimática, por eso hago el
alcance, pero realmente, y en general, las enzimas son proteínas. Entonces, había una enzima que rompía
proteína (que era la enzima proteolítica de la alcayota), y había que purificarla. ¿Qué harían? Romper la
alcayota ¿cierto?, sacar la pulpa. Sacamos el jugo de la alcayota. Aquí tenemos que tomar una decisión.
Primero, ¿la enzima es intracelular o extracelular? Porque si es extracelular, no hay ningún problema en
sacarle el juguito. Si es intracelular hay que romper toda la célula para que la enzima salga, así que ya
tenemos un primer problema. Tendría yo que homogeneizar el tejido vegetal de la alcayota, de tal manera
que me asegure que están todos los citoplasmas expuestos digamos y la proteína por tanto la puedo
obtener en el exudado de la alcayota. Así que, de acuerdo, ésta es extracelular y es fácil, sacamos el
juguito a la alcayota. ¿Qué hacemos? Tengo pedazos de alcayota, tengo la cochina’ no más…¿qué hago?
Filtro. Colamos, filtramos. Y después tengo un jugo que yo supongo que es relativamente “puro”. Una de
las primera técnicas que se ocupa (y en el caso de la alcayota que se ocupaba), lo que uno hace es aplicar
sal, para variar la solubilidad de las proteínas. Y cuando agregamos sal, suceden dos cosas. Y veamos la
proteína B en este gráfico:
Fig. 1. Cuando se agrega una sal, hay dos efectos sobre la solubilidad de una proteína:
- Solubilización por salado.
- Precipitación por salado.
Y esto es solubilidad versus concentración de sal. Primero aumenta la solubilidad y después disminuye la
solubilidad. ¿Por qué? ¿De qué modo aumenta? Primero, pensemos, vienen de poco soluble, ¿qué
significa que sean poco soluble? ¿cómo están entre sí? ¿se quieren o se odian? Se quieren, se abrazan. Si
son hidrofóbicas están juntas porque los demás las rechazan ¿cierto? Si son hidrofílicas están juntas
porque tienen afinidad mutua, y por lo tanto no interactúan tanto con el agua. Si fuese así, diríamos que
tienen poca solubilidad. [pregunta ké es solubilidad y la maca responde bien] La solubilidad por lo tanto
depende de la pareja solvente-soluto. Y hasta aquí no más disuelve la proteína del agua, hasta aquí no más
con esa concentración de sal, esta concentración de sal es la máxima [q disuelve]. Y lo que pasa es que
para interferir con la afinidad que hay entre moléculas de las proteínas que hacen que se vayan al fondo y
no interactúen con el agua, necesito agregar sal, para que la sal se interponga en la interacción entre las
proteínas, de tal manera que las cargas de la proteína interactúen más bien con la sal que con la misma
proteína, y como la sal es soluble, todo feliz. El problema es cuando agrego más sal, porque voy a llegar a
un máximo de solubilidad con la proteína B, pero cuando (y a esto se le llama salting-in =solubilización
por saldo [cuando la curva sube] y a éste [cuando la curva baja], salting-out = precipitación por salado)
agrego más sal, ¿por qué empiezan a precipitar las proteínas? [un niño responde algo de que le kitan el
lugar…disminuyen las interacciones con las proteínas]. Exacto, entonces las proteínas se sienten
rechazadas y precipitan. Ahora, esto es espicífico para una proteína, la proteína B, la proteína A y C van a
responder de manera distinta, y ESE es el secreto para purificar. Porque significa que si yo agrego una
oncentración de sal determinada va a haber proteínas más solubles que otras. Por ejemplo a ésta
concentración, la soluble va a ser la C y las insolubles la B y la A. [Señala en el gráfico, cuando la curva C
está arriba y las de A y B abajo]Lo que significa que si yo centrifugo este compuesto a esa concentración
de sal, voy a obtener precipitado de A y B, y soluble de C, y así me quedo con la proteína C. Uds. dirán:
“pero si esto no precipita completamente”, bueno obvio ¬¬, si es la primera etapa de purificación, pero
indudablemente enriquecí la proteína C. Y lo mismo pasa si agrego poquita sal, voy a tener más soluble la
A que la B y la C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteínas y eso es empleado como una
etapa primera de purificación de proteínas. Ojalá no la denature, porque si la denatura, sonamos con la
purificación…es difícil renaturar las proteínas. No se dice “redenaturar”, se dice “Renaturar”
¿Cómo puedo ver una proteína que es microscópica? ¿Cómo puedo saber que la proteína está presente?
Viendo la funcionalidad de la proteína.
¿Qué es la solubilidad? (una vez más) cantidad máxima de soluto que se puede disolver en un solvente
determinado, por lo tanto depende de la pareja solvente- soluto , así que hasta aquí no mas disuelve la
proteína del agua , hasta aquí no mas con esta concentración de sal, hasta aquí no mas esta concentración
de sal es la máxima. Y lo que pasa es que, para interferir con la afinidad que hay entre las moléculas de la
proteína, que hace que se vayan al fondo y no interactúen con el agua, necesito agregar sal, para que la sal
se interponga en la interacción entre las proteínas, de tal manera que las cargas de las proteínas interactúen
mas bien con la sal que con la misma proteína, y como la sal es soluble, todos felices. El problema es
cuando agrego mas sal, porque voy a llegar a un máximo de solubilidad con la proteina B, a eso se le
llama salting in, y a este proceso que viene salting out, que significaria (solubilidad por salado, y
precipitación por salado)
Entonces salting in le denominamos a esta primera fase, y cuando agregamos mas sal, ¿porque empiezan
a precipitar estas proteínas? Porque ahí la sal empieza a interactuar con el agua, no permite que las
proteinas lo hagan, y por lo tanto a las proteínas no les queda mas que interactuar entre si, se sienten
rechazadas y luego precipitan. Ahora esto es especifico para la proteina B, la proteina A y C van a
reaccionar de manera distinta, y ese es el secreto para purificar, porque significa que si yo agrego una
concentración de sal determinada, va a haber proteinas más solubles que otras. Por ejemplo a esta
concentración X, la soluble va a ser la C y las insolubles van a ser la A y B, y significa que si yo
centrifugo ese compuesto a esa concentración de sal, voy a obtener precipitado de Ay B, soluble de C y
me quedo con esa proteina. Si no precipita completamente es porque es la primera etapa de purificación,
pero indudablemente enriquecí la proteina C si agrego sal. Y lo mismo podría pasar si agrego poquita sal,
voy a obtener mas oluble la A, que la B y C. La sal por lo tanto afecta la solubilidad de las proteinas y eso
fue empleado como una etapa primaria de purificación Ojala no la denature, por que si lo hace no se puede
purificar, porque es difícil renaturar.
