PURIFICACIÓN DE LA LECTINA DE FRIJOL TÉPARI Phaseolus acutifolius Y DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD AGLUTINANTE. López Martínez F.J. (1); Blanco Labra A. (2); García Gasca T. (1). (1)Facultad de Ciencias Naturales, Licenciatura en Biología. Universidad Autónoma de Querétaro. (2) Centro de Investigación de Estudios Avanzados del IPN. CINVESTAV Irapuato. RESUMEN. Se realizó la purificación de la proteína Lectina del frijol Tépari mediante técnicas de intercambio iónico, debido a que extractos, de muestras anteriores, presentaban otro tipo de proteínas que no correspondían con las características de las lectinas, las cuales podrían estar interfiriendo con la capacidad aglutinante de las lectinas sobre eritrocitos de conejo, forma en la que se mide su actividad específica y así determinar las unidades aglutinantes por miligramo de proteína. Se llevó a cabo todo el proceso de molienda y extracción de la harina, así como la precipitación de la proteína por medio de Sulfato de amonio y se ingresó a una columna de exclusión molecular de sephadex G75. Se llevaron a cabo diferentes variantes en las técnicas de intercambio iónico modificando el tiempo y el gradiente de NaCl en un equipo colector de fracciones. Los resultados que se obtuvieron fueron satisfactorios ya que se determinó una considerable actividad aglutinante en fracciones que presentaban una baja concentración de proteína, lo que nos indica que la lectina se encuentra parcialmente pura. INTRODUCCIÓN. El frijol tépari (Phaseolus acutifolius) es una leguminosa comestible adaptada a condiciones áridas y semiáridas y es muy resistente a condiciones agronómicas adversas como son las altas concentraciones de sales, poca agua, además presenta gran tolerancia a plagas de insectos y microorganismos y a diversas enfermedades que normalmente afectan al frijol común (Thomas y Waines , 1984). Las lectinas son proteínas de origen no inmunológico que interactúan con carbohidratos libres o enlazados a membranas celulares (Sharon y Lis, 1972), dichas proteínas tienen la capacidad de aglutinar células, especialmente eritrocitos. Una de las funciones de las lectinas en las plantas es la defensa contra depredadores y patógenos debido a que presentan efectos antifisiológicos como una disminución en la digestibilidad y absorción de nitrógeno y carbohidratos (Rea y col., 1985). Por otro lado las lectinas son una herramienta importante para la investigación estructural y funcional de carbohidratos complejos, para la evaluación de cambios que ocurren en la superficie celular durante los procesos fisiológicos y patológicos y para la identificación de células de cáncer y se ha demostrado que las lectinas poseen propiedades citostáticas y citotóxicas en contra de células tumorales y ciertas lectinas reaccionan con ciertas células transformadas malignas, pero no con aquellas normales (García, 2002). Las semillas de las plantas, en especial del frijol tépari, son ricas en lectinas (Scheerens y col, 1983) y estudios previos han demostrado que las lectinas de diferentes fuentes y a diferentes concentraciones inhiben el crecimiento de células cancerígenas e inducen apoptosis. Razón por la cual el objetivo del trabajo es obtener una fracción pura de la lectina y determinar su actividad aglutinante para estudios posteriores de proliferación y sobrevivencia de células cancerígenas. 1 MATERIALES Y MÉTODOS. Se maceró el frijol tépari y la harina obtenida se disolvió en agua desionizada y se mantuvo en agitación magnética por 12 hrs. después se centrifugó a 14, 000 rpm. durante 30 min. y al sobrenadante se le agregó sulfato de amonio para precipitar la proteína. Se volvió a centrifugar a la misma velocidad y tiempo y ahora se tomó el precipitado y se redisolvió con la menor cantidad de agua desionizada posible para después someterlo a una dialización. Se obtuvo una cantidad de 8 ml. que se llevaron a un concentrador de muestra por medio de gas helio a presión, en donde se obtuvieron 4 ml. mismos que se llevaron a una columna de exclusión molecular de Sephadex G75, las fracciones colectadas se leyeron en un espectrofotómetro para detectar las proteínas y se determinó su actividad hemaglutinante sobre eritrocitos de conejo en placas de Elisa de 96 pozos. Calculando la Actividad específica se seleccionaron las fracciones que presentaron mayor actividad y se juntaron para ingresarlas a una cromatografía de intercambio iónico. Para ésta técnica se empleó un equipo colector de fracciones ECONO SYSTEM de Biorad ingresando 1 mg/ml de muestra y se establecieron diferentes tiempos y concentraciones del gradiente. Se leyeron las fracciones y se determinó su actividad específica para finalmente observar el grado de pureza en un gel de poliacrilamida. DISCUSIÓN DE RESULTADOS. De la exclusión molecular G75 se ingresó una muestra A a la columna de intercambio iónico estableciendo un tiempo de 126 min. y un gradiente de NaCl de 0 a 0.5 M de Tris pH 8 en fracciones de 2ml a velocidad de 1ml/min y posteriormente se ingresó una muestra B con un tiempo de140 min, se leyó la cantidad de proteína a 280 nm y se determinó su actividad aglutinante(Figura 1). Las dos muestras presentaron una buena separación de las fracciones con actividad del resto de proteínas que no la tenía. FIGURA 1. