influencia de las características del sustrato sobre la

INFLUENCIA DE LAS CARACTERÍSTICAS DEL SUSTRATO EN LA
ACCIÓN DE AGENTES ANTIMICROBIANOS SOBRE BIOFILMS DE
MICROORGANISMOS DE RELEVANCIA CLINICA
Miñán Alejandro1, Díaz Carolina1, Schilardi Patricia1*, Fernández Lorenzo, Mónica1,2*
1
Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA), Universidad Nacional de La Plata –
CCT La Plata, CONICET, La Plata, Argentina.
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina
E-mail: mmele@inifta.unlp.edu.ar; pls@quimica.unlp.edu.ar
Resumen. Diversos dispositivos de uso medico son particularmente vulnerables a la formación de biofilms
bacterianos. Entre ellos pueden mencionarse los catéteres y los dispositivos implantables donde la formación
del biofilms es la principal causa de infección en pacientes hospitalizados. Es bien conocido que bajo esta forma
de crecimiento las bacterias son altamente resistentes a los tratamientos antimicrobianos. El objetivo de este
trabajo fue estudiar la actividad biocida del uso combinado de sustratos submicroestructurados y antibióticos
(estreptomicina (STP)) sobre los biofilms tempranos de microorganismos de relevancia clínica. Para ello se
emplearon como modelo Staphyloccocus aureus (Gram positivo, no móvil) y Pseudomonas fluorescens (Gram
negativo, móvil mediante flagelos). Primeramente se determinó la concentración inhibitoria y bactericida
mínima de STP en cultivos planctónicos. Posteriormente, se estudió la adhesión de bacterias a sustratos de oro
con submicroestructuras (SME) cuyas dimensiones características coincidían con el diámetro de las bacterias y
sobre superficies lisas con nanoestructuras (NE) distribuidas aleatoriamente. Pudo constatarse que existía
inhibición de la adhesión de S. aureus y P. fluorescens sobre los sustratos SME a 1/4 y 1/6 de las
correspondientes al NE, respectivamente. A continuación se ensayaron tratamientos con STP en
concentraciones entre 1 y 4 mg/L. En esta etapa se evaluó la efectividad de la estrategia combinada que
consistían en el uso conjunto de superficies SME y STP (SME+STP) para disminuir y/o erradicar los biofilms de
S. aureus y P. fluorescens. Los resultados demostraron que, para ambas especies, existe un efecto sinérgico de
SME+STP que en el caso de 4 mg/L de STP produce en el biofilm una reducción del número de
microorganismos sobrevivientes de al menos 1000-veces con respecto a los tratamientos individuales (STP o
SME). Este estudio mostró que la estrategia podría contribuir significativamente en la erradicación de biofilms
de diferentes microorganismos, incluyendo bacterias no-móviles y móviles, y además probó el importante rol de
los agregados bidimensionales en el incremento de la resistencia a los agentes antimicrobianos.
Palabras clave: Biofilm, Superficies submicroestructuradas, Antibióticos, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas fluorescens
1.
INTRODUCIÓN
En las últimas décadas, los biofilms han sido reconocidos como un importante factor en
la patogenia de un gran número de infecciones humanas persistentes, que incluyen la placa
dental, caries, neumonía y endocarditis bacteriana. De igual manera se ha demostrado que
sobre una amplia variedad de dispositivos médicos implantables se pueden formar biofilms
[Tunkel and Mandell, 1992; Raad et al., 1993]. Entre dichos dispositivos se pueden
mencionar catéteres, válvulas cardíacas artificiales, sondas urinarias, lentes de contacto y
prótesis ortopédicas, los cuales una vez colonizadas por bacterias, generan infecciones
excepcionalmente difíciles de combatir mediante el empleo de antibióticos [Miller and
Ahearn, 1987; Hancock, 1994; Stickler et al., 1998; Donlan, R. M., 2002].
