Determinación de nitrógeno y proteina totales

DETERMINACION DE NITROGENO Y PROTEINA TOTALES
I. OBJETIVOS:
 Describir el proceso de determinación de nitrógeno y proteínas totales.
 Determinar la cantidad de nitrógeno de la muestra en estudio.
 Calcular la proteína total, en base a la formula correspondiente.
II. MARCO TEORICO
Las proteínas
son compuestos orgánicos
que contienen nitrógeno; son
importantes para el mantenimiento del cuerpo animal, crecimiento, desarrollo,
producción y reproducción. Un ser vivo, necesita reparar tejidos desgastados y
reemplazar proteína perdida durante el proceso metabólico.
Entre todos los compuestos químicos, las proteínas deben considerarse
ciertamente como los más importantes, puesto que son las sustancias de la vida.
Las proteínas constituyen gran parte del cuerpo animal; lo mantienen como unidad
y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda célula viva. Ellas son el material
principal de la piel, los músculos, tendones, nervios y la sangre; de enzimas,
anticuerpos y muchas hormonas.
Desde un punto de vista químico, las proteínas son polímeros grandes. Son
poliamidas y los monómeros de los cuales derivan son los ácidos -amino
carboxílicos. Una sola molécula proteínica contiene cientos, e incluso miles, de
unidades de aminoácidos, las que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El
número de combinaciones diferentes, es decir, el número de moléculas proteínicas
distintas que pueden existir, es casi infinito. Es probable que se necesiten decenas
de miles de proteínas diferentes para formar y hacer funcionar un organismo
animal; este conjunto de proteínas no es idéntico al que constituye un animal de
tipo distinto.
Las proteínas son necesarias para la formación y renovación de los tejidos. Los
organismos que están en período de crecimiento necesitan un adecuado suministro
de proteínas para su aumento de peso. Los organismos adultos que tienen su peso
estabilizado están en equilibrio dinámico, en el que sus proteínas se degradan y se
regeneran continuamente, aunque su composición permanece constante. Para ello
debe existir en la dieta un suministro regular y continuo de proteínas.
La técnica consiste en transformar el nitrógeno de la muestra en amoniaco. Ese
amoniaco lo hacemos reaccionar con una cantidad conocida de acido sulfúrico en
exceso. La parte que queda sin reaccionar de AC sulfúrico la valoramos con
hidróxido sódico (volumetría ácido-base) y así podemos saber la parte que ha
reaccionado, lo que nos informa de la cantidad de amoniaco (y por tanto la de
nitrógeno)
Lo último que debes hacer es multiplicar la cantidad de nitrógeno por un factor de
conversión (creo que 6.25, no estoy seguro) para saber la cantidad de proteína.
Este método es el más utilizado en la determinación de N orgánico. Consiste en la
descomposición con ácido sulfúrico concentrado para convertir el N combinado en
ión amonio. La solución resultante se alcaliniza y el amoniaco así generado se
destila y se recoge en solución ácida que se cuantifica por titulación. La etapa
crucial del método es la descomposición de la muestra con ác. Sulfúrico el cual
oxida el C a dióxido de carbono y el H a agua. Sin embargo el N depende del
estado de combinación que se encuentre. El N amidico o aminico se transforma
cuantitativamente en amonio. Así se averigua el % de N en la muestra. Luego se
multiplica por un factor adecuado para averiguar el contenido en proteína según se
trate
de
cereales
5,70.
Carnes
6,25.
Y
productolácteos6,38.
El problema se resuelve así:
En primer lugar has de averiguar el contenido de N en la muestra, es decir, es el
cociente entre el contenido de proteína y su factor o sea 4.25/6.38 = 0.66 %N.
Luego aplicas los equivalentes de N son iguales a los HCl gastados con lo que:
0.66=
((v-0.7)x0.1x14x100)/(1000x5.0231)
y
despejando
"v"
queda
23.84=v-0.7; v=24.55ml.
El nitrógeno total Kjeldahl es un indicador utilizado en ingeniería ambiental.
Refleja la cantidad total de nitrógeno en el agua analizada, suma del nitrógeno
orgánico en sus diversas formas (proteínas y ácidos nucleicos en diversos estados
de degradación, urea, aminas, etc.) y el Ion amonio NH4+.
Es un parámetro importante en estaciones depuradoras de aguas residuales
(EDAR) ya que mide el nitrógeno total capaz de ser nitrificado a nitritos y nitratos y,
posteriormente y en su caso, desnitrificado a nitrógeno gaseoso. No incluye, por
tanto, los nitratos ni los nitritos.
El nombre procede del método de análisis que, en esencia, digiere el agua en
condiciones ácidas enérgicas con peroxidisulfato hasta pasar todas las especies a
amonio, el cual se mide por fotometría.