Entonces la solubilidad aumenta
porque al
agregar sal, el primer efecto al haber pocas
concentraciones de sal, es disminuir las
interacciones entre las proteínas, porque la sal
compite. La sal esta disuelta asi que todo bien
para que las proteínas tambien esten disueltas, no
se van al fondo.
Pregunta: ¿como saber hasta que punto agregar
sal, si se poco de la proteina? Ensayo y error, y te vas dando cuenta cuando tienes mucha mas pura la
proteina que te interesa.
¿Como veo una proteína que es microscópica? Viendo la funcionalidad de la proteina, por ejemplo si
tengo una proteína que es inflamatoria, para saber si la tengo los extractos de la proteína se los inyecto en
la pata de una rata, y veo si se inflama o no midiendo el diámetro de la pata. Eso se llama ensayo
biológico, tenemos ensayos quimico, bioquimicos y biológicos del extracto que estas obteneniendo y
saber si la tienes en mayor o menor concentración, y al mismo tiempo mides proteína total, para saber con
cuanta proteína te estas quedando. Se hacen los 2 tipos de mediciones proteina total y funcionalidad de la
proteina, asi que, es necesario poder observar la proteina de alguna manera, sino no se si la tengo o no la
tengo.
Hay otro método de purificación: La diálisis. Imagínense que precipite la enzima proteolitica de la
alcayota, y lo que obtuve, me quede con el precipitado, no con el soluble. Y la redisuelvo, y va a estar
contaminada con sal, porque el método anterior que utilice fue precipitación salina, entonces lo que esta
rojo seria la sal, y lo que esta en verde seria la proteína. Y si pongo
una membrana de celofán o semipermeable, con un diámetro de poro
que permita que salgan los iones de sal, pero no permita que salgan
la proteína, entonces a través de difusión simple yo veo que sal
empieza a migrar hacia el espacio del compartimento que esta a
fuera que es pura agua, y voy a quedar con la proteína mucho mas
pura, voy a eliminar contaminantes de bajo peso molecular a través
de la diálisis.
Ahora piensen que tal vez esa proteína tenía una molécula que siempre la acompaña y que la inhibía o
bajaba su actividad, probablemente esa molécula en ese paso salga y la pierda. Entonces tengo que tener
conciencia del proceso que estoy aplicando, porque estoy introduciendo modificaciones en la muestra, y
probablemente haya algún factor que sea importante para la actividad de la enzima, y que a lo mejor
encendía o apagaba la actividad de la enzima y lo voy a perder si era de bajo peso molecular, así que
puede que suceda y puede que no. Si son moléculas de alto peso molecular, se aplican otras técnicas más
gruesas, y se va afinando con otras mas especificas.
Cuando uno trabaja con una proteína que no se conoce, se debe estar atento a todos los resultados y tratar
de interpretarlos.
Esa era una segunda etapa de purificación, y es bastante gruesa. Ahora yo tomo los extractos que obtengo
acá, y los ocupo en técnicas que voy mostrando a continuación.
Hay un tipo de cromatografía que es la de partición, es cuando a través de la solubilidad se separa un
soluto que se distribuye en forma diferente en fase sólida como un papel, a una fase móvil que puede ser
una muestra de distintos solventes, agua con etanol, con butanol, distintos alcoholes para dar la polaridad
apropiada. Consistía en una cámara con un solvente o mezcla de solventes con una polaridad
determinada, y ponían un fase sólida que podía ser un papel, que es pura celulosa (que a su vez esta
formada por glucosa), la celulosa tiene enlaces glucosidicos, B 1-4 para establecer las cargas, son puros
polimeros de enlaces B 1-4. Cuando tienen estos enlaces en la celulosa se establece un polimero, que ese
constituye el papel en este caso. Pero esa celulosa tiene afinidad por el agua, por lo tanto esta hidratada.
Cuando agregamos una muestra, esta sube por cuanto tiene afinidad por el solvente, y el solvente sube por
capilaridad. ¿Por qué sube por capilaridad? El solvente tiene polaridad, la glucosa tiene polaridad, por lo
tanto empieza a interactuar con la glucosa y tiende a subir, porque tiene afinidad, hay fuerzas que la une
a la glucosa, y si hay mucha glucosa arriba en al celulosa, tiende a subir el liquido porque se están
encaramando las moléculas del solvente sobre la celulosa, entonces sube el solvente (no solo es agua,
puede ser con componentes mas apolar, como ser alcohol) a través del papel y el soluto que estaba en la
línea de partida con línea segmentada, va a seguir el frente del solvente como pueda, porque ama al
solvente, al agua que hidrata a la celulosa, y a la celulosa (afinidad por el solvente y la fase estacionaria).