Los biofilms están constituidos por comunidades de microorganismos unidos entre si y
adheridos irreversiblemente a un sustrato mediante una matriz de sustancias poliméricas
extracelulares que ellos mismos han producido, y exhiben un fenotipo alterado en relación
con la velocidad de crecimiento y trascripción génica [Donlan, Rodney M. and Costerton,
2002]. La formación de biofilms proporciona a la bacteria una estrategia de sobrevivencia,
que protege a los microorganismos de la acción de los agentes agresivos. De hecho, es bien
sabido que, bajo esta forma de crecimiento las bacterias son altamente resistentes a los
tratamientos antimicrobianos superando en gran medida el nivel necesario para erradicar las
células planctónicas [Costerton et al., 1999].
Al sumergir a un sustrato en un medio biológicamente activo se produce el
acondicionamiento de la superficie mediante la adsorción de sustancias orgánicas.
Posteriormente ocurre la adhesión a una superficie de bacterias libres, con o sin movilidad, lo
cual en principio sucede de manera reversible, para finalmente tornarse irreversible [O'Toole,
George et al., 2000; Dunne, 2002]. En los microorganismos móviles, los apéndices presentes
en bacterias como flagelos, fimbrias y pilis colaboran en la formación de una unión activa con
la superficie [Korber et al., 1989; Bullitt and Makowski, 1995]. La motilidad mediante
flagelos, como los presentes en el género Pseudomonas ayudaría a la bacteria a acercarse a la
superficie, vencer las fuerzas repulsivas y lograr la adhesión [O'Toole, G. A. and Kolter,
1998]. Sin embargo bacterias inmóviles también forman biofilms, un ejemplo de ello son las
bacterias Gram-positivas (ej. Staphylococcus aureus) en cuyo proceso de adhesión participan
proteínas de superficie [Cucarella et al., 2001; Toledo-Arana et al., 2001].
Estudios previos de nuestro grupo [Diaz, C. et al., 2007; Diaz, C. et al., 2009; Diaz, C. et
al., 2010] demostraron que en la etapa de adhesión al sustrato, los microorganismos
responden de manera similar a la misma topografía de las superficies, aún cuando las mismas
sean químicamente muy diferentes. En estos trabajos también se pudo comprobar que cuando
la dimensión característica del patrón de la superficie coincide con el diámetro bacteriano,
estos microorganismos quedan atrapados en dichos patrones y se acentúa su aislamiento. En
el presente estudio se parte de la hipótesis de que la acción de los antibióticos sobre células
sésiles puede intensificarse si se impide o dificulta la adhesión bacteriana y la formación de
agregados bacterianos. Sobre la base de las observaciones anteriores puede especularse que la
combinación adecuada de sustratos con patrones submicroestructurados y el tratamiento
antibiótico podría actuar sinérgicamente como una estrategia eficaz para erradicar los biofilms
tempranos de microorganismos de relevancia clínica. Para probar esta hipótesis, se emplearon
como microorganismos modelos Pseudomonas fluorescens (Gram negativo, móvil mediante
flagelos) y Staphyloccocus aureus (Gram positivo, no móvil). Asimismo se evalúa el efecto
del sustrato en la adhesión y colonización de superficies por bacterias con y sin movilidad.
2.
MATERIALES Y MÉTODOS
Sustratos
Como sustratos se utilizaron superficies de oro. Las superficies microestructuradas (SME)
se prepararon a partir de la técnica de moldeo y replicación asistidos por monocapas
autoensambladas. El patrón superficial consiste en canales de 550 nm de ancho y 120 nm de
profundidad separados por crestas de 750 nm de ancho [Diaz, C. et al., 2007; Diaz, C. et al.,
2009; Diaz, C. et al., 2010]. Como control, se utilizaron sustratos que presentan en su
superficie granos orientados al azar de 50 - 100 nm (Arrandee ®, Alemania).
