S2-MCS06

Aspectos bioquímicos e histológicos como respuesta al estrés en el jerbo
(Meriones unguiculatus)
Coral H Gladis1, Díaz M Margarita2, Huberman W Alberto3, Aburto F Enrique4
1 Departamento de Nutrición Animal, INCMNSZ, 2Departamento de Fisiología de la Nutrición,
INCMNSZ, 3Departamento de Bioquímica, INCMNSZ, 4Departamento de Patología, Facultad
de Veterinaria, UNAM.
I. INTRODUCCIÓN
Es innegable el creciente interés por el estudio de los efectos del estrés en los
organismos vivos como consecuencia del conocimiento de que éste constituye un factor
importante en la patogenia y evolución de algunas enfermedades crónicas como las
cardiovasculares, cáncer, úlceras gástricas y duodenales, cirrosis, etc. (1). El estrés se define
como una respuesta de los organismos a condiciones adversas de origen físico o psicológico
(2). Durante el estrés se produce una sobreactivación en cascada del hipotálamo, glándula
pituitaria y glándulas adrenales, permitiendo la liberación de mayores concentraciones de
catecolaminas como la adrenalina y noradrenalina, y de corticosteroides. El corticosteroide que
se libera de forma predominante por la corteza adrenal durante un período de estrés en
humanos es el cortisol, mientras que en roedores es la corticosterona (3).
Factores como la contaminación, el consumo de alcohol, y condiciones físicas
anormales, entre otros, pueden convertirse en características crónicas causantes de estrés (4).
Dos de los factores potenciales de estrés más comunes en animales son el aislamiento social y
el peligro de convertirse en presa (5, 6).
Numerosas investigaciones in vivo, han demostrado que el estrés condiciona una
sobreproducción de especies reactivas como los singuletes de oxígeno y los radicales libres, los
cuáles provocan en los sistemas un desequilibrio bioquímico que supera la capacidad de
autodefensa de los organismos, condición conocida como estrés oxidativo (7). En condiciones
de estrés oxidativo dichos metabolitos reactivos pueden iniciar reacciones de oxidación en
cadena alterando moléculas de la membrana celular como los lípidos (generación de
hidroperóxidos), o uniéndose a las proteínas y causando daño celular hasta causar incluso
necrosis. Esta peroxidación de lípidos sobre las membranas lipídicas puede ser cuantificada
mediante la determinación de las ‘sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico’, entre las que se
encuentra con mayor abundancia el malondialdehído, por lo que un incremento en su
concentración se asocia con una disminución en la actividad antioxidante del tejido (8).
El principal objetivo de la presente investigación fue determinar los efectos del estrés en
el jerbo (Meriones unguiculatus) en cuanto a producción de corticosterona en sangre y
peróxidos lipídicos en hígado, así como su relación con posible daño hepático.
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II. METODOLOGÍA
Se utilizaron 60 jerbos machos de 6 meses de edad (Fig. 1), con un peso promedio de
86.2 ± 16.8 g, mantenidos de acuerdo con las condiciones estándares del laboratorio del
INCMNSZ, con agua y comida disponibles ad libitum.
Fig. 1. Jerbo de Mongolia, Meriones unguiculatus
70-100g, 6 meses de edad
Después de un período de aclimatación a la manipulación propia del experimento, los
animales fueron distribuídos en 10 grupos, de los cuales 9 recibieron 1.5, 3.0, 4.5, 6.0, 7.5, 9.0,
10.5, 12.0 y 18 horas de estrés, respectivamente, y un grupo testigo no recibió tratamiento de
estrés (0 h). Para estresar a los animales se utilizó el método de restricción de movimiento,
confinando individualmente a los organismos en cámaras pequeñas de igual tamaño que el
cuerpo. (Fig. 2)
Fig. 2. Cámara de confinamiento individual con restricción de
movimiento
Para el sacrificio, los animales fueron anestesiados con una mezcla de ketamina y
xilacina, se realizó punción cardiaca para sangrado al blanco y durante la necropsia se
obtuvieron los hígados para los respectivos análisis.
