practica 11 - biblioteca upibi

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS
ALIMENTOS
PRÁCTICA 11
OSCURECIMIENTO ENZIMÁTICO
1. OBJETIVOS
a) Revisar los principios básicos de la cinética enzimática.
b) Obtener la experiencia de preparar un extracto crudo enzimático.
c) Observar el desarrollo de una reacción enzimática.
d) Estudiar la cinética de la polifenoloxidasa.
2. INTRODUCCIÓN
2.1.
GENERALIDADES
Las enzimas son proteínas globulares, de estructura compleja y biocatalizadores
con capacidad de acelerar las velocidades de reacción desde 10 2 hasta 1020
veces a temperaturas relativamente bajas (37°C) y presión normal. Sin la
existencia de las enzimas la vida sería imposible, al requerir las reacciones
bioquímicas de un tiempo enorme para efectuarse o bien, simplemente no se
realizarían. Al comparar con una catálisis no enzimática industrial, esta tendría
una velocidad de reacción demasiado baja, alrededor de un millón de veces
menor.
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
Otra característica importante de las enzimas es su elevada especificidad.
Actúan sobre un tipo de sustrato o compuesto con ciertas características, lo cual
permite la modificación de sólo ese compuesto sin alterar otros.
Las enzimas son responsables del metabolismo de microorganismos, vegetales
y animales, transforman a los alimentos en energía y componentes celulares.
Aún después de la muerte continúan actuando, por ejemplo provocan cambios
en el músculo estriado para convertirlo en carne por el proceso de maduración,
fermentaciones de productos lácteos y algunos vegetales (pan, vino, cerveza,
etc.) y el deterioro de los alimentos. Industrialmente se producen enzimas
utilizadas en la modificación de ciertas características de los alimentos, pero
también de otros artículos. Por todo lo anterior, el estudio de las propiedades
enzimáticas es de suma importancia para el mejor almacenamiento y
procesamiento de los alimentos.
La Comisión de Enzimas de la Unión Internacional de Bioquímica propuso una
nomenclatura numérica de cuatro dígitos de acuerdo al tipo de reacción
catalizada, sustrato o enlace donde actúe la enzima en 1972. La primera gran
división comprende seis grupos: 1. Oxidorreductasas, 2. Transferasas, 3.
Hidrolasas, 4. Liasas, 5. Isomerasas y 6. Ligasas o Sintetasas.
Dentro del primer grupo se encuentra el sistema fenolasa que agrupa a la
fenoloxidasa, tirosinasa, catecolasa y fenolasa. La tirosinasa está presente en
tejidos animales y al catalizar la producción del pigmento oscuro llamado
melanina, imparte el color a la piel, pelo y ojos. En plantas, este sistema es
responsable de una reacción típica de deterioro de los alimentos, el
oscurecimiento enzimático, el cual se desarrolla en algunas frutas y verduras
cortadas y dañadas, así como en mariscos, expuestos al aire y la luz. Se
desconoce su función dentro de las plantas.
Las fenolasas catalizan dos tipos de reacción: la hidroxilación A, donde
participan la fenolhidroxilasa o cresolasa y la oxidación B, la cual se refiere a la
actividad de la polifenoloxidasa o catecolasa. Los sustratos son monofenoles, odifenoles, taninos y compuestos flavonoides y el producto intermediario de las
reacciones es la indol-5,6-quinona, el cual se polimeriza para formar la melanina.
Ciruelas, uvas, higos y dátiles adquieren su color característico por medio de
este tipo de oscurecimiento y en ciertas bebidas también es deseable este
obscurecimiento. En cambio, no lo es en manzana, pera, aguacate, etc.
2.2.
CINÉTICA ENZIMÁTICA
Las velocidades de reacciones catalizadas por enzimas se conocen como
actividades enzimáticas. Pueden determinarse midiendo la rapidez de la
desaparición del sustrato o de la aparición de los productos. La velocidad de
reacción de la polifenoloxidasa puede medirse por su utilización de oxígeno,
58
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
desaparición de los compuestos fenólicos, aparición del color oscuro o aparición
de un producto intermediario. La indol-5,6-quinona es un ejemplo muy bueno del
último caso, pues absorbe luz de cierta longitud de onda sin interferencias de
otros compuestos presentes. La actividad enzimática se mide monitoreando el
progreso de la reacción cuando el sustrato y enzima están mezclados. Cuando
el sustrato está presente en exceso y el pH y temperatura están controlados, la
velocidad es proporcional a la concentración de la enzima. La rapidez de una
reacción se define como el cambio de absorbancia de la mezcla estudiada por
unidad de tiempo y es igual a la pendiente de la porción lineal de la curva de
absorbancia-tiempo. La velocidad se define como el cambio de la concentración
del reactante (sustrato) o producto con el tiempo. En el caso de que el sustrato
oxidado sea la 2,3-dihidroxifenilalanina (DHFA) por la polifenoloxidasa (PFO), la
absorbancia A es directamente proporcional a la concentración de la indol-5,6quinona (IQ). Entonces la velocidad de la reacción se puede calcular a partir de
su rapidez si se conoce la relación entre absorbancia y concentración por la ley
Beer-Lambert:
A = CA x bc
donde:
CA = Coeficiente de absorción de la IQ (5.02 L/mmol x cm)
b = Espesor de la celda por la cual atraviesa la luz (1 cm)
c = Concentración (mmol/L).