Cultivos bacterianos y formación de biofilms
En este trabajo se emplearon dos microorganismos de importancia clínica, una cepa de
referencia S. aureus ATCC 25923 y un aislado de P. fluorescens. Los microorganismos se
cultivaron en caldo nutritivo (Merck, Darmstadt, Alemania) a 28 °C con agitación (250 rpm)
durante 18 h. Los experimentos de adhesión bacteriana sobre sustratos SME y NE se
realizaron utilizando el procedimiento descrito en la literatura [Diaz, C et al., 2012]. Luego de
la incubación, cada suspensión bacteriana se ajustó a 108 unidades formadoras de colonias
(UFC/ml) en medio de cultivo fresco, y se utilizaron inmediatamente para la inoculación de
los sustratos (NE, SME, 0,25 cm2). Para el ensayo de adhesión bacteriana, los sustratos se
colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos y se depositó sobre cada uno 20 l de
suspensión bacteriana, incubándose durante 2 horas a 37 °C. A continuación, los sustratos con
biofilms se lavaron suavemente con agua destilada estéril con el fin de eliminar aquellas
células que no se encontraban fuertemente adheridas a la superficie.
El número de bacterias adheridas a la superficie de los sustratos se determinó a través de
su cuantificación por el método de dilución seriada como se describe a continuación. En
primer lugar, los sustratos SME y NE se colocaron individualmente en tubos de vidrio que
contenían 2 ml de solución buffer fosfato estéril (PBS) y las bacterias irreversiblemente
adheridas se separaron por acción de un baño ultrasónico durante 15. Posteriormente, se
determinó el número de bacterias en la suspensión mediante dilución seriada y plaqueo en
agar nutritivo. En todos los casos se realizaron 3 ensayos independientes con su respectivo
duplicado.
Tratamiento antibiótico
Los ensayos de susceptibilidad a estreptomicina (STP) se realizaron primeramente en
cultivos planctónicos. La concentración inhibitoria mínima (CIM) de STP para ambos
microorganismos se determinó por el método de microtitulación según las directrices del
CLSI [CLSI, 2009], pero reemplazando el caldo Müller-Hinton por caldo nutritivo. La
concentración bactericida mínima (CBM) se determinó por el método de recuento en placa
[French, 2006]. Para testear el efecto combinado del tratamiento antibiótico sobre bacterias
adheridas a ambos sustratos (NE y SME), éstos se colocaron en placas de cultivo de 24
pocillos, después de añadirles 20 L de cultivo, y se incubaron a 37 ºC durante 2 h, tal como
se ha descrito anteriormente. Los biofilms formados sobre los sustratos se lavaron suavemente
dos veces con PBS y después se incubaron con 2 ml de caldo nutrido conteniendo STP en
concentraciones entre 1 a 4 mg/L. Después de 18 h de incubación a 37 °C, las soluciones con
STP se retiraron y los biofilms se lavaron dos veces con solución de PBS estéril. A
continuación, los sustratos con biofilms se colocaron individualmente en tubos de vidrio que
contenían 2 ml de buffer PBS y se llevaron a lavador ultrasónico. Alícuotas de la solución
resultante se sembraron, después de realizar diluciones apropiadas, sobre placas de agar
nutritivo. Finalmente, se enumeran las colonias y se determinaron las UFC a las 24 h de
crecimiento. El mismo procedimiento se empleó para obtener el número de células viables
unidas a cada sustrato antes de la exposición a STP. Estos valores se utilizaron como valores
de control a los que se refirieron los valores de células viables después del tratamiento con el
agente antimicrobiano. Todos los ensayos descritos se realizaron por duplicado y a partir de al
menos tres cultivos independientes.
Ensayos de viabilidad
Con el fin de evaluar la colonización inicial y, al mismo tiempo, la proporción de
microorganismos viables y muertos adheridos a los sustratos (antes y después del tratamiento
con STP), se empleó el kit de viabilidad LIVE/DEAD® BacLight (Invitrogen). La solución
LIVE/DEAD se preparó mezclando 30 l del componente A (SYTO 9) y 30 l del
componente B (yoduro de propidio) y diluyendo la mezcla en una proporción 1/200 en agua
destilada. A continuación 6 l del colorante se vertió sobre cada sustrato y se mantuvo en la
oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente. Luego, los sustratos se enjuagaron con
solución estéril de NaCl (0,9% p/v). Las bacterias fluorescentes se visualizaron por
epifluorescencia con un microscopio Olympus BX-5. Los filtros utilizados fueron U-MWG2
(excitación 510-550 nm y 590 nm de emisión) y U-MWB2 (excitación y emisión 460-490
520).