Entonces si tengo un aminoácido muy polar, va a tener atracción por la fase estacionaria que es glucosa y
agua, y si la fase movil, que es agua y una componente hidrofobica, va a tener menor afinidad por el
aminoácido. Entonces este aminoácido no sigue al frente, se va retrasando. ¿Por qué se retrasa? La
molécula comparte su tiempo entre la fase movil y la estacionaria, se sienta a descansar o avanza con el
solvente, eso es al azar, pero pasa más tiempo con quien tiene más afinidad.
Si tengo distintas moléculas, que tienen distinta
afinidad relativa entre fase movil y estacionaria,
no van migrar de la misma forma, algunas
llegaran más lejos y otras se quedaran mas cerca
de la línea de partida. Ahí aparece Rf: que es un
coeficiente dado entre lo que migro el soluto, y lo
que migro la fase estacionaria. Ustedes calculan
ese Rf y lo pueden utilizar en casos para
propositos de comparación.
Entonces aquí agregamos una muestra, una gota
que se resuelve en 3 manchas, son 3 aminoácidos
distintos que estoy separando. Entonces los
identifico, porque después los rocío con un
colorante para aminoácidos ( hay uno que interactúa con el grupo alpha amino, que se llama ninhidrina, y
ese colorante cuando se rocía sobre el papel marca y establece marquitas de color violeta) y paralelamente
sospecho que era por ejemplo aspartico, glutámico y fenilalanina, y pondré en paralelo los mismos pero
comprados y comparo los Rf, y si uno migra igual que el otro debe ser el que sospecho, por ejemplo, si el
que pienso es aspartico, y migra igual que el aspartico es porque debe serlo.
Pero estas técnicas ya no se usan, pero sirven para procesar y
aplicar lo que sabe, actualmente se usan identificadores para
aminoácidos, técnicas de cromatografía de alta presión, pero
son técnicas caras.
La cromatografía en columna se ocupa siempre, porque
tiene muchas variantes tecnológicas, y consiste en que
agregan la muestra arriba, ahí esta mi extracto, imagínense
que purifique a través de precipitación por saldo, resuspendi,
hice diálisis, tengo algo medianamente puro, pero quiero algo mas puro, al punto que este tan puro que
cristalice, y si cristaliza puedo hacer difracción de rayos X para que pueda conocer la estructura, y asi
vamos avanzando en el conocimiento de lo que estoy buscando. Entonces agrego la muestra arriba, y esta
es una columna que tiene un relleno que interactúa con la muestra, interactúa diferencialmente con las
moléculas dependiendo de su son mas grandes o mas chicas, mas cargadas o menos, mas hidrofobicas o
menos, o si tiene afinidad por algún anticuerpo, estas son todas las variantes que pueden tener una
cromatografia, así que esto es genérico. Esto interactua y dependiendo como interactúa, voy a ver si se va
resolviéndola muestra en distintos componentes, asi como se ve en la figura artificialmente en distintos
colores, significa que cada color es una proteina distinta.
Podría tener una separación mas dramatica, de tal manera que al final puedo diferencialmente aislar la
proteina C de la B y la A, y para lo que hago veo la concentracion de proteina versus volumen de elusión.
Cuando cae un ml estoy midiendo que el tubo de ensayo que tiene 1 ml, mientras mas a la derecha tengo
un goteo posterior o mas tardio que hacia la izquierda. Uno va colectando en distintos tubos, porque se
esta separando.
Eluir: es salir a través de un colector inferior de la columna, gotear, lo que escurre de la columna.
Entonces aquí tenemos el volumen,
primero sale la proteína A, después sale la
proteína B, ¿Pero cómo sé que la proteína A es
A y la B es B?, por que lo único que estoy
midiendo es concentración total de proteínas. La
concentración total de proteínas la pueden medir
a través de métodos químicos o bioquímicos,
como el método de Lowry, el método de
Bradford, unos se basan en el enlace peptídico,
qué se yo (O_o)….. Pero uno puede medir
proteínas aprovechando la propiedad de que los
aminoácidos aromáticos absorben a 280nm, y
como en general todas las proteínas tienen aminoácidos aromáticos, entonces van a absorber a 280nm, y
normalmente lo que obtenemos acá es una absorbancia de 280nm, o sea ultravioleta, versus volumen de
elusión. Si hay DNA estamos mal, ya que el DNA absorbe más o menos en el mismo rango, pero uno
podría pensar que a esa altura en que ya se ha precipitado, se hizo diálisis, la proteína está relativamente
pura y tengo pura proteína; uno podría hacer un test para ver si tengo DNA o no, y probablemente no lo
tenga.
¿Entonces qué deberíamos hacer?: ver actividad biológica, y si la enzima era proteolítica, o sea capaz de
romper proteínas, entonces lo que yo veo abajo es un test de actividad proteolítica, o sea veo cuánta
actividad enzimática para romper proteínas tiene versus volumen de elusión; si fuera un veneno de
serpiente y tiene un componente que es capaz de hidrolizar tejidos como la hialuronidasa, entonces yo
haría test para la hiarulonidasa, depende de lo que quiera observar lo que quiero determinar; si yo quiero
medir insulina, estoy aislando insulina, entonces haré un test biológico del efecto de la insulina en un ratón
y mediré el efecto de la insulina en el ratón, como baja la glicemia lo que estoy inyectando en el ratón,
esto sería un test biológico.
¿Realmente cuando uno hace el experimento (cromatografía en columna) cambia de color?: no, uno
solamente ve agua, no se ve nada, salvo que sea hemoglobina que sea coloreada o que quieras purificar un
pigmento como la clorofila, que no es proteína, y que es verde, se podría ver, pero en la realidad no se ve
absolutamente nada, es el espectrofotómetro el que dice cuál tiene mas proteína que otro y en qué tubo
está la proteína que te interesa.