La velocidad V se definió:
V = dc (mmol)/(Lxmin)
dt
Sustituyendo en la ecuación de Beer-Lampert se tiene:
V=
dA
=
CA x b dt
rapidez
CA x b
=
rapidez (mmol)/(Lxmin)
5.012
Las velocidades de la gran mayoría de las reacciones enzimáticas presentan
una relación hiperbólica con respecto a la concentración del sustrato, por lo cual
se dicen que siguen la cinética de Michaelis-Menten.
En la práctica la PFO se extraerá de papas y el sustrato será la DHFA. El
progreso de la reacción se seguirá por medio de la formación de IQ, la cual
absorbe a 475 nm.
59
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR
a)
Explicar la definición de enzima, sus diferencias con un catalizador
químico, localización y distribución en los organismos.
b)
Explicar la clasificación de las enzimas, indicando ejemplos para cada
grupo.
c)
Explicar la estructura química de las enzimas y sitio activo.
d)
Explicar la forma general de la acción enzimática para la modificación
del sustrato.
e)
Explicar la diferencia entre rapidez y velocidad de reacción, así como
actividad enzimática.
f)
Explicar la definición de cinética y los órdenes de reacción.
g)
Explicar la cinética enzimática propuesta por Michaelis-Menten.
h)
Explicar el modelo de Lineweaver-Burk.
i)
Explicar brevemente los factores influyentes en la cinética enzimática.
j)
Explicar el papel que desempeñan las enzimas en el almacenamiento y
procesamiento de los alimentos.
k)
Explicar la forma de acción de la polifenoloxidasa de acuerdo a su
clasificación, indicando tipos de reacción, sustratos y condiciones.
l)
Explicar la forma de inhibición del bisulfito de sodio del oscurecimiento
enzimático.
60
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Agitador magnético
Cuchillo
Embudo
Espectrofotómetro con celdas
Licuadoras de vaso chico
Matraz Erlenmeyer de 125 mL
Micropipetas de 250-1000 l
Parafilm
Parrillas eléctricas
Papel Whatman No. 1
Pinzas
Probetas de 50 mL
Probetas de 50 mL
Toallas de papel
Tubos de ensaye
Vasos de precipitados de 100 y 600 mL
Hielo
Papas
Solución amortiguadora de fosfato A
Solución amortiguadora de fosfato B
Solución de bisulfito al 0.5%
Solución de 2,3-dihidroxifenilalanina (4mg/mL)
Solución 1N de hidróxido de potasio
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL
5.1.
PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES
a) Amortiguadora de fosfato de sodio A. Se prepara una solución 0.1M y pH
6.8, conteniendo KOH 0.1M.
b) Amortiguadora de fosfato de sodio B. se prepara la solución 0.1M y pH
6.8.
c) Bisulfito de sodio al 0.5%. Se prepara con la solución amortiguadora B.
d) 2,3-dihidroxifenilalanina
(4mg/mL).
Disolver
400mg
de
2,3dihidroxifenilalanina en 10 mL de una solución 0.1M de HCl calentando y
agitando hasta que todo se haya disuelto bien. Agregar 80 mL de la
solución amortiguadora B, ajustar el pH a 6.8 con una solución 1N de
KOH y aforar a 100 mL.
5.2.
PREPARACIÓN DEL EXTRACTO CRUDO ENZIMÁTICO
a) Pelar y cortar en pedazos pequeños las papas.
b) Rápidamente pesar 10g y mezclarlos con 50 mL de la solución
amortiguadora A enfriada previamente con hielo.
c) Licuar la mezcla por 1 minuto y en el matraz Erlenmeyer enfriado con
hielo filtrar con papel Whatman No.1. Mantenerlo en hielo hasta su uso.