Análisis estadístico
Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) para evaluar las diferencias entre los grupos.
Se consideró un valor de p < 0,05 como estadísticamente significativo.
3.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Numerosos estudios sobre biofilms microbianos han reportado que la densa estructura de
los agregados bacterianos presentes en los biofilms es una de las principales causas de la
resistencia a la terapia antibiótica [Butler et al., 2010]. Por esta razón, en el presente trabajo se
propuso una estrategia dirigida a impedir la agregación bacteriana empleando sustratos SME
con el objeto de aumentar la susceptibilidad de células sésiles al tratamiento antimicrobiano.
Para ello, en primer lugar se compararon y estudiaron las características de biofilms
tempranos de bacterias no móviles (S. aureus) y móviles (P. fluorescens) formados sobre
sustratos SME y NE. Posteriormente, se evaluó el efecto de las superficies SME y el
tratamiento con STP como factores individuales sobre biofilms de S. aureus y P. fluorescens,
así como el tratamiento combinado (SME + STP) con el fin de encontrar un posible efecto
aditivo/sinérgico que permita la reducción y/o erradicación bacteriana.
Efecto de la submicroestructura (SME) en la adhesión como único factor
Las superficies de oro SME que presenta un arreglo ordenado de canales en el rango de
nano/micro escala afectan la formación de agregados de P. fluorescens, alterando su adhesión
y movilidad [Diaz, C. et al., 2007]. Por esta razón, el primer paso del presente estudio
consistió en evaluar el efecto de la submicroestructura de oro en las etapas iniciales de la
organización de S. aureus, comparando los resultados con los obtenidos para la superficie
nanoestructurada (Fig. 1). A través del análisis cuantitativo se encontró que el número de
bacterias de S. aureus adheridas al sustrato SME después de 2 h de colonización se redujo
significativamente (más de 4 veces) en comparación con el sustrato NS (p < 0,05). Este
resultado es coincidente con los hallados en biofilms tempranos de P. fluorescens cuya
densidad celular decreció en la superficie SME al menos 6 veces. Con el fin de caracterizar la
organización celular en ambos sustratos, se tomaron imágenes mediante microscopia de
epifluorescencia y AFM (Tabla 1). Empleado el kit de viabilidad LIVE/DEAD Baclight se
pudo confirmar que la densidad de las bacterias de S. aureus y P. fluorescens era mayor en la
superficie NE. Asimismo, el análisis de las imágenes de AFM reveló que la mayor parte de
las bacterias adheridas a dicho sustrato forman patrones abiertos y ramificados. En cambio en
el sustrato SME, en ambos microorganismos, se pudo apreciar una menor densidad de células,
las cuales se encontraban principalmente aisladas y distribuidas al azar (efecto SME).
Fig. 1. Número de bacterias adheridas a las superficies NE y SME (área: 0.25 cm2)
luego de 2 h de colonización. UFC: unidades formadoras de colonias.
Efecto del tratamiento antibiótico (STP) como único factor
Primeramente se determinó el efecto de STP sobre células planctónicas. Los valores de
CIM y CBM encontrados para S. aureus fueron 2 y 4 mg/L y en P. fluorescens 4 y 8 mg/L
respectivamente. En función de los resultados de CIM se estableció el rango de
concentraciones de antibiótico a ensayar (1 a 4 mg/L) sobre cultivos sésiles de S. aureus y P.
fluorescens. A continuación, se analizó la actividad antimicrobiana de STP en la población
sésil (biofilms de 2 h) formada en los sustratos SME y NE para ambos microorganismos. La
Fig. 2 muestra el efecto bactericida de STP sobre biofilms (2 h) de S. aureus y P. fluorescens
sobre el sustrato NE (efecto STP). Es interesante notar que, en ambos microorganismos, el
número de células viables adheridas al sustrato NE no difieren significativamente (p > 0,05)
en todo el rango concentraciones del antibiótico testeado. Asimismo el número de células
viables adheridas al sustrato NE, tanto en S. aureus como en P. fluorescens, disminuyó un
máximo de 2 ordenes respecto al control (biofilm formado sobre NE y sin tratamiento con
STP).