Distintos tipos de cromatografía en columna
Esta la cromatografía de intercambio iónico
que utiliza una propiedad del soluto que es
la capacidad de adquirir ciertas cargas, la
ionización, el soluto sería la proteína, por
ejemplo. ¿Cuál es la fase de relleno de la
columna, denominada fase sólida, la matriz
que contiene moléculas que están cargadas,
grupos ionizados. ¿Cuál es el solvente? Un
buffer. ¿Por qué es importante usar un
buffer a un pH determinado?: para que no
se desnaturalice la proteína, así que uno
tiene que elegir muy bien el buffer cuando
está haciendo el ensayo, y la concentración
de sal también y todo eso...
Filtración en gel, otra técnica. ¿Qué usa la
cromatografía en gel? Tamaño y forma de la
proteína. Es un gel hidratado, el solvente
usualmente es agua.
La cromatografía de afinidad, se basa en la
afinidad por una molécula, está anclada a una
fase sólida, y que va a retener a la proteína
cuando esté próxima a ella, puede ser un
anticuerpo por ejemplo que se va a unir a la
proteína. ¿Cómo la retiene? Por que el
anticuerpo estaría pegado a la columna y cuando haces fluir la proteína se queda pegada en el anticuerpo.
¿Eso sería el ligando?: sí.
La última cromatografía que vamos a ver es la cromatografía de adsorción (adherencia, adhesión), que
utiliza la propiedad de adsorberse. La fase sólida absorbente es usualmente material inorgánico y el
solvente sería no polar. Un ejemplo de adsorción, el carbono es capaz de adsorber un sinnúmero de
partículas en suspensión, por eso las pastillas para evitar la intoxicación intestinal son pastillas de carbón,
que sería el mismo que ustedes obtendrían si hacen un pan tostado, lo carbonizan y se lo comen, es capaz
de depurar el solvente porque se adsorben las moléculas que son tóxicas, asi que tiene esa propiedad de
purificar el medio.
Entonces, veamos primero la cromatografía de intercambio iónico.
¿Y como funciona? Ustedes tienen una columna que tiene partículas, que aquí están exageradas, estas
partículas son microscópicas y tienen una carga pegada, como en el caso de estas partículas que tienen
carga negativa y por lo tanto ¿Qué tipo de moléculas se van a quedar pegadas en la columna?: las de
carga positiva que se representan en rojo. Se agrega de todo a la columna, moléculas positivas, de carga
neta negativa, de mucha carga positiva y mucha carga negativa. Cuando agrego eso y veo cómo migra,
observo que las primeras que salen son muy negativas, ya que tienen poca afinidad con la columna, la que
es de carga negativa. Cuando sigue escurriendo el buffer, lo que yo obtengo en los tubos sucesivos, por
que esos tubos automáticamente se van cambiando, las moléculas que eran más afín. Ahora las que se
quedaron pegadas no van a salir simplemente. Las moléculas con carga neta negativa (no las de mayor
carga negativa, sino simplemente negativa) van a salir después de las que tenían la mayor carga neta
negativa, pero se van a quedar pegadas todas las positivas, y ahí viene el problema. ¿Cómo hago para
sacar todas aquellas que se quedaron pegadas pero que tienen afinidad diferenciada? No se puede cambiar
la carga de la columna por que pierde la afinidad por todas, van a salir las positivas y las muy positivas.
Variamos el pH, supongan que las que quedan pegadas, quedan ahí porque son positivas, por que hay
cadenas laterales de aminoácidos que están positivos. ¿Qué pasa si yo cambio el pH y tengo un pK?:
cambio el estado de ionización del grupo ácido, lo puedo hacer pasar de neutro a negativo en los
aminoácidos ácidos, o lo puedo hacer pasar de positivo a neutro en los aminoácidos básicos. ¿Cuáles son
los ácidos?: glutámico y aspártico. Y, ¿Cuáles son los básicos?: histidina, lisina y arginina.
Si yo cambio el pH cambio el estado de ionización de los grupos ionizables, y eso va a depender del pH y
del pK, y eso ustedes DEBERIAN saberlo o habérselo cuestionado.. si pH es mayor que pK este grupo se
disoció, si pH es menor que pK el protón está en el grupo, y si pH es igual a pK es mitad y mitad, es
situación de buffer. ¿Entonces qué vamos a hacer?: vamos a cambiar los pH de tal manera que primero se
vea afectado un grupo ionizable o un conjunto de grupos ionizables de una molécula y después los de la
otra molécula. En buenas cuentas cada molécula va a tener un valor de pH al cual va a tener carga neta 0,
el que se llama punto isoeléctrico, entonces si el pH es menor que todos los puntos isoeléctricos, ¿Cómo
están ambas moléculas?: positivas, por que con cada valor de pH igual al punto isoeléctrico están neutras,
y si el pH es menor, tienen un protón que las saca de la neutralidad, por lo que están positivas. ¿Qué pasa
si el pH está entre los dos puntos isoeléctricos?: una molécula es positiva y la otra es negativa. Y, ¿Qué
pasa si el pH es mayor que los dos puntos isoeléctricos?: ambas son negativas porque estoy aumentando el
pH del medio por sobre los puntos isoeléctricos y por lo tanto las cargas son negativas porque perdieron
protones. Así que si yo jugara, y aquí lo que queremos hacer es que las moléculas menos positivas dejen
de serlo... ¿Las menos positivas van a tener un punto isoeléctrico mayor o menor?: menor, así al aumentar
gradualmente el pH la menos positiva se vuelve negativa y se desprende de la columna. Se queda pegada
la molécula muy positiva. No se puede subir el pH por sobre los dos puntos isoeléctricos por que las
obtendría juntas, así que se sube gradualmente.