61
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
5.3.
ENSAYO ENZIMÁTICO
a) Transferir con mucho cuidado los volúmenes de la solución B, bisulfito y
2,3-dihidroxifenilalanina a sus respectivos tubos etiquetados de 1 a 12
como se indica en el Cuadro 1.
b) Calibrar el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda de 475 nm
y calibrar a cero con agua destilada. Antes de cada lectura calibrar a cero.
c) Iniciar la reacción añadiendo el extracto enzimático en volúmenes
indicados en el Cuadro 1.
d) Mezclar perfectamente y hacer inmediatamente las lecturas de
absorbancia con intervalos de 15 segundos y anotar los resultados para
cada tiempo en la hoja de datos.
Cuadro 1. Volúmenes de las soluciones amortiguadoras, sustrato y
extracto enzimático
Reactivo (mL)
Solución
amortiguadora B
Solución de bisulfito
de sodio
Solución de 2,3dihidroxifenilalanina
Extracto enzimático
1
2
3
4
5
Número
6
de
7
tubo
8
9
10
11
12
2.5
2.4
2.35
2.3
2.2
2.1
2.0
1.9
0.8
0.7
0.6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
2.0
-
0.1
0.15
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
2.0
2.0
2.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.2
0.3
0.4
0.5
6. INFORME DE RESULTADOS
a) Con los datos obtenidos construir un gráfico de absorbancia contra
tiempo.
b) Determinar la velocidad de reacción para los tubos del 2 al 8. Expresar la
velocidad de reacción como milimoles de indol quinona por litro y por
minuto.
c) Graficar velocidad contra [S] para los tubos del 2 al 8 y otra para los datos
de la polifenoloxidasa (PFO).
d) Construir un cuadro con los siguientes datos calculados a partir de los
resultados de cada tubo: rapidez, velocidad de reacción, 1/V, [S] y 1/[S].
Incluir las unidades de cada variable.
62
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
e) Con los datos anteriores construir un gráfico Lineweaver-Burk para los
tubos del 2 al 8. Calcular la velocidad máxima (Vmáx) y la constante de
Michaelis-Menten (Km) para la enzima.
f) Determinar la rapidez de reacción (actividad) para los tubos del 9 al 11 y
graficar actividad contra el volumen del extracto enzimático de la PFO.
g) Discutir, considerando la cinética enzimática teórica, la relación existente
entre las variables en las curvas obtenidas, así como los valores de
rapidez y velocidad de reacción, la velocidad máxima y la constante de
Michaelis-Menten.
h) Comparar la actividad en el tubo 12 con la del tubo 7. Explicar si son
diferentes.
63
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
PRÁCTICA 12
PRUEBA DE LA FOSFATASA ALCALINA
1. OBJETIVOS
El alumno explicará:




Ampliamente la importancia y formas en que se utilizan
las enzimas en la industria alimentaria.
El fundamento de la utilización de las enzimas en control
de calidad de los mismos, en especial de la fosfatasa
alcalina.
El fundamento de la prueba de fosfatasa alcalina como
índice de control de la pasteurización de la leche. Y
Verificará la efectividad de los tratamientos térmicos de
diferentes muestras de leche.
2. INTRODUCCIÓN
Por medio del empleo de preparados enzimáticos se producen procesos
enzimáticos deseados para acelerar o intensificar el procesamiento de varios
alimentos. Desde hace alrededor de 50 años se producen enzimas de origen
microbiano como herramientas técnicas en la producción alimentaria. Fines de
su empleo son el mejoramiento de procesos (extracción de jugos, producción
de glucosa y azúcar invertido, acortamiento de maduraciones, etc.) de la calidad
de los productos (clarificación de jugos, estabilización
de la cerveza,
generación de aromas, etc.), así como elaboración de nuevos productos (pulpas
de frutas y verduras, hidrolizados proteicos y alimentos con mayor contenido
proteico. En forma ascendente además se emplean enzimas o procesos
enzimáticos en el análisis de los alimentos, debido a la alta especificidad de las
enzimas y procesos selectivos.
Desde un punto práctica las enzimas de la leche se pueden dividir en tres
grupos:
 Enzimas cuyo efecto contribuye a la calidad de la leche y
derivados. A este grupo pertenecen las lipasas, proteasas
y carbohidrasas.
64
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS


Enzimas cuya acción se utiliza en la verificación de la
efectividad de l tratamientos térmicos como la fosfatasa
alcalina, catalasa y peroxidasa.
Enzimas implicadas directamente en la elaboración de
diversos productos lácteos, por ejemplo, renina (cuajo),
pepsina y renilasa.