Fig. 2. Número de bacterias viables posterior al tratamiento antibiótico sobre
los sustratos NE y SME. Pf: P. fluorescens; Sa: S. aureus.
Efecto combinado del tratamiento combinado (SME+STP)
A diferencia de los resultados obtenidos luego del tratamiento antibiótico sobre el
sustrato NE (efecto STP), los biofilms de S. aureus y P. fluorescens formados sobre la
superficie SME mostraron una reducción significativa en el número de células sésiles luego
del tratamiento antimicrobiano (SME+STP) (Fig. 2). Con el objeto de interpretar el efecto del
tratamiento combinado (SME+STP) se emplearon los criterios de Bonapace y cols.
[Bonapace et al., 2000]. De acuerdo a estos autores, la sinergia en el efecto antimicrobiano se
define como una disminución de al menos 100 veces en el número de bacterias después del
tratamiento combinado (SME+STP), en comparación con el factor más activo (SME o STP) y
por lo menos 100 veces la disminución con respecto al inóculo inicial. Por otro lado, la
aditividad se atribuye a cualquier otra situación mejor respecto al factor más activo, pero con
una disminución en el número de bacterias menor que 100 veces. Así, los resultados indican
que el tratamiento SME+STP exhibe para S. aureus sinergia en todo el rango de
concentraciones, y en particular a 4 mg/L de STP se logra la reducción del número inicial de
células sésiles a un valor inferior a 10 células viables. En cambio P. fluorescens mostró
sinergia a 4 mg/L y aditividad a 2 mg/L de STP, lo cual podría explicarse por presentar un
mayor valor de CIM a este antibiótico. Estos resultados confirman que la estrategia propuesta
(SME+STP) fue eficaz para potenciar la actividad bactericida de STP en ambos
microorganismos.
Las imágenes de microscopia AFM y epifluorescencia (kit LIVE/DEAD) concuerdan con
los resultados de cuantificación de células viables (Tabla 2). Cuando las células sésiles fueron
expuestas a STP, las imágenes de epifluorescencia mostraron una mayor densidad bacteriana
sobre el sustrato NE (efecto STP) comparada con la encontrada en el SME (SME+STP), el
cual presentó un mayor numero de células muertas. Es importante mencionar que en el
sustrato NE se observaron microcolonias compactas de P. fluorescens y grandes agregados
ramificados de S. aureus, con gran número de células viables. Sin embargo, en ambos
microorganismos, este tipo de cúmulos o estructuras no fueron comunes sobre el sustrato
SME, el cual exhibió el mayor efecto bactericida para el tratamiento combinado (SME+STP,
4 mg/L) contra ambas especies adheridas a la superficie SME (Fig. 2).
Rol de los agregados bacterianos bidimensionales en la resistencia bacteriana a los
agentes antimicrobianos
Es bien conocido que las bacterias en biofilms son en general más resistentes a los
mecanismos de defensa del hospedador y a los antibióticos que sus contrapartes planctónicas.
En particular el fenómeno de resistencia a los agentes antimicrobianos presenta un carácter
multifactorial, el cual varía entre especies bacterianas pero se encuentra vinculada tanto a las
características fisiológicas particulares de las bacterias como así también a la ultraestructura
de los biofilms [Stewart and Costerton, 2001]. Las principales hipótesis que explican este
comportamiento son: penetración lenta o incompleta del antibiótico en el biofilm y causas
metabólicas, presencia de enzimas entrampadas en la matriz, alteración de las subpoblaciones
sésiles al fenotipo “persistidor”, expresión de genes de resistencia específica, y
sobreexpresión de enzimas por el microorganismo como respuesta a un entorno hostil. Sin
embargo, los mecanismos de resistencia a los antibióticos no se comprenden totalmente dado
que en la mayoría de los biofilms están implicadas combinaciones de estos factores [Ito et al.,
2009]. Por esta razón, en este trabajo se ha estudiado la susceptibilidad antimicrobiana de S.