Se determinaron las concentraciones de corticosterona en suero como índice del grado
de estrés mediante radioinmunoensayo con 125I. Como indicador de lipoxidación en hígado se
midieron las concentraciones de malondialdehído (MDA), por el método de determinación de
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sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). El estudio histológico del hígado se realizó
microscópicamente, previa tinción con hematoxilina y eosina.
Tanto los valores de corticosterona en suero como los de MDA en hígado de los
diferentes grupos de organismos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA)
unidireccional. Para la comparación de medias se utilizó el método de Duncan y se aceptaron
como diferencias significativas cuando P<0.5.
III. RESULTADOS
El análisis estadístico demostró que el tiempo de estresamiento en los animales afectó
significativamente (p<0.05) el contenido de corticosterona en suero en el período de estudio.
Durante las primeras 1.5 horas no se observó ningún cambio (p>0.05) con respecto a los
organismos del grupo testigo (0 h); sin embargo, a partir de las 3 h existe un incremento
significativo (p<0.05) hasta un valor máximo de 143.58 ± 45.77 ng/mL a las 10.5 h, seguido por
una fuerte disminución a 45.7 ± 17.6 ng/mL a las 18 horas (p<0.01). Los animales mostraron en
todos los tiempos marcadas diferencias individuales en este parámetro.(fig.3)
Concentración de corticosterona
(ng/mL)
200
180
ab
160
140
b
b
ab
a
ab ab
ab
ab
120
c
100
80
60
40
20
0
-1.5 0
1.5
3
4.5
6
7.5
9 10.5 12 13.5 15 16.5 18
Duración del tratamiento de estrés (h)
Fig. 3. Variación de la concentración de corticosterona en suero con
respecto al tiempo de estresamiento
Los valores de MDA no presentaron aumento significativo (P>0.05) durante las primeras
3 h de estrés. De las 4.5 a 6 h se observo una disminución significativa (P<0.05) seguida de un
aumento gradual hasta las 12 h, con un valor máximo de 0.11 ± 0.02 nmol/100 mg prot (p<0.05)
y un decremento a las 18 h como se indica en la fig. 4
4
Fig. 4. Variación de la concentración de malondialdehído (MDA) en
hígado con respecto al tiempo de estresamiento.
El estudio citológico de los hígados del grupo testigo mostró pequeños cúmulos aislados
de neutrófilos. Esta observación se consideró como condición basal en dicho tejido. A partir de
las 6 h se observaron signos claros de inflamación representados por cúmulos de linfocitos y
macrófagos. A partir de las 10.5 h se observó una exacerbación de este estado con necrosis
hepatocelular en la mayoría de las láminas, signos de esteatosis, colestasis e inflamación portal
(fig. 5).
1.5h
6.0h
12.0h
18.0h
5
Fig. 5. Comparación del cambio de concentración de malondialdehído (MDA) y el daño
en hepatocitos con respecto al tiempo de estresamiento.
IV. DISCUSION
En contraste con los numerosos estudios realizados con ratas y otros mamíferos para
determinar su respuesta fisiológica al estrés, los estudios en jerbos a este respecto son aún
escasos. Sin embargo, debido a la estrecha afinidad de las características bioquímicas y
moleculares con el humano (9, 10), este modelo animal es cada vez mas utilizado en la
investigación básica. Los resultados obtenidos en este estudio representan por lo tanto una
contribución más en este campo.