La finalidad del calentamiento a que se somete la leche es
primordialmente para elevar su vida de anaquel debido a la eliminación de
microorganismos patógenos y que causan deterioro y a enzimas indeseables.
Los tratamientos que se realizan en intercambiadores de placas son los de
tiempo corto y altas temperaturas, 85°C por 2 s y 71-74°C por 15-40 s (HTST),
mientras que el de temperaturas bajas y tiempo largo , 65°C por 30 minutos, se
realiza en tanques con agitación.
En un principio, la determinación de la
temperatura y tiempo adecuados se basaron en la destrucción de la riketssia
Coxiella burnetti, la cual transmite la fiebre Q de los animales al humano. En
1956 el microorganismo que se tomó como blanco fue el bacilo de Koch
causante de la tuberculosis.
Últimamente se ha reevaluado el objetivo,
apareciendo la LIsteria monocytogenes como el microorganismo a destruir.
Un método para indicar un tratamiento térmico suficiente para la
destrucción de microorganismos patógenos es la inactivación de la fosfatasa
alcalina que ocurre paralelamente. Su actividad residual en algunos alimentos
térmicamente tratados como la leches se ha usado como índice de control de
calidad durante su procesamiento.
La fosfatasa alcalina se encuentra en la leche en forma de un complejo
lipoproteico y se distribuye entre las fases grasa y acuosa.
La pérdida de la actividad de las enzimas puede ser reversible, siempre y
cuando la acción del agente desnaturalizante no sea muy intensa. Así, la
fosfatasa alcalina puede recuperar su actividad durante el almacenamiento de la
leche, sobre todo la procesada con temperaturas elevadas.
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR
El alumno indagará sobre los siguientes temas:




Importancia y formas en que se utilizan las enzimas en la
industria alimentaria.
El fundamento de la utilización de las enzimas en control
de calidad de los mismos, en especial de la fosfatasa
alcalina en el control de tratamientos térmicos de la leche.
La naturaleza y función de la fosfatasa alcalina en la leche.
El fundamento (reacciones químicas) de la prueba de
fosfatasa alcalina como índice de control de la
65
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS


pasteurización de la leche. Verificará la efectividad de los
tratamientos térmicos de diferentes muestras de leche.
La interpretación de los resultados de esta prueba.
Cómo se puede controlar la alteración de los resultados
por una reactivación de la enzima.
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Gradilla
4 Tubos de ensaye
1 Pinzas para tubo de ensaye
1 Mechero
1 Tripié
1 Baño
1 Termómetro
1 Vortex
Pipetas de 1 y 10 mL
1 Vaso de precipitados de 500 mL
1 Kit de fosfatasa alcalina que
comprende los reactivos
Lactognost I (éster fenílico del
ácido fosfórico),
II (reactivo fenólico) y iii (polvo
inerte mezclado con un colorante
sensible al fenol).
Leche bronca y pasteurizada
(comercial)
Agua destilada
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL
5.1. Preparación de la muestra
a) Se toma una parte de la leche bronca y se calienta con agitación a 85°C
por dos segundos. Se deja enfriar, por lo menos a 40°C.
b) La otra parte se conserva tal cual para su análisis.
5.2.
Realización de la prueba
a) En tres tubos de ensaye se colocan 10 mL de agua destilada
b) Se calientan a 40°C en un baño.
c) Se introducen a cada tubo una tableta de Lactognost I y otra de Lactognost
II.
d) Se agitan los tubos en el vortex
e) En sendos tubos se agregan un mL de la leche bronca, leche pasteurizada
comercial y la leche tratatada a 85°C por dos segundos ( ya fría).
f) A cada tubo se le agregan 10 g de Lactognost III y se agitan muy bien en el
vórtex.
g) Se dejan reposar los tubos a temperatura ambiente por 10 minutos.
h) Posteriormente se agitan de nuevo muy bien los tubos en el vórtex.
i) Se dejan reposar los tubos a temperatura ambiente por 3 minutos.
j) Se comparan los tres tubos con respecto al color presentado.
66
PRACTICA 10
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
QUÍMICA Y FUNCIONALIDAD DE LOS ALIMENTOS
6. ANÁLISIS DE RESULTADOS
El alumno:
a) En un cuadro registrará los resultados obtenidos (colores) de todo el grupo
en cada muestra de leche, indicando si fue positiva o negativa la prueba.
b) Explicará los resultados de acuerdo a la teoría consultada.
c) Dará las conclusiones con base en los objetivos planteados.
67
PRACTICA 10