aureus y P. fluorescens a STP en el estadio inicial de formación del biofilm, el cual se
presenta en agregados bidimensionales (2D) o tipo monocapa. De esta forma se puede excluir
del análisis los efectos vinculados a problemas difusionales del antibiótico y de nutrientes
hacia las capas mas internas del biofilms maduro (multicapas).
Si bien numerosos estudios han informado diferencias en la susceptibilidad a los
antibióticos entre biofilms en monocapa y maduros [Ito et al., 2009; Qu et al., 2010], poco se
conoce sobre la diferencia entre la susceptibilidad antimicrobiana de los agregados en
monocapa en relación con las células aisladas. En este sentido los resultados de este trabajo
demostraron que después de 2 h de incubación, la formación de agregados en monocapa tanto
en bacterias no móviles como S. aureus y móviles como P. fluorescens fue inhibida en
sustratos SME, encontrándose gran cantidad de células aisladas. Asimismo el efecto
antimicrobiano sobre células sésiles de ambas especies en superficies SME y NE (adheridas a
partir de la misma cantidad de células planctónicas: 20 µL de 108 UFC ml-1) fue muy
diferente. En el sustrato SME, se observó una reducción en el número de células viables
ambos microorganismos en todo el rango de concentraciones ensayado. En particular mostró
un efecto sinérgico (SME+STP) al utilizar 4 mg/L de STP, con una reducción de células
viables de 5 y 6 ordenes respecto al control de P. fluorescens y S. aureus respectivamente. En
cambio la máxima reducción de viables alcanzada en el sustrato NE después de un
tratamiento similar fue de 2 órdenes en ambos casos. Es interesante destacar que tanto los
biofilms de S. aureus como los de P. fluorescens crecidos sobre el sustrato NE lograron
desarrollar una estructura tridimensional y alcanzaron una maduración semejante (Tabla 1).
Una posible justificación a esta acción bactericida sinérgica sobre células sésiles podría
asociarse a la topografía de la superficie submicroestructurada. En el caso de
microorganismos móviles (P. fluorescens) los canales presentes en el sustrato SME dificultan
la movilidad conjunta de los mismos, conocida como swarming, ya que las bacterias quedan
“atrapadas” en los canales y el proceso de colonización de la superficie se ve dificultado
[Diaz, C. et al., 2009]. Tanto en el caso de microorganismos móviles como no móviles (S.
aureus), la disposición en canales incrementa la separación de las células que quedan
“encerradas” en los canales (ver Tabla 2). Como consecuencia de ese aislamiento se dificulta
la comunicación química entre ellas así como la formación de agregados. De esta manera la
resistencia asociada a la menor superficie celular expuesta al antibiótico y a la protección de
la matriz polimérica extracelular propias de una colonia 2D no llegan a lograrse. Como
consecuencia, las bacterias adheridas a la superficie SME son más susceptibles al tratamiento
antibiótico, aumentando así la efectividad biocida del mismo. En este sentido, este trabajo es
único en estudiar y comparar el efecto bactericida de STP contra células sésiles de S. aureus y
P. fluorescens cuando las bacterias crecen en forma aislada o formando agregados sobre
superficies de oro que no se encuentran químicamente modificadas.