La respuesta creciente al estrés en cuanto a la producción de corticosterona fue
semejante a la observada en ratas machos adultos con restricción de movimiento (11). Sin
embargo, al igual que en dicho estudio aquí se observaron fuertes variaciones individuales entre
animales del mismo tratamiento. Lo anterior muestra que en esta especie la respuesta al estrés
es tan variable como en otros modelos experimentales. En el caso de humanos y ratas se han
demostrado mediante estudios clínicos que existe fuertes variaciones individuales en la
producción de adrenalina, noradrenalina y corticosterona durante el estrés (12, 13). Los valores
de corticosterona encontrados en el presente estudio sugieren un incremento en la actividad del
eje pituitaria-glándulas adrenales desde las 1.5 h hasta las 10.5 h, bajando notablemente
después de las 12 h hasta un nivel incluso menor que en los animales sin estrés. Dicha
disminución abrupta podría obedecer a un bloqueo en la liberación de hormona corticotrópica
(ACTH) debido a una sobreproducción de corticosterona, y por consiguiente, sub-activación de
las glándulas adrenales como fue postulado en un estudio con ratas (14).
Uno de los sistemas enzimáticos de defensa más activos en el hígado que participa en
la reducción de especies reactivas es la glutation peroxidasa (GP). Si la producción de
metabolitos reactivos es superior a la capacidad de la GP, éstos se unen a las proteínas del
hígado dando inicio al daño celular (7). En dichas condiciones se producen reacciones en
cadena de radicales libres con ácidos grasos poliinsaturados formando hidroperóxidos
(radicales intensamente reactivos) y fragmentación de lípidos y proteínas celulares (15).
Las diferencias en el contenido de malondialdehido (MDA) en el hígado de los grupos de
animales estresados durante las primeras 9 h no fueron altamente significativas, mientras que
a partir de las 10.5 h hasta las 12 h si lo fueron (p<0.05). Este comportamiento sugiere una
respuesta posterior a los picos máximos de corticosterona (exhibidos a las 6 y 10.5 h) o mejor
dicho, la lipooxidación se manifiesta después del periodo de máximo estrés. Halliwell y
Gutteridge (7), sostienen que en condiciones de estrés, la oxidación de adrenalina y
noradrenalina producida puede generar radicales superóxido (O-2) y H2O2 mismos que al
reaccionar con el óxido nítrico (NO) forman el potente radical peroxinitrito (ROONO 2). De este
modo podría entenderse que en condiciones de estrés existe un aporte adicional de radicales
libres sumándose a los de origen endógeno producidos durante el metabolismo respiratorio.
Tanto el H2O2 como el ROONO2 pueden iniciar peroxidación lipídica y necrosis oncótica en
células hepáticas (16).
El estudio histológico mostró signos de daño hepatocelular desde las 6 h siendo más
frecuentes después de las 10.5 h y en asociación con el incremento de MDA. Aunque los
animales del grupo testigo presentaron escasos signos de inflamación, la característica principal
en todos los tratamientos bajo estrés fue la presencia de linfocitos (predominantemente
neutrófilos), signos de inflamación aguda, organizados en cúmulos y localizados cerca de la
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vena porta. Cuando se observó necrosis ésta fue focalizada en torno a las venas
centrolobulillares, lesión que caracteriza a la isquemia y a reacciones frente a fármacos y
tóxicos (17). Los macrófagos son células que se encargan de retirar a otras células dañadas, de
este modo la presencia dichas células especializadas en los cortes histológicos son igualmente
indicadoras de lesión en los hepatocitos. Los rasgos de colestasis y estatosis fueron
encontrados solo en dos láminas correspondientes a períodos de estrés por más de 10.5 h.
Dichas características son asociadas a alteraciones funcionales de los hepatocitos (17).
De lo expuesto se puede concluir que a diferencia del grupo testigo el estrés por restricción de
movimiento en el jerbo provoca alteración de los parámetros bioquímicos corticosterona en
suero y MDA en hígado. Dichas alteraciones bioquímicas fueron estrechamente relacionadas
con rasgos patológicos y degenerativos en el hígado, los cuales indican que este órgano es
afectado cuando existe un factor estresante.