Esto se puede hacer en vez de pH, con sal, de tal manera que subo la concentración de NaCl u otra sal,
para afectar la unión entre la proteína y la columna y se despega, si la subo más se despegan las más
resistentes. Pero también se hace con pH, y en la guía ustedes van a ver problemas con pH. Esta técnica,
se ocupa, está vigente.
¿Cómo es la matriz de intercambio iónico?, puede ser de poliestireno entrecruzada con divinilbenceno.
Lo importante
cargas.
pueden ser de
es que estas matrices tienen pegadas
Entonces ustedes tienen columnas que
resinas diferentes a las que les dije
anteriormente de un material fibroso
como la celulosa y sobre ella pueden
unirse algunos grupos ionizables,
grupos carboxílicos que se pueden deprotonar,
grupos amino que se pueden deprotonar. Estos
pasan a configuración negativa, estos pasan a estado
neutro, de positivo a neutro. Y tienen nombre, la
que tiene grupo carboxílico y es de celulosa se
llama carboximetilcelulosa, y estas tienen cargas
netas negativas, por que uno prepara la columna a
un pH tal que este ionizada. Y la otra es la
dietilaminoetilcelulosa, que se abrevia DEAE-
celulosa, y que el pK es 9.5. ¿A qué pH esta ionizada la carboximetil si el pK es 3.5?: mayor que 3.5, así
que esta columna tiene que estar preparada a un pH mayor que 3.5.
Cómo es la matriz. La matriz de este cambio iónico, puede ser de poliestireno, estas moléculas que están
acá, entre cruzadas con dimetilbenceno que es lo que tienen ahí. Se compra, para que se queden
tranquilos: uno se gana un proyecto, agarra un catálogo, intercambio iónico, quiero tal columna y se
compra, pero hay que saber cómo funciona. Lo importante es que esas matrices tienen pegadas cargas,
como les decía. Entonces, ustedes tienen columnas que pueden ser una resina diferente a las que les dije
anteriormente, de un material fibroso como la celulosa y sobre ella pueden unirse algunos grupos
ionizables, cómo cuáles: grupos carboxílicos que se pueden deprotonar, grupos amino que se pueden
deprotonar. Estos pasan a configuración negativa, estos pasan a estado neutro, de positivo a neutro… y
tienen nombre: la que tienen el grupo carboxílico y es de celulosa, se llama carboximetilcelulosa y estas
tienen cargas netas negativas, porque uno prepara la columna a un pH tal que sea ionizada; la otra es la
dietilaminoetilcelulosa que se abrevia DEAE-celulosa y que el pKa es 9,5.
Ejercicio, a qué pH está ionizada la carboximetil si el pKa es 3,5… mayor o menor que 3,5: mayor que
3,5, ahí va a estar ionizada, así que esa columna debe estar preparada a un pH mayor que 3,5. Y la otra:
9,5 si es menor que 9,5 ¿qué carga va a tener la columna? Esta es la columna: aquí está positiva protonada,
neutra deprotonada. El pKa es 9,5 y el pH es 7,0 ¿qué carga tiene esta columna? Positiva.
Así que ustedes tendrán columnas, como la dietilaminoetil, que son positivas y ahí intercambian
aniones… porque tiene su ión anulando la carga, puede ser cloruro, sodio, dependiendo de la columna y
ese ión se va a intercambiar por la molécula (…), por ejemplo: la dietilaminoetil tiene grupos aminos
positivos, pero puede tener cloruro contraponiendo sus cargas; cloruro es solvente, está disuelto en el
solvente ¿qué va a suceder? Cuando agregue una proteína negativa, va a desplazar al cloruro y se va a unir
a la dietilaminoetil, que es positiva. Y esta columna, intercambio un cloruro por una proteína negativa, y
por lo tanto es un intercambiador de cargas negativas, sería un intercambiador aniónico. La carboximetil,
es negativa por los grupos carboxílicos, los que están neutralizados por sodio que está disuelto en el
solvente; cuando paso una proteína positiva, el sodio
se va a intercambiar por la proteína positiva: es un
intercambiador catiónico. Por lo tanto, habrá
intercambiadores aniónicos e intercambiadores
catiónicos.
Veamos otro tipo de cromatografía, que es la
cromatografía de exclusión. Esta cromatografía
separa por tamaño, que es natural, hasta ahora no
habíamos pensado en el tamaño, sólo habíamos
pensado en la carga de las proteínas. Entonces
imagínense que hay proteínas que tienen la
misma carga y siempre van a salir en la
cromatografía de intercambio iónico próxima,
va a costar obtenerlas en tubos separados
porque son muy parecidas, entonces miro otra
propiedad: el tamaño. Ya que, que tengan la
misma carga y el mismo tamaño, es como
mucha la mala suerte, pero sucede. Entonces
vamos a separar por tamaño. Así que
exageramos las partículas, y estas partículas
están entrelazadas y son hidratadas y ahí el
agua está como en pañal de guagua: está
quieta  el agua hidrata el gel del pañal de
guagua, es decir, el agua es el gel junto con la
resina que tiene, no está fluida, está como en un estado de gelatina, porque hay tantas moléculas que
hidratar que el agua está más quieta que en medio acuoso ¿me entienden? Hay demasiado estorbo
molecular: no es lo mismo tener moléculas de agua fluyendo entre sí, que obligarlas a interactuar con una
matriz porque las moléculas de agua van a estar más quietas, pierden su libertad. Entonces, aquí tenemos
un estado de gel y esta es una partícula en la cromatografía de exlusión, uno agrega una mezcla de
proteínas de distinto tamaño y va viendo la elusión de las proteínas conectándola a distintos tubos. Vamos
a mirar actividad y concentración de proteínas, igual que antes, pero qué va a suceder ¿cuáles creen que
llegan primero abajo? Antes les digo una cosa: las partículas de gel, entre sí, establecen ciertos espacios
de solvente porque hay lugares en los que las partículas no se tocan, como bolitas de ping pong, hay
espacio por donde puede fluir el solvente libremente, pero al interior de la partícula que aquí está
exagerada, hay gel. ¿Cuáles llegan primero? Y si me dicen cuáles, díganme por qué ¿las grandes o las
chicas llegan primero abajo? Grandes ¿por qué? Las grandes se distraen menos, porque las chicas se van a
meter al interior de la matriz. Significa que la grande es capaz de sortear todas las bolitas de ping pong y
es capaz de pasar a través de los espacios, y las chicas se distraen. Y si yo les dijera que las chicas, como
tienen acceso por tamaño a todos los lugares, no deberían ver columnas, por lo tanto las chicas deberían
llegar rápido, porque tienen acceso a todos los lugares: es como que para ellas no hay resina. Yo haría casi
una apuesta de, a quien le preguntasen de cromatografía de exclusión, va a decir que las chicas se demoran
porque se distraen porque tienen más espacio, pero eso nunca a mí me cuadró, porque si las chicas tienen
acceso a todos los lugares, deben fluir como si no hubiera resina: lo que sucede es que las chicas se meten
al entramado de las partículas y ahí hay gel y ahí fluye más lento, porque el agua está gelificada, por lo
tanto no hay movimiento browniano como si estuviera líquida, así es que como que ahí se sienta a
descansar: la partícula entra, se atrapa y descansa. Se sienta más veces en la silla que la grande porque
tiene acceso a la silla, que son las partículas de gel que están ahí.