4. CONCLUSIÓN
Los resultados de este estudio mostraron que desde las primeras etapas de la formación
del biofilm, la agregación bacteriana se convierte en un factor importante que conduce al
aumento de la resistencia a los antibióticos. Asimismo, estos resultados destacan las
prometedoras propiedades de las superficies SME que son capaces de inhibir la formación de
biofilms estructurados y exacerbar la actividad antimicrobiana de antibióticos y biocidas. Este
enfoque podría ayudar a mejorar la efectividad del tratamiento bactericida en entornos
relacionados con la salud pública (paredes y camas de hospitales y lugares sanitarios,
instrumentos quirúrgicos, sistemas de agua potable, etc.) e industriales (tuberías, filtros, tubos,
válvulas, tanques de almacenamiento, plantas de desalinización, torres de enfriamiento,
cascos de barcos, etc.). Asimismo desde el punto de vista fundamental se demostró el
importante rol de los agregados 2D de S. aureus y P. fluorescens en el incremento de la
resistencia a los agentes antimicrobianos.
AGRADECIMENTOS
Los autores agradecen al CONICET, ANPCyT (PICT 2010-1779) y a la UNLP
(proyectos I129 y X531).
REFERENCIAS
Bonapace, C. R., R. L. White, et al. (2000). "Evaluation of antibiotic synergy against Acinetobacter baumannii: a
comparison with Etest, time-kill, and checkerboard methods." Diagn Microbiol Infect Dis 38(1): 43-50.
Bullitt, R. and L. Makowski (1995). "Structural polymorphism of bacterial adhesion pili." Nature 373: 164-167.
Butler, M. T., Q. Wang, et al. (2010). "Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics."
Proceedings of the National Academy of Sciences.
CLSI (2009). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Approved standard M7-M8. Wayne,
Pa, Clinical and Laboratory Standarts Institute
Costerton, J. W., P. S. Stewart, et al. (1999). "Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections."
Science 284(5418): 1318-1322.
Cucarella, C., C. Solano, et al. (2001). "Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm
formation." J Bacteriol 183(9): 2888-2896.
Diaz, C., A. Miñán, et al. (2012). "Synergistic antimicrobial effect against early biofilm formation:
micropatterned surface plus antibiotic treatment." Int J Antimicrob Agents, in press.
Diaz, C., R. C. Salvarezza, et al. (2010). "Organization of Pseudomonas fluorescens on chemically different
nano/microstructured surfaces." ACS Appl Mater Interfaces 2(9): 2530-2539.
Diaz, C., P. L. Schilardi, et al. (2009). "Submicron trenches reduce the Pseudomonas fluorescens colonization
rate on solid surfaces." ACS Appl Mater Interfaces 1(1): 136-143.
Diaz, C., P. L. Schilardi, et al. (2007). "Nano/microscale order affects the early stages of biofilm formation on
metal surfaces." Langmuir 23(22): 11206-11210.
Donlan, R. M. (2002). "Biofilms: microbial life on surfaces." Emerg Infect Dis 8(9): 881-890.
Donlan, R. M. and J. W. Costerton (2002). "Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant
Microorganisms." Clin. Microbiol. Rev. 15(2): 167-193.
Dunne, W. M., Jr. (2002). "Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately?" Clin Microbiol Rev 15(2): 155166.
French, G. L. (2006). "Bactericidal agents in the treatment of MRSA infections—the potential role of
daptomycin." Journal of Antimicrobial Chemotherapy 58(6): 1107-1117.
Hancock, E. W. (1994). Artificial valve disease. The heart arteries and veins. R. C. Schlant, R. W. Alexander, R.
A. O'Rourke, R. Roberts and E. H. Sonnenblick. New York, N.Y., McGraw-Hill, Inc. 2: 1539-1545.
Ito, A., A. Taniuchi, et al. (2009). "Increased Antibiotic Resistance of Escherichia coli in Mature Biofilms."
Appl. Environ. Microbiol. 75(12): 4093-4100.
Korber, D. R., J. R. Lawrence, et al. (1989). "Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface
recolonization by Mot+ and Mot- Pseudomonas fluorescens." Microb Ecol 18: 1-19.
Miller, M. J. and D. G. Ahearn (1987). "Adherence of Pseudomonas aeruginosa to hydrophilic contact lenses and
other substrata." J Clin Microbiol 25(8): 1392-1397.
O'Toole, G., H. B. Kaplan, et al. (2000). "Biofilm formation as microbial development." Annu Rev Microbiol
54(1): 49-79.
