ELENA GARRIDO BIOQUÍMICA 5

ELENA GARRIDO
5
7 HOJAS
)
LEHNINGER . ANDERSON
BIOQUÍMICA
( J.E.Feliu
Enzimas en el plasma
 INTRODUCCIÓN
Los enzimas son biocatalizadores que aceleran las reacciones del organismo.
Tienen un gran poder catalítico, con frecuencia muy superior al de los catalizadores sintéticos. Posee
un alto grado de especificidad respecto a sus sustratos, aceleran las reacciones químicas del orden de 106 1012 veces sin alterar el equilibrio de la reacción, y funcionan en soluciones acuosas en condiciones muy
suaves de temperatura y pH. Los enzimas no se alteran ni se consumen en las reacciones en las que
intervienen ; se requieren en cantidades muy pequeñas del rango de concentraciones M.
Los enzimas constituyen una de las claves para conocer el modo de sobrevivir y proliferar las
células. Actuando en secuencias organizadas catalizan cientos de reacciones consecutivas en las rutas
metabólicas mediante las que se degradan nutrientes, se conserva y se transforma energía química y se
fabrican las macromoléculas biológicas a partir de precursores sencillos.
El estudio de los enzimas también tiene una importancia práctica inmensa. En algunas
enfermedades, especialmente en las que son genéticamente heredables, puede haber una deficiencia, o
incluso una ausencia total, de uno o mas enzimas en los tejidos. Ejemplos.
 Síndrome de Lesch-Nyhan ----- hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa
 Enfermedad de Gaucher ----- glucocerebrosiadsa
 Raquitismo dependiente de vitamina D ----- 25-Hidroxicolecalciferol-1-hidroxilasa
 Enfermedad de Tay-Sachs ----- hexosaminidasa A
También se pueden producir situaciones anormales por la actividad excesiva de un enzima
específico.
La medición de la actividad enzimática en el plasma sanguíneo, eritrocitos, o muestra de tejido es
importante en el diagnóstico de enfermedades.
A excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA catalítico, todos los enzimas son proteínas.
Su actividad catalítica depende de la integridad de su conformación proteica nativa. Si se desnaturaliza o se
disocia un enzima en subunidades, o se descompone en aminoácidos pierde su actividad catalítica. Así, las
estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas enzimáticas son esenciales para su
actividad.
Algunos enzimas requieren un componente químico adicional llamado cofactor. Los cofactores
pueden ser :
 Uno o varios iones inorgánicos : Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+...
 Un complejo orgánico o metaloorgánico llamado coenzima : NAD, NADH. FAD, FADH,
Coenzima A...
Algunos enzimas requieren tanto un coenzima como uno o más iones metálicos ; si estos se unen de forma
covalente, se denomina grupo prostético. Un enzima completo catalíticamente activo junto con su
coenzima y/o iones metálicos se denomina holoenzima. La parte proteica de tal enzima se denomina
apoenzima o apoproteína.
Ejemplo :
Grupo épsilon-amino de una Lisina + biotina  piruvatocarboxilasa
1

holocarboxilasa sintetasa
La catálisis enzimática de las reacciones es esencial para los sistemas vivos. La mayoría de las
moléculas biológicas son muy estables al pH neutro, temperatura suave y ambiente acuoso presente en el
interior de las células. Muchas reacciones comunes suponen situaciones desfavorables o poco probables en
el ambiente celular. Un enzima soluciona estos problemas al proporcionar un ambiente dentro del cual una
reacción determinada es, energéticamente, más favorable. El rasgo distintivo de una reacción catalizada
enzimáticamente es que tiene lugar dentro de los confines de una bolsa del enzima denominada sitio activo.
La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa el enzima se denomina sustrato.
E+S
ES
EP
E+P
E= enzima. S= sustrato. P= producto
La energía de los sistemas biológicos se describe en función de la energía libre, G. En su estado
basal ( forma estable ) cualquier molécula contiene una cantidad característica de energía libre. El equilibrio
entre S y P refleja la diferencia de energía libre de sus estados basales. En el ejemplo de la figura 1, la
energía libre del estado basal de P es inferior al de S,, por lo que la variación de energía libre estándar de la
reacción es negativa, con lo que el equilibrio favorece a P. Este equilibrio no es afectado por ningún
catalizador. No obstante el equilibrio favorable no indica que la conversión S  P sea rápida. Existe una
barrera energética entre S y P que representa la energía requerida para el alineamiento de los grupos
reactivos, formación de cargas inestables transitorias, reordenamiento de enlaces y otras transformaciones
que se requieren para que la reacción tenga lugar en cualquiera de las dos direcciones. Para que haya
reacción las moléculas han de superar esta barrera por lo que se deben llevar a un nivel energético superior.