Dado que el análisis de proteína cruda no suministra información alguna en cuanto
a la digestibilidad de una fuente de proteína, un procedimiento de laboratorio para
determinar la digestibilidad sería extremadamente útil.
Este es precisamente el objetivo de la prueba de determinación de la digestibilidad
por pepsina.
La pepsina es una enzima digestiva que en la presencia de un medio ácido
desdobla las proteínas del alimento.
Colocando una muestra de la materia prima que se desea analizar en una solución
que contenga pepsina y midiendo qué cantidad de proteína es digestible, podemos
estimar el valor nutritivo relativo de dicha materia prima. Es muy importante tener
presente la palabra “relativo”.
Es muy importante tener en cuenta que en el tracto digestivo existen otras enzimas
que también ayudan a desdoblar las proteínas y que las condiciones son mucho
más complejas que las que pueden simularse en un laboratorio. Por lo tanto, los
resultados de porcentaje de digestibilidad en pepsina que obtengamos mediante
este método nunca deberán confundirse con la digestibilidad verdadera de la
materia prima. Por ejemplo, supongamos que analizamos dos muestras de harina
de pescado de dos proveedores diferentes. La muestra del proveedor “A” tiene un
valor de pepsina de 80% y la del proveedor “B” sólo 70%. Esto no quiere decir que
el animal solamente será capaz de digerir 80 o 70% de estas harinas
respectivamente. Simplemente, podemos concluir que el proveedor “A” procesa
mejor sus harinas de pescado. Si el contenido de proteína cruda de las dos harinas
es similar, haremos bien en comprar el producto “A” y dejar el producto “B” para
alguien en cuyo laboratorio se realice solamente el análisis de proteína cruda (Dale,
1984).
La leche es una fuente
rica de proteínas
de alta calidad ; una deficiencia de
proteínas en el alimento, da como resultado una menor producción de leche por
animal día, asimismo animales con severas deficiencias de proteínas pierden peso
con rapidez a comienzos de la lactación y no lo vuelven a recuperar hasta el fin
de la misma.
Por lo tanto, para cubrir la demanda de proteínas, el animal necesita consumir
alimentos ricos en proteína. Las proteínas de un alimento pueden calcularse
químicamente a partir de su contenido de nitrógeno, mediante la clásica técnica
de KJELDAHL, descubierto hace más de cien años.
No todo el nitrógeno de los alimentos esta en forma de proteína, sino algunos
alimentos sobre todo los forrajes verdes contienen un tercio o mas de su
nitrógeno esta en la forma de Compuestos nitrogenados no proteicos (NNP),
como las amidas, sales de amonio, aminoácidos, etc. Debido a esta forma de
nitrógeno, la multiplicación por el factor 6.25 no proporciona el valor útil para la
proteína verdadera. El método de kejldahl
no distingue ambas formas
de
nitrógeno, por lo tanto los valores obtenidos se expresan en términos de proteína
total o proteína cruda, que representa una combinación de nitrógeno no proteico
(NNP) y el nitrógeno no proteico (NP)
Felizmente en la dieta para cerdos y aves de corral predominan los cereales y
las oleaginosas, los cuales tienen muy poco de NNP. Afortunadamente los
rumiantes
tienen millones de microorganismos
en el rumen que utilizan
eficientemente el NNP, por consiguiente, la calidad de las proteínas no tienen
tanta importancia para los rumiantes que para los monogastricos, en los que si es
necesario un balanceo de aminoácidos esenciales en las proteínas.
III. EQUIPOS , MATERIALES Y REACTIVOS:
A. EQUIPOS DE LABORATORIO:
1. Aparato de digestión kjeldahl.
2. Aparato de destilación tekator.
3. Balanza analítica o de precisión.
4. Bureta (microbureta) semiautomatica de 10 o 50ml.
B. MATERIALES:
1. Balon de kjeldahl de 100ml (digestión).
2. Balon kjeldahl de 250ml (destilación).
3. Frascos erlemmeyer de 250ml (150).
4. Pipeta cilíndrica.
5. Probeta graduada de 25, 50,100ml.
6. Piceta de agua destilada.
7. Papel filtro.
C. REACTIVOS:
1. Acido sulfúrico concentrado.
2. Selenio de sodio (selenio en polvo).
3. Catalizador (sulfato de potasio y sulfato de cobre).
4. Acido bórico al 4%.
5. Indicador de Ph (rojo azul de metilo).
6. Acido clorhidrico en solución de 0.05N.
7. Solución de hidróxido de sodio al 40%.
IV. PROCEDIMIENTO:
Se realiza en tres fases:
1. Digestión o ataque a la materia orgánica.
2. Destilación del amoniaco.
3. Titilación del borato de amonio.
1) FASE DE DIGESTION.