O'Toole, G. A. and R. Kolter (1998). "Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas
aeruginosa biofilm development." Mol Microbiol 30(2): 295-304.
Qu, Y., A. Daley, et al. (2010). "Antibiotic susceptibility of coagulase-negative staphylococci isolated from very
low birth weight babies: comprehensive comparisons of bacteria at different stages of biofilm formation."
Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 9(1): 16.
Raad, I., W. Costerton, et al. (1993). "Ultrastructural analysis of indwelling vascular catheters: a quantitative
relationship between luminal colonization and duration of placement." J Infect Dis 168(2): 400-407.
Stewart, P. S. and J. W. Costerton (2001). "Antibiotic resistance of bacteria in biofilms." Lancet 358(9276): 135138.
Stickler, D., N. Morris, et al. (1998). "Studies on the formation of crystalline bacterial biofilms on urethral
catheters." Eur J Clin Microbiol Infect Dis 17(9): 649-652.
Toledo-Arana, A., J. Valle, et al. (2001). "The enterococcal surface protein, Esp, is involved in Enterococcus
faecalis biofilm formation." Appl Environ Microbiol 67(10): 4538-4545.
Tunkel, A. R. and G. L. Mandell (1992). Infecting microorganisms. Infective endocarditis. D. Kaye. New York,
N.Y, Raven Press 85-97.
INFLUENCE OF SUBSTRATE CHARACTERISTICS ON
ANTIMICROBIAL ACTION OF ANTIBIOTICS AGAINST BIOFILMS
OF CLINICAL RELEVANT MICROORGANISMS
Miñán Alejandro1, Díaz Carolina1, Schilardi Patricia1*, Fernández Lorenzo, Mónica1,2*
1
Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas (INIFTA), Universidad Nacional de La Plata –
CCT La Plata, CONICET, La Plata, Argentina.
2
Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de La Plata, La Plata, Argentina
E-mail: mmele@inifta.unlp.edu.ar; pls@quimica.unlp.edu.ar
Summary. Several medical devices are particularly vulnerable to bacterial biofilms formation. Biofilms are a
severe
problem
in
catheters
and
implantable
device,
and
are
also
the
cause of infection in hospitalized patients. It is well-known that bacteria living in biofilms are highly resistant to
antibiotic theraphy. The aim of this work was to evaluate the antimicrobial activity of the combined use of
submicropatterned surfaces and antibiotics (streptomycin (STP)) on early biofilms of clinical relevant
microorganisms. Staphyloccocus aureus (nonmotile, Gram positive bacteria) and Pseudomonas fluorescens
(Flagelar-mediated motile, Gram negative bacteria) were used as model bacteria for biofilms assays. Firstly, the
minimal inhibitory and bactericidal concentrations for STP were obtained with planktonic cultures.
Subsequently, the adhesion of bacteria on submicrostructured gold surfaces (SMS) with patterned features that
tune with bacterial diameter and on smooth and random nanostructured gold (NS) was assessed. Our results
confirmed that the inhibition of attachment of S. aureus and P. fluorescens cells on SMS-sustrates was 1/4 and
1/6 of those corresponding to NS-substrates respectively. Then, the STP treatment in the 1 - 4 mg/L
concentration range was assayed. Subsequently, the effectiveness of the combined strategy involving the use of
micropatterned surfaces and antibiotic treatment (SMS+STP) to reduce and/or eradicate S. aureus and P.
fluorescens biofilms was evaluated. Results for both bacteria showed a synergistic effect of SMS+STP that
yields to a reduction of at least 1000-fold in the number of the surviving biofilm bacteria with respect
to those obtained with single treatment (STP or SMS) when 4 mg/L STP was used. This study
demonstrated that the combined strategy(SMS+STP) may be a significant contribution in the
eradication of biofilms from different microorganims, including nonmotile and motile bacteria. The
important role of bidimensional aggregates increasing the resistance to antimicrobial agents was also
proved.
Keywords: Biofilm, Submicropatterned surfaces, Antibiotics, Staphylococcus aureus,
Pseudomonas fluorescens