El estado de transición es un momento molecular fugaz en el que acontecimientos tales como rotura de
enlace, formación de enlace y desarrollo de carga han llegado al preciso instante en el que el colapso a
sustrato o producto es igualmente probable. La diferencia entre los niveles de energía del estado basal y del
estado de transición se denomina energía de activación. La velocidad de una reacción refleja esta energía de
activación, a una energía de activación más elevada corresponde una reacción más lenta. Los enzimas
mediante la catálisis disminuyen la energía de activación, de forma que aumenta la velocidad de reacción.
Las energías de activación son barreras energéticas para las reacciones químicas, estas barreras son
cruciales para la propia vida. La estabilidad de una molécula aumenta con la altura de su barrera de
activación. Sin tales barreras energéticas, las moléculas complejas revertirían espontáneamente a formas
mas sencillas, no podrían existir ni las estructuras complejas y altamente ordenadas ni los procesos
metabólicos que tienen lugar en cada célula.
Los enzimas son específicos, discriminando fácilmente entre sustratos con estructuras muy
similares : ejemplos de distinta especificidad :
 Hexoquinasa : fosforila la glucosa, la manosa y la fructosa ( así que no es específico de un sólo
sustrato ).
 Glucoquinasa : fosforila sólo a la glucosa.
 Fosfatasa alcalina : actúa sobre cualquier ester fosfórico ( tiene especificidad de enlace ).
El poder catalítico de los enzimas proviene en último término de la energía libre emitida al formarse
los múltiples enlaces débiles e interacciones que se producen entre el enzima y su sustrato. Esta energía de
fijación proporciona tanto especificidad como catálisis. La especificidad se refiere a la capacidad de
discriminar entre dos sustratos competitivos.
 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LA REACCIÓN ENZIMÁTICA (
CINÉTICA ) :
1.- Concentración de sustrato :
2
A concentraciones de sustrato relativamente bajas, la velocidad inicial aumenta casi linealmente con
el incremento en la concentración de sustrato. A mayores concentraciones de sustrato, la velocidad aumenta
incrementos cada vez menores en respuesta a incrementos de concentración de sustrato. Finalmente se
alcanza un punto mas allá del cual se dan incrementos pequeñísimos de velocidad con el incremento de
concentración de sustrato. Esta meseta se denomina velocidad máxima. La gráfica corresponde a una
hipérbola rectangular. La concentración de sustrato a la que la velocidad inicial es la mitad de la máxima
es la constante de Michaelis- Menten ( Km ).Un ejemplo de enzima con este comportamiento es la
hexoquinasa. ( figura 2 )
Partiendo de la hipótesis básica de que el paso limitante de velocidad en las reacciones
enzimáticas es la descomposición del complejo ES para formar el producto y el enzima libre, Michaelis y
Menten desarrollaron la siguiente fórmula :
Vo = Vmax S / Km + S
Vo = velocidad inicial
Vmax = velocidad máxima
S = concentración
sustrato
Vmax = 10 Km
Cuando la velocidad inicial es la mitad de la velocidad máxima, Km = S.
La ecuación de Michaelis-Menten se puede transformar algebraicamente en formas más útiles para
representar los datos experimentales. Una transformación común se deduce simplemente tomando los
inversos en ambos miembros de la ecuación, esta es la ecuación denominada de Linerwear-Burk, que da
lugar a la gráfica doble recíproca ( figura 3 ).
Los enzimas alostéricos son aquellos que funcionan a través de la unión reversible, no covalente, de
un metabolito regulador denominado modulador. Estos enzimas muestran una relación entre Vo y S que
difiere del comportamiento normal de Michaelis-Menten : aunque se satura con el susutrato cuando S es
suficientemente elevada, algunos enzimas alostéricos dan lugar a una curva de saturación sigmoidea, a
diferencia de la forma hiperbólica de los enzimas no reguladores. En esta curva se utiliza el símbolo S0,5 o
K0,5 para representar la concentración de sustrato que se necesita para alcanzar la mitad de la velocidad
máxima de la reacción catalizada por un enzima alostérico. En este tipo de gráficas, cuando la velocidad es
aproximadamente la mitad de la máxima, la variabilidad de la velocidad es muy grande ante oscilaciones
pequeñas de S. un ejemplo de enzima al que corresponde esta gráfica es la glucoquinasa ( K0,5 = 7mM ).