Así que salen primero las grandes, salen después las chicas.
Si son más garbees ¿no deberían también ser atrapadas por esta porosidad?
Es que las grandes no entran a los poros de la partícula, pasan por los intersticios, que son los espacios que
habría entre las pelotas de ping pong, Ahora, habrá algunas partículas que como que entran y no entran y
esas son las que salen entre las últimas y las primeras. Hay algunas que entran en algún porcentaje.
Así que aquí veamos concentración de proteínas. Hay una absorción de luz de 280 nm versus los tubos de
ensayo que vamos colectando: 0 mL, 50 mL si ustedes quieren; A, B, D, C. Imagínense la sensación de
estar haciendo este experimento, de ser el que obtiene una proteína por primera vez, y ver dónde les sale,
en realidad es fascinante el hecho de que ustedes se
están enfrentando a algo que nunca nadie ha hecho. Si
ustedes quieren obtener la proteína y están midiendo
actividad biológica en estos de ensayo, y se
encuentran que obtienen, pero no de actividad
biológica sino que de concentraciones solamente: A,
B, D, C ¿cuál es más grande? ¿la A, la B, la D o la C?
la A es más grande porque sale primero, la más chica
es la C y después sale la B y la D. Si hay una que
cabe completamente en el poro, por ejemplo la C,
imagínense que la F es más chica que la C ¿dónde va
a salir la F? cae junto con la C, porque la C es más
chica y que entre, no tiene diferencia con las que son
más chicas y también entran, así que salen juntas. Y las que son grandes y no entran, no tienen diferencia
con las que son más grandes y no entran también, así que saldrían antes… y si es una más grande que la
A, y la A no cabe en los poros, entonces van a salir juntas. Lo que tiene que hacer el bioquímico es
seleccionar otro gel con un rango de poro determinado para separar estas proteínas que salen juntas,
porque son más grandes que el diámetro de poro que ustedes eligieron: ensayo y error.
¿Cuál es la cromatografía de
misma técnica: un tubo, la
el gel abajo, si ustedes quieren
proteína de interés que está en
ligando, pero e también está
partícula de resina que tienen ahí,
rellenando la columna. Por
imagínense que es la enzima
acetilcolinesterasa, útil en la
neuromotora, en la placa
¿cierto? Y yo quiero aislarla,
el
ssutrato
y
lo
pego
a la resina (se compra, alguien ya
afinidad?
La
muestra arriba,
obtener
la
rojo, agregan un
agregado a la
que
está
ejemplo:
sinapsis
neuromotora
entonces agarro
covalentemente
lo hizo y lo
vende). Entonces, por lo tanto, está la resina con el sustrato, la enzima se va a pegar al sustrato y por lo
tanto agrego la muestra que tiene de todo, porque hice puré el tejido neuronal y va todo ahí, pero la
acetilcolinesterasa se va a pegar sobre la acetilcolina que está unida a la resina. ¿Cómo la despego
inteligentemente? Agregas sustrato: agrego sustrato suelto para que compita, con el sustrato unido a la
resina, por la enzima. Entonces, si agrego acetilcolina, la acetilcolinesterasa se a distraer uniéndose a ese
sustrato y va a fluir con este sustrato y ya no va a estar pegada a la resina. Si quiero una proteína rara, que
no es enzima y necesito de alguna manera tenerla más pura y la tengo medianamente pura: la tomo, la
inyecto a un conejo, espero que el conejo genere anticuerpos, aíslo los anticuerpos del conejo, pego los
anticuerpos del conejo a la resina, agrego la proteína medianamente pura sobre la columna y se me pega
mucho más que las demás proteínas que son contaminantes y tengo la proteína ya no medianamente pura,
sino que muy pura. Esa es una tesis de doctorado por lo menos, pero así de simple el protocolo, requiere
de mucho trabajo, pero se hace.
