PROBLEMAS MÁS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIÓN

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7. PROBLEMAS MÁS FRECUENTES DURANTE LA SECUENCIACIÓN
A) No se produce reacción o esta decae poco después de comenzar
Posible causa
No hay ADN o hay menos del necesario
No hay cebador o la concentración es inferior
a la necesaria
El cebador no encuentra el sitio de hibridación
El ADN presenta contaminación
El cebador está mal diseñado o la temperatura
de melting no es la adecuada
El sitio de unión del cebador en el vector se ha
perdido o dañado
En los productos de PCR puede que los
amplificados no sean el producto de la
amplificación con los dos cebadores
Posible solución
Aumentar la cantidad de ADN
Aumentar la concentración o cantidad de
cebador
Cambiar el cebador
Volver a preparar el ADN
Rediseñar el cebador
Volver a clonar en el vector
Cambiar de cebador
B) Señal de baja intensidad. Unión débil del cebador.
Posible causa
Mala calidad del ADN
ADN presenta estructura secundaria en el
sitio de hibridación del cebador
La concentración del ADN inferior a la
necesaria
El cebador utilizado en la secuenciación no
es el adecuado:
- Estructura secundaria
- Tm del cebador demasiado baja
Posible solución
Volver a purificar el ADN
Cambiar de cebador
Aumentar la concentración
Cambiar el cebador
C) El cromatograma es correcto pero presenta mucho ruido de fondo
Posible causa
Existe un sitio secundario de unión del
cebador que da lugar a picos extra
La cantidad de ADN es insuficiente y la
señal es demasiado baja
El ADN presenta contaminación1
La PCR no fue especifica y existen
amplicones contaminantes en la muestra
Cebador mal purificado2
Fragmento de PCR mal purificado
Posible solución
Intentar eliminar añadiendo DMSO en la
secuenciación o cambiar de cebador
Aumentar la cantidad de ADN
Purificar el ADN
Cambiar de cebador
Cambiar de cebador o purificar
Eliminar los cebadores de la amplificación
1. En la secuenciación en capilares este problema (contaminación del ADN) es aún mayor al
ser más sensible.
2. Puede verse una “secuencia sombra” (N-1). El cebador está compuesto por cadenas
completas (N), pero una proporción de ellas contiene una base menos (N-1), esto da lugar
a un cromatograma ilegible al tener picos superpuestos y desfasados.
D) El cromatograma presenta dos secuencias superpuestas
Posible causa
El cebador tiene varias dianas
El cebador de la PCR no se ha eliminado
Cebador degenerado
ADN subclonado existiendo dos sitios
diana para el cebador universal utilizado1
Hay más de un ADN molde en la muestra2
PCR inespecífica: diana del cebador en
ambos extremos, es decir, amplicón
inespecífico generado por un solo cebador
Posible solución
Cambiar de cebador
Purificar mejor el ADN
Cambiar de cebador
Secuenciar con otro cebador
Repreparar el ADN
Cambiar de cebador
1. Comprobar, si se ha arrastrado polinker durante la subclonación, que cebadores universales
tienen sitio de hibridación duplicado y no utilizarlos en la secuenciación de esa muestra.
2. Asegurarnos de que partimos de una única colonia o que no es PCR múltiple con
amplificaciones secundarias.