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA Y ACTIVIDAD ESPECÍFICA MUESTRAS A Y B. 1400 3.5 1200 3 1000 2.5 800 2 600 1.5 400 1 200 0.5 0 0 1 6 11 16 21 2 31 3 41 4 51 56 61 6 2.5 4 Abs 280 nm Muestra A 1600 Proteína (Abs 280 nm) Actividad Específica ( U/mg) 4.5 3500 Muestra B 3000 2500 2 2000 1.5 1500 1 1000 0.5 Actividad U/mg 3 1800 500 0 0 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 Fracciones Fracciones Nota: El color morado representa las proteínas detectadas a 280 nm y el color amarillo sólo las que tienen actividad aglutinante. La línea punteada es el gradiente de NaCl. Se puede observar que la muestra B tiene una mejor separación de la lectina del resto de las proteínas que no tienen actividad aglutinante. 2 Se obtuvo otra muestra de G75 marcada como C y se ingresó a la cromatografía de intercambio iónico pero modificando nuevamente las condiciones de tiempo y gradiente, estableciéndose 170 min. comenzando con el gradiente a los 140 min. y colectando fracciones de 2ml a velocidad de 1 ml/min. de la gráfica obtenida se pudo observar una mejorable separación de las fracciones que presentaban actividad aglutinante del resto de las proteína que ahora se leyó a 220 nm porque a ésta longitud se detectaban todas las proteínas de la muestra. Para comprobar la pureza de la muestra C se corrió un gel de poliacrilamida con las tres muestras A, B y C (Figura 2) ingresando las mismas cantidades para las muestras y se apreció una parcial purificación de la lectina de la muestra C. FIGURA 2. DETERMINACION DE PROTEÍNA Y ACTIVIDAD DE LAS MUESTRA C Y OBSERVACIÓN DE LA PUREZA EN GEL DE POLIACRILAMIDA. 3.5 Muestra C 1800 Absorbancia a 220 nm 1400 2.5 1200 2 1000 800 1.5 600 1 400 0.5 200 0 Actividad Específica U/mg 1600 3 Lectina 0 1 6 11 16 21 2 31 3 41 4 51 56 61 6 71 76 81 Fracciones Nota: La gráfica de la muestra C presenta la determinación de las proteínas a 220 nm en color morado y en color amarillo las proteínas con actividad aglutinante. El gradiente de NaCl se presenta en línea punteada. El gel de poliacrilamida permite ver el grado de pureza de la lectina de la muestra C en donde se aprecia una banda definida en comparación con el resto de las muestra A y B que tienen otras bandas que representan proteínas sin actividad aglutinante. Para observar la pérdida de la actividad de las fracciones colectadas de exclusión molecular G75 se midió su actividad específica antes de ingresar las muestras A, B y C a la cromatografía de intercambio iónico y se determinó una actividad de 5020 U/mg de proteína. Después de ser ingresadas las muestras a intercambio iónico se cuantificó la proteína total utilizando un lector múltiple de placas, se obtuvo que la muestra A contenía 833.4022 g/ml de proteína y la fracción con mayor actividad específica era de 1606.27 U/mg. En total la muestra A presentaba una actividad específica de 4743 U/mg. Para la muestra B su proteína total era de 788 g/ml y su fracción con mayor actividad específica era de 1606.27 U/mg, dando una actividad específica total de 3900 U/mg de proteína. En contraste con las muestras A y B, la fracción con mayor actividad de la muestra C era de 1606.27 U/mg de proteína y la actividad específica total de las fracciones para esta muestra fue de 3422.668 U/ mg. Pero al leer la cantidad total de proteína en el multilector de placas se observó una pequeña cantidad de 176.1241 g/ml, lo cual sugiere que la lectina se encuentra parcialmente pura y mantiene una buena actividad específica con sólo un 30% de pérdida. 3 CONCLUSIONES. La purificación parcial de la lectina se obtuvo en cromatografía de intercambio iónico con las condiciones de un gradiente de NaCl de 0 a 0.4 M de Tris pH 8 al minuto 140 en un tiempo total de corrida de 170 min. a velocidad de 1 ml/min. en fracciones de 2 ml. La lectina detectada en la banda del gel de electroforesis tiene un peso molecular de 34 Kilodaltones obtenido en base a cálculos de los marcadores de bajo peso molecular que se colocaron en las orillas. La actividad total que presentó la lectina parcialmente pura tiene una pérdida del 30% de actividad, comparada con la muestra sin ingresar a intercambio iónico, debido a que no se colectaron las fracciones de muy baja actividad específica y con alta medición de absorbancia para mantener la fracción de lectina lo más pura posible. Mediante la obtención de la lectina parcialmente pura se podrán hacer estudios sobre sus efectos citostáticos y citotóxicos sobre células tumorales y tener así una herramienta importante en la investigación estructural y funcional de carbohidratos complejos observando sus cambios en procesos fisiológicos y patológicos en la superficie celular. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. García-Gasca, M.T. de J. “Efectos Biológicos de una Fracción Proteínica de Frijol Tépari con actividad Antiproteolítica y Citoaglutinante Sobre Fibroblastos Murinos Transformados.” Tesis doctoral, Fac. Química, Posgrado en Alimentos del Centro de la República (PROPAC). Santiago de Querétaro, Qro. 1-3 pp. 2002. Rea, R.L., Thompson, L.U., David, J.A. y Jenkins, D.M. “Lectins in foods and their relation to search digestibility”, Nutr. Res. 5: 919 – 929. 1985. Scheerens, J.C., Tinsley, A.M., Abbas, I.R., Weber, C.W. y Berry, J.W. “The nutritional significance of tepary bean consumption”, Desert Plants 5: 11. 1983. Sharon, N. y Lis, H. “Lectins: cell-agglutinating and sugar-specific proteins”, Science 177, 949 – 959. 1972. Thomas, C.V. y Waines, J.G. “ Fertile backcross and allotetraploid plant from crosses between tepary beans and common beans”, J. Hered. 75: 93 – 98. 1984. 4