La otra técnica que es importante, es la técnica de electroforesis, que no utiliza el tamaño de la proteína…
no, no he dicho nada. Utiliza la carga de la
molécula a separar y muchas veces la carga en
relación con el tamaño, porque hay una relación
carga-tamaño. La electroforesis se puede realizar en
gel de agarosa, generalmente se utiliza para separar
DNA; la electroforesis en gel de poliacrilamida, se
utiliza para separar proteínas; electroforesis en
poliacrilamida, pero con un agente que se llama
SDS, ese agente lo que hace es denaturar la
proteína. Y hay una electroforesis muy elegante que
se llama desfocalización isoeléctrica, que es la que
vamos a ver al final. ¿Cuáles son las propiedades
que tiene el soluto para cada una de ellas? Las
vamos a ir viendo a medida que veamos las técnicas una a una: una es carga eléctrica, carga eléctrica,
tamaño y carga, la última. Y cuáles son las fases sólidas: tres soportes inertes, en el caso de las tres
primeras tiene una cierta porosidad y el solvente siempre es un amortiguador, un buffer, con agua.
La electroforesis, que la van a hacer en el laboratorio: ustedes agregan en el gel, en unos bolsillitos que
forman, unos moldes especiales, la muestra con la micropipeta y pueden ver como migra cuando someten
a un campo eléctrico esa muestra. Acá tenemos el polo positivo que se llama ánodo, y acá el polo negativo
que se llama cátodo, porque uno atrae aniones y el otro cationes, no se confundan con el nombre. La
movilidad electroforética de una
molécula es la
razón que hay entre la velocidad que
ésta logra en
el gel y la diferencia de potencial que
hubo
que
aplicar, esa es la movilidad
electroforética. Y se puede demostrar
teóricamente
que es la carga partido por un
coeficiente
propio de la molécula: coeficiente de
roce.
Ahí tienen un ejemplo de un gel que
ya
fue
revelado y sostiene las marcas de
proteinas que
ustedes pueden teñir con […] que
puede marcar
aminoácidos y no al gel. Ustedes ven,
en
una
primera etapa de purificación ustedes
obtienen todas
estas muestras, en una segunda todas
estas,
estas,
estas, estas y las de acá. Y acá, si se
dan
cuenta,
cuando está proteína pura, en este
caso,
una
RNApolimerasa
¿qué
hace
la
RNApolimerasa? Sintetiza RNA a partir de DNA. Entonces aquí al final obtenemos una banda, otra
banda: dos bandas y es que esta RNApolimerasa tiene subunidades: una, otra y las dos asociadas.
[pregunta de la Aguayo]
A ver, déjame ver si te respondo la pregunta con lo
que voy a decir: cuando uno pone una muestra
arriba y las partículas tienen carga positiva, los que
tengan mayor movilidad electroforética en relación
a los positivos, o sea, en relación a los negativos,
van a llegar más lejos, porque abajo está el
positivos y arriba está el negativo; pero si yo,
además, quiero separar sólo por tamaño, entonces
voy a pintar de cargas negativas a todas las
proteínas, para separar sólo por tamaño. Y la manera
de pintarlas con carga neta negativa es agregar un
compuesto que es el SDS, y ese compuesto, significa,
de la abreviación al castellano: dodecil sulfato de
sodio, y este que está acá para los amigos: SDS.
Fíjense que tiene una carga, una cabeza cargada y una
cola hidrofóbica porque aquí tenemos once carbonos.
Esta cola
hidrofóbica se
va
a
insertar en la
porción hidrofóbica de las proteínas y todas las proteínas
tienen
aminoácidos hidrofóbicos en alguna parte, la mayoría, esto es
en
general.
Entonces se va a incrustar en la porción hidrofóbica, y si la
porción
hidrofóbica va hacia adentro, lo que es natural, va a dar
vuelta
la
proteína, como quien mete la mano a un calcetín y lo tira
para afuera: va a
desnaturalizar la proteína. Estas proteínas están todas
desnaturalizadas, y la carga negativa queda mirando hacia el
solvente,
es
decir, van a estar todas estar cargas negativas de sulfato
mirando hacia el
solvente. Y caben tantas moléculas de SDS en la proteína por
igual que en
distintas proteínas por centímetro cuadrado. Todas van a
tener la misma
relación carga-tamaño, así que ya no separa más por
movilidad
electroforética en el sentido de carga-tamaño, sino que separa
solamente por
tamaño, porque todas tienen el barniz de SDS que les
confiere
la
misma carga: algunas más negativas porque eran más
grandes y otras
menos negativas porque son moléculas más chicas, admiten menos moléculas de SDS. Entonces cuando
tienen SDS las moléculas, la carga ya no es motivo para la separación porque todas tienen el mismo
atributo: muchas cargas negativas, lo que permite que se separen es el tamaño y el gel de poliacrilamida es
entrecruzado, es así, así que ¿cuáles van a llegar más lejos, las chicas o las grandes? Las chicas; y en la
cromatografía de exclusión ¿cuáles llegaban más lejos? Las grandes. No hay contradicción porque aquí no
hay partículas hidratadas ni con intersticios entre partículas hidratadas, aquí tenemos una trama de gel que
es el gel de poliacrilamida que es un entrecruzado covalente y las más chicas pasan, las más grandes se
quedan, por lo tanto, las más chicas son las de acá, al final, las más grandes son las que están acá arriba…
¿te contesto con eso la duda? Las más chicas son las que llegan más abajo, migran más rápido.
¿Qué podemos decir? Bendita técnica, porque permite separar de una manera con mucha resolución
proteínas que normalmente no eran separadas por otra técnica, la cromatografía en gel de poliacrilamida.
¿Puedo separar DNA a través de esta técnica? no se usa, porque el SDS no se va a pegar al DNA, por gel
de agarosa separo DNA, como les decía en la tabla.
¿Qué sucede, ahora, en el ejemplo que tenemos ahí?
Ya, seguimos la próxima clase.
Vamos a ver un detalle: cómo depende el tamaño de la proteína, cómo depende la migración respecto del
tamaño de la proteína… y nos queda esta diapositiva y quizás este gráfico… o lo vemos ahora.
Veámoslo al tiro, si no queda nada.