a) Pesar 0.2gr. de muestra seca en estudio en la balanza analítica.
b) Envolver en un papel filtro de análisis previamente tarado, asegurando del
exterior con hilo.
c) Introducir en forma de un paquete dentro de un balón de digestión kejldahl
de 100ml
d) Agregar 01gr. De mezcla catalizadora (0.05gr. de sulfato de cobre y 0.95gr.
de sulfato de potasio)
e) Se añade una pizquita de selenio en polvo (0.3 a 1gr.aprox.).
f) Adicionar por las paredes d el valón 2.5ml de acido sulfúrico concentrado.
g) Mezclar con cuidado, imprimiendo el valón un moviendo rotatorio
h) Colocar el valón en posición inclinada
sobre una de las hornillas de la
cámara digestor multi-kjeldahl, de manera que la boca del valón
quede
dentro de la correspondiente abertura del tubo de plomo, por donde serán
removidos los gases producidos durante la ebullición.
i) Dar paso a la corriente eléctrica y regular a la temperatura de forma que la
ebullición sea moderada. Esta ebullición se mantendrá durante 30 minutos
o mas si fuera necesario. Generalmente hasta media hora después de que
el liquido tome un color verde claro o azul verdoso
j) Luego se deja enfriar hasta que empiece a formar cristales.
k) En las mismas condiciones se realiza una digestión “en blanco” , o digiera a
parte el papel filtro , pero sin muestra ; esta representa también una
muestra en blanco.
2. FASE DE DESTILACION DEL AMONIACO:
Estos métodos incluyen la destilación del producto alimenticio con un
disolvente inmiscible que tiene un elevado punto de ebullición y una
densidad menor que la del agua, por ejemplo, tolueno, heptano y xileno. El
agua que se destila cae debajo del disolvente condensado en un recipiente
graduado, en el cual se puede medir el volumen de la fase acuosa. Se debe
empujar dentro del condensador un largo alambre o "gendarme", hasta cerca
del tubo de salida que facilite el escurrimiento de cualquier cantidad de agua
que pueda destilar hasta el tubo graduado. Aunque los resultados bajos son
comunes en el método de destilación, éste tiene la ventaja que una vez que
se ha montado el aparato necesita poca atención y que cualesquier aceites
volátiles que destilen, no son medidos, dado que quedan atrapados en el
disolvente inmiscible.
1. Termina la digestión y enfriarla el valón, añadir con cuidado 25ml. De
agua destilada y enfriar nuevamente.
2. Adicionar en un matraz de erlenmeyer de 250ml de capacidad, 5ml de
acido bórico al 4% y cuatro gotas de indicador y colocarlo en la parte
inferior del tubo condensador d e tal manera que el extremo del tubo de
unión quede sumergido en acido bórico.
3. Mezclar continuamente, haciendo un lavado de todos los residuos de la
muestra contenida en el valón.
4. Agregar lentamente por las paredes del balón 25ml. De agua destilada.
5. Transferir la muestra a otro balón de destilación de 250ml.
6. Colocar el balón en el
tecator y conectarlo al
aparato
de
tubo
condensador, donde se añade 25ml. De solución de hidróxido de sodio al
40% con la manivela del alcali del aparato en posición correcta.
7. Se alimenta vapor con la manivela presionando hacia abajo
8. A los pocos minutos comenzara la ebullición y destilación.
9. Destilar por tres minutos
desde el cambio de color rojo a verde
(controlar con el cronometro del destilador tekator)
10. Después de tres minutos subir la manivela hacia arriba para cortar el
vapor
11. Retirar el balón con cuidado aun lugar seguro.
12. Retirar el erlenmeyer con cuidado lavando el extremo del tubo con un
poco de agua destilada.
13. Destilar también el balón que contiene la digestión (en blanco).
3.
FASE DE TITULACION:
1. Enjuagar la bureta con al solución a utilizar para titular (HCL), antes de
ser aforada a cero, para evitar la contaminación.
2. Cargar la bureta milimetrada con acido clorhídrico al 0.05N valorado.
3. Titular el contenido del matraz de erlenmeyer con la solución de HCL
0.05N, agitando suavemente hasta que el color vire aun color violeta
(cada ml. De hasta solución que se gasta en la titulación, equivale a
1.4mg. de nitrógeno).
4. Una ves cambiada el color de la muestra contenida en el erlenmeyer,
se hace la lectura correspondiente en al bureta, cuyo dato se considera
como gasto
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO PUNO-PERU
FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
E.P.: ING. AGRONOMICA