V. REFERENCIAS
1.-Biochemestry of oxidant stress in health and disease antioxidants: endogenous and
exogenous. http://www.cellinteractive.com/ucla/nutrition_101/phys_lect7.html
2. D’Arbe M, Einstein R, Lavidis NA. Stressful animal housing conditions and their potential
effect on sympathetic neurotransmission in mice. Am J Physiol Regulatory Integrative
CompPhysiol 282: R1422-R1428; 2002
3.- Sugo Nobuo, Hurn D, Morahan B, HattoriK, Traystman R, DeVries C. Social stress
exacerbates focal cerebral ischemia in mice. Stroke, June: 160-164; 2002.
4.- Odio MR, Brodish A. Effects of age on metabolic response to acute and chronic stress. Am J
Physiol endocrinol Metab 254: E617-E624; 1988.
5.-. Calvo Torrent A, Brain PF, Martínez M. Effect of predatory stress on sucrose intake and
bahavoir on the plus-maze in male mice. Physiol Behav 67: 189-196; 1999.
6.- Lu Ziu, Song C, Ravindran AV, Merali Z, Anisman H. Influence of a phycogenic and a
neurogenic stressor on several indices of immune functioning in different strains of mice. Brain
Behav Immun 12: 7-22; 1998.
7.- Halliwell B, Gutteridge J. Free radicals in biology and medicine. United States, 1989. Second
edition. Oxford University Press.
8.-Weinberger B, Watorek K, Strauss R, Witz G, Hiatt M. Association of lipid peroxidation with
hepatocellular injury in preterm infants. Critical Care 6: 521-525; 2002.
9.- Water SM, Brodbeck RM, Steflik J, Yu J, Baltazar C, Peck A E, Severance D, Zhang LY,
Currie K, Chenard BL, Hutchinson AJ, Maynard G, Krause JE. Molecular characterization of the
gerbil C5a receptor and identification of a transmembrane domain V amino acid that is crucial
for small molecule antagonist interaction. Journal of Biological Chemistry, 280 (49): 4061740623; 2005.
7
10.- Court M, Robinson PA, Dixon MF, Crabtree JE. Gastric Helicobacter Species Infection in
Murine and Gerbil Models: Comparative Analysis of Effects of H. pylori and H. felis on Gastric
Epithelial Cell Proliferation. The Journal of Infectious Diseases, 186:1348-52; 2002.
11.- Livezey GT, Miller JM, Vogel WH. Plasma norepinephrine, epinephrine and corticosterone
stress responses to restraint in individuals male and female rats and their correlations.
Neuroscience Letters 62:51-56; 1985.
12.- Mannelli M, Gheri RG, Selli C, Turini D, Pampanini A, Giusti G, and Serio MA. A study on
human adrenal secretion. Measurement of epinephrine, norepinephrine, dopamine and cortisol
in peripheral and adrenal venous blood under surgical stress. J. Endocrinol Invest, 5:91-95;
1982.
13.- McCarty R, and Kopin IJ. Stress induced alterations in plasma catecholamines and
behaviour of rats: effects of chlorisondamine and bretylium. Behav Neural Biol, 27: 249-265.
14.- Butte JC, Kakihana R, Farnham ML, Noble EP. The relationship between brain and plasma
corticosterone stress response in developing rats. Endocrinology, 92:1775-79; 1973.
15.- Knight T, Fariss MW, Farhood A, Jaeschke H. Role of lipid peroxydation as a mechanism of
liver injury after acetaminophen overdose in mice. Toxicological Sciences 76:229-236; 2003.
16.- Radi R, Beckman JS, Bush KM, Freeman BA. Peroxynitrite-induced membrane lipid
peroxidation: The cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch Biochem Biophys.
288:481-487; 1991.
17.- Cotran RS, Kumar V, Collins T. Patología Estructural y Funcional. McGraw Hill
Interamericana, España. 6ª. Ed., 1475 pp, 2000.