Ahí ustedes tienen un gel de cromatografía de
electroforesis con poliacrilamida que es con SDS, y lo
que ven ustedes es que la miosina, que es la proteína del
músculo, se queda arriba porque es muy grande, tiene
200.000 daltons ¿cuántos aminoácidos tiene? Dos mil.
Entonces lo que podemos ver, es que llegan primero estas
y las otras se van quedando atrasadas. Entonces, lo que
podríamos hacer es graficar la migración de estas
moléculas respecto del logaritmo del peso molecular, y
por qué el logaritmo: porque varía tanto, como ya lo
vieron, que es mejor trabajar con el exponente. Grafican
ustedes esto y da una línea recta, lo que permitiría, si yo tengo una molécula desconocida y sé la
migración, yo grafico la migración, intercepto, interpolo y obtengo el peso molecular de la proteína.
Entonces uno podría interpolar en este caso.
La migración relativa es porque uno divide la migración de la más grande, la usa para dividir las
migraciones de las otras, para obtener una relación entre 0 y 1, por eso, la que migra más lejos es ésta.
Estas las compro y trabajo con la desconocida.
Entonces, hay otra técnica, que es la que utiliza el punto
isoeléctrico de las proteínas y ustedes ven que hay
proteínas que tienen cada un punto isoeléctrico diferente. Si
yo agrego esas proteínas en un gel y realizo una
electroforesis a un pH determinado, agrego la proteína,
establezco el campo eléctrico: voy a obtenerlas separas,
como aparece ahí. Pero lo que deberíamos pensar acá es
que la muestra está a un pH determinado, pero la verdad es
que el gel tiene un gradiente de pH, o sea que deberíamos
pensar que aquí está de un mayor pH a un menor pH.
¿Dónde van a detenerse las proteínas? Cuando la carga neta
sea cero: cuando la carga neta es cero, hasta ahí no más
llegó la migración. Así que la banda de allá es con carga
neta cero.
Entre pH 9 y 3 tú no vas a tener desnaturalización de las proteínas, pero para el caso, tú haces el estudio
previo.
Después tú tomas el gel que tiene
todas
las
proteínas en banda, lo das vuelta y
haces
una
electroforesis convencional y tiñes, y
esta
electroforesis es con SDS y separas
por
tamaño
¿qué obtuve? Fíjense que toda esta
banda se me
resuelve en todas estas manchas, esta
banda se separó
en todas estas manchas, separé por
tamaño,
es
decir, había muchas proteínas con el
mismo
punto
isoeléctrico y que estaban saliendo
juntas,
pero
como ahora hago una electroforesis
con SDS, separo
por tamaño y por lo tanto, separo las
de
menor
tamaño con las de mayor tamaño y me
queda arriba y
lo que obtengo es esto. Y esto, hay
programas
computacionales que lo interpretan y que les pueden decir la anomalía en una o dos manchitas y detectan
una patología en el laboratorio clínico. Esto es proteómica, ahora
uno puede hacer la proteómica también identificando algunos
RNAm con unos chips especiales y veís cuánto RNAm estay
sintetizando. Pero uno puede hacer esto y lo que estás determinando
es la proteómica: es decir, qué proteínas se están expresando en ese
tejido y saber si hay alguna que está ausente o alguna presente que
no debería estar. La genómica, les dije que era la Edad de Piedra, en
eso estamos, en la genómica.
En todo proceso de purificación interesa el grado de purificación y rendimiento, y cómo los estimamos:
esta es la muestra inicial, esta es la muestra definitiva, nos interesan las bolitas rojas ¿dónde hay más
bolitas rojas? Acá ¿dónde están más puras las bolitas rojas? Allá. Aquí habría un caso donde sacrificamos
rendimiento por purificación. Por lo tanto, lo que nosotros queremos es que la proteína esté rodeada de
proteínas iguales y saquemos las impurezas, eso significa deshacernos, en el transcurso de la purificación,
de la proteína, y eso es lo que no queremos, pero a veces es inevitable. Así que allá tenemos purificación
lograda, pero con un rendimiento que se ha sacrificado en cuanto a la proteína, pero para estudiarla es
fabuloso, lo ideal es tenerla pura, y la etapa más eficiente de la purificación es la de focalización
isoeléctrica, que ustedes vieron denante, combinada con la electroforesis de SDS, y a ambas juntas se le
llama “electroforesis bidimensional”. Así que ustedes tienen tablas como estas, donde aparece la etapa de
purificación, cuánto volumen mantiene, cuánta proteína total mantiene, cuánta actividad mantiene y cuál
es la actividad específica, y eso se los voy a explicar.
En el caso de la alcayota, por ejemplo: teníamos diez mil miligramos, cuánta actividad: cien mil unidades;
después, precipito en el sulfato de amonio, tengo 3000 miligramos, cuánta actividad: 96 mil unidades de
actividad, qué obtengo: actividad específica de 32. Qué es la actividad específica: unidades dividido por
miligramos. Mientras más
actividad tenga,
la que sea, significa que está
más puro ahí,
así que nosotros vamos a
obtener, en las
etapas sucesivas, después del
intercambio
iónico, cromatografía, etcétera,
obtenemos
mayor actividad específica, o
sea que está más
pura, y el rendimiento cuál
sería si tenemos
45.000 unidades y teníamos
100.000 ¿cuál
sería el rendimiento? Un 45%,
porque de 100,
obtuve
45
unidades
de
actividad… la
que sea, invéntese. Pero cuál es
la purificación si
tenía 10 por gramo y ahora
tengo 15 por
gramo, 15.000 por gramo…
dividan: 1.500
veces más pura. En cambio al
pasar
del
extracto puro a la precipitación por sulfato ¿cuántas veces se purificó? 3,2 veces simplemente. Así que una
cosa es cuántas veces se purificó y otra es el rendimiento, y eso es importante que ustedes lo puedan
entender.