2.- Concentración del enzima :
La velocidad de la reacción aumenta cuando la concentración de enzima es mayor, y disminuye
cuando la concentración es menor ; sin embargo la Km es independiente de la concentración de enzima.
En una cinética hiperbólica, se pueden distinguir dos partes en la gráfica :
Cinética de primer orden : corresponde a la primera parte donde la velocidad será
proporcional a S , porque existe mayor cantidad de enzima libre ( el enzima no está saturado )
Cinética de orden cero : cuando la velocidad ya es máxima y no varía aunque aumentemos
S ; esto indica que todo el enzima está virtualmente como complejo ES, el enzima se encuentra saturado.
Al realizar análisis enzimáticos en el laboratorio es fundamental que S sea suficientemente elevada
para favorecer la saturación enzimática, así todas las reacciones deben tener cinética de orden cero para
permitir una determinación enzimática precisa.
3.- Temperatura :
-Normalmente los enzimas funcionan a 37 º C
-El aumento de temperatura favorece las colisiones entre moléculas y el enzima trabaja mejor.
3
-Si se realiza un aumento de 10 º C, la velocidad se multiplica por dos. Cada aumento de 1 º C,
provoca un aumento del 10% de la actividad enzimática, así que es necesario controlar los análisis
enzimáticos para evitar fluctuaciones de temperatura mayores de 1 º C.
-A partir de 40 º C los enzimas se desnaturalizan y dejan de funcionar.
-Un enzima puede soportar aumentos de temperatura durante un breve periodo de tiempo sin
desnaturalizarse.
4.- pH :
Los cambios de ionización de los enzimas o del sustrato explican los efectos del pH.
Los enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo de pH en el que su actividad es máxima, a valores
superiores o inferiores de pH la actividad disminuye.
Los enzimas citosólicos actúan a pH = 7,2-7,3 ; los enzimas lisosomales actúan a pH 7,5. Si
queremos obtener las propiedades reguladoras de un enzima, trabajaremos a pH fisiológico ; si por el
contrario lo que queremos es sacar el máximo rendimiento, trabajaremos a pH óptimo.
Para evitar que el pH varíe considerablemente se añaden soluciones amortiguadoras al determinar la
actividad enzimática en la muestra.
5.- Metabolitos reguladores :
- Inhibidores :
Competitivos : son parecidos a las moléculas de sustrato. Esta inhibición se invierte
aumentando la concentración de sustrato.
No competitivos : se enlazan al enzima en un sitio distinto al sitio activo provocando un
cambio en la configuración de la estructura alterando el sitio activo, sin que éste sea ya receptivo. Puede ser
una inhibición reversible ( uniones débiles ) o irreversible ( enlaces covalentes )
Sin competencia : el inhibidor se une al complejo ES, así se forma un complejo I-ES, y al
aumentar S se aumenta la inhibición ya que se forman mas complejos a los cuales se une el inhibidor.
- Activadores :
Aumentan la velocidad de la reacción. En general son moléculas o iones
pequeños ( por ejemplo iones metálicos ) que tienen diferentes mecanismos de acción :
- Proporcionan un sitio activo electropositivo que atrae a los grupos con
carga negativa del sustrato.
- Tienen función estructural ayudando a estabilizar la estructura terciaria y cuaternaria del
enzima.
Puede ocurrir que al diluir la muestra la velocidad de la reacción aumente, esto indica la existencia
de un inhibidor, y que gracias a la dilución se favorece la disociación Enzima- Inhibidor. Si ocurre lo
contrario, y la velocidad disminuye con la disolución, indica que hay un activador.
 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA :
El origen de los enzimas que se encuentran en la sangre puede ser variado :
 Enzimas propios del plasma
 Enzimas que trabajan en el plasma
 Enzimas liberados en el plasma desde la célula ( la vida media de estos enzimas depende de su
liberación, del sistema retículo endotelial, de su secreción renal... )
Un enzima óptimo presenta las siguientes características :
1.- Especificidad de tejido.
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2.- Medición automatizable.