E) La reacción comienza de forma normal pero existe doble lectura a partir de
un determinado punto
Posible causa
Primer drimer del cebador utilizado en la
secuenciación con los cebadores de
amplificación
Posible solución
Volver a purificar el producto de PCR
Clon múltiple, PCR múltiple
Diana múltiple del cebador en el ADN
Mutaciones frame shift
Volver a preparar la muestra para obtener
un único molde
Cambiar de cebador
F) La secuencia pierde bruscamente la señal y cae
Posible causa
Efecto de una estructura secundaria
La cantidad entre el ADN y el cebador no
es la equilibrada
Formación de estructuras en la clonación
que impiden una correcta secuenciación
Presencia de compuestos contaminantes en
la muestra
ADN cortado, digerido a ese nivel o
finalización de producto de pcr
Posible solución
Añadir DMSO
Respetar las concentraciones y cantidades
indicadas en las tablas de entrega de
muestras
Realizar PCR sobre el clon (cebadores
universales o propios) y mandar a
secuenciar el amplicón resultante y no el
clon
No resuspender nunca el ADN en solución
que contenga EDTA
-
G) Parte inicial del cromatograma oscurecida por granes picos
Posible causa
Los cebadores forman dímeros (aunque el
resto de la lectura es correcta)
Posible solución
Diseñar cebadores que no formen dímeros
H) Presencia de picos saturados y fuera de escala en el cromatograma
Posible causa
Demasiada cantidad de ADN
Posible solución
Reducir la cantidad de ADN ( según figura
en las tablas de entrega de muestras)
I) La secuencia es normal pero aparece un pico de forma repentina
Posible causa
Terminadores no incorporados
Posible solución
Repetir la reacción de secuenciación
J) Aparición de un pico anómalo con los colores correspondientes a todas las
bases
Posible causa
Burbuja producida por el capilar
Posible solución
Volver a analizar la muestra o repetir la
reacción de secuenciación
K) Aparición de picos muy abiertos con la consecuente pérdida de resolución
Posible causa
Exceso de ADN (capilar)
Presencia de sales o contaminantes en la
muestra
Problema del capilar
Posible solución
Respetar la cantidad y concentración de
ADN
Volver a purificar la muestra
Repetir la secuencia
L) Secuenciación de regiones ricas en GCs
Posible causa
Estructura secundaria, efecto de la alta Tm
del tratamiento del ADN
Posible solución
Añadir DMSO en la secuenciación,
aumentar la tª de desnaturalización a 98º ,
aumentar el numero de ciclos de PCR,
linearizar el vector y secuenciar productos
tras subclonarlos
Cuando se secuencien organismos con un alto contenido GC indicarlo en las tablas que se adjuntan
con la muestras a secuenciar
M) Pérdida de la señal debido a una zona rica en G
Posible causa
Presencia de una estructura secundaria
Homopolímero G
Posible solución
Repetir secuenciación añadiendo DMSO
Secuenciar cadena complementaria
N) Presencia de microsatélites
Posible causa
Presencia Microsatélites
Repeticiones dinucleótidos GC
Posible solución
Secuenciar a partir del plásmido no del
producto de PCR y añadir DMSO en la
reacción de secuenciación
Crear delecciones en esas zonas
Cambios ya recomendados
O) Presencia de zonas rica de GT o GA
Posible causa
Repeticiones dinucleótidos GT o GA
Formación de dúplex que alteran estabilidad
del cebador
Posible solución
Secuenciar la cadena complementaria
Usar temperaturas de secuenciación más
bajas que la estándar
P) Presencia de una zona con poliA o poliT
Posible causa
Presencia de poliA/poliT1
Posible solución
Secuenciar cadena complementaria
Empleando cebador degenerado del tipo
T25(A, G ó C) si no se conoce la base
siguiente a la región poliA/poliT o los
cebadores individuales específicos T25A,
T25G ó T25C. La base 3´ del cebador
permite anclar este a la secuencia al final del
homopolímero, mejorando los resultados
obtenidos
1. La polimersa “patina” dando lugar a una lectura ilegible después de la región
homopolimérica, aunque los datos de antes de esa región sean de buena calidad. Este
problema se puede producir en la reacción de secuenciación o en la de amplificación,
aunque en este último caso no son aparentes cuando el fragmento se visualiza en un gel de
agarosa.
Q) Presencia de largos homopolímeros
Posible causa
Homopolímero causa deslizamiento de la
polimerasa generándose una secuencia
ilegible
En los productos de PCRs pueden existir
saltos, problemas que no existen en el
material clonado
Posible solución
Secuenciar cadena complementaria
Usar un cebador más interno
Empleando cebador degenerado del tipo
T25(A, G ó C) o los cebadores individuales
específicos T25A, T25G ó T25C.
Secuenciar el material clonado, además del
amplificado. Si es posible, es mejor verificar
la especificidad de la secuencia a partir de
otros clones
Imágenes tomadas de http://bmr.cribi.unipd.it/
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