3.- Estabilidad.
A + B  C + D
Las opciones de medición serían : la desaparición de A o B ; o la aparición de C o D, esto último
mas fácil.
Técnicas colorimétricas :
C o D mas un reactivo, dan un color determinado
Técnicas de absorción de luz a una determinada longitud de onda :
Muy útil en la deshidrogenadas, por ejemplo :
piruvato + NADH + H+ L- lactato + NAD +
lactato deshidrogenasa
A 340nm el NADH absorbe y el NAD+, el lactato y el piruvato no. Así medimos la desaparición de
NADH ( medición de la caída de absorbancia ) ( figura 4 )
Una solución 1 M de una sustancia, absorbe en función de una constante (), de la longitud de la
trayectoria luminosa (l) y de una concentración (c).
A = c l 
A = variación de absorbancia de la muestra en un determinado periodo.
340nm = 6,22 x 103 M-1cm-1 ( coeficiente de absortividad molar del NADH )
Así una solución 1M a 25 º C en una cubeta de 1 cm de paso de luz, absorbe 6,22 x 10 3 unidades
ópticas.
Otro ejemplo : para medir la actividad de la hexoquinasa, se acopla la reacción a la de una
deshidrogenasa :
hexoquinasa
Glucosa + ATP  Glucosa 6-P + ADP
Glucosa 6-P + NADP+ 6-P- Gluconato + NADPH + H +
glucosa 6-P deshidrogenasa
Definimos unidad de actividad enzimática a la cantidad de enzima que transforma 1 mol de
sustrato en producto por minuto en determinadas condiciones de pH, temperatura y S ( una unidad puede
estar en litro de plasma o en kg de tejido ).
El sistema internacional propone como unidad el katal, un katal es la cantidad catalítica de enzima
que cataliza una reacción con una velocidad de 1mol/segundo.
1.- Curva de progreso : ( figura 5 )
La curva de progreso que representa la formación de producto tiene 3 etapas.
1.- Retraso : el enzima tiene que adaptarse al medio, dura de segundos a unos minutos.
2.- Velocidad inicial : velocidad de crucero ( lineal ) que es constante ; es la fase donde se debe determinar
la actividad enzimática. Dura hasta alcanzar el equilibrio.
3.- Velocidad reducida : cinética de orden cero. Se debe a distintos factores :
-Disminución de S.
-Alcance del equilibrio
-Efectos de la inhibición del producto e inactivación progresiva del enzima a medida que la solución
amortiguadora se hace insuficiente para regular el pH.
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2.- Métodos de velocidad de reacción: ( figura 6 )
2.1.- Método de punto final ( también llamado de incubación fija o análisis en dos puntos ) :
Medimos la absorbancia en dos momentos distintos ( A1 y A2 ), y restamos la absorbancia en A2
menos la de A1. A partir de la absorbancia se calcula la actividad. Sus inconvenientes es que se supone que
la reacción es progresiva linealmente y tiene cinética de orden cero.
2.2.- Método de puntos múltiples :
Se hace midiendo la absorbancia en múltiples momentos, lo que permite verificar si la reacción es
lineal. Es más práctico ; hoy en día los microprocesadores te hacen la medición cada 20 segundos.
2.3.- Método de vigilancia contínua :
Se utiliza un espectrofotómetro con registrador para trazar el progreso de la reacción durante un
periodo de varios minutos. La pendiente de la porción lineal de la curva se utiliza para determinar la
actividad enzimática. Cualquier desviación de la linealidad ( que indica que la actividad enzimática es muy
alta y que se agota con rapidez el sustrato ) se observa de inmediato en la gráfica de registro, y se corrige.
3.- Reacciones acopladas :
Normalmente acopladas a deshidrogenasas para medir la aparición o desaparición de NADH con
óptica ultravioleta.
Ejemplo :
Creatina + ATP E1 Creatina-P + ADP ( Reacción primaria )
ADP + PEP E2 Piruvato + ATP ( Reacción auxiliar )
Piruvato + NADH + H+ E3 L- Lactato + NAD+ ( Reacción indicadora )
E1 = CK ; E2 = PK ; E3 = LDH.
E2 = 5 E1 ( para que no exista enzima limitante )
E3 = 10 E1 ( para que no exista enzima limitante )
( las gráficas y la tabla de clasificación de enzimas se encuentran en la taquilla de comisión de apuntes de
sexto )
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