fuentes de radicales libres de oxígeno

TEMA 16.- DAÑO CELULAR INDUCIDO POR RADICALES LIBRES. PROTECCIÓN
CELULAR.
Como se ha comentado anteriormente, dos de los mecanismos principales del daño
celular inducido por xenobióticos son:
1.- aumento de la formación de ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (radicales
libres, peróxidos, etc.), con el consiguiente estrés oxidativo. La evolución de estos procesos ha
necesitado de la evolución paralela de sistemas de protección.
2.- UNIÓN COVALENTE a macromoléculas (proteínas, polisacáridos, lípidos, ADN)
que pierden su función y expresan el daño celular.
MECANISMOS DE TOXICIDAD DE XENOBIÓTICOS
XENOBIÓTICOS
metabolitos estables
metabolitos reactivos
(tóxico último)
BIOTRANSFORMACION
GSH
uniones
covalentes
DETOXIFICACIÓN
ELIMINACIÓN
Mutación
haptenos
CANCER
RESPUESTA
INMUNE
Ca ++
alteraciones
metabólicas
peroxidación
lipídica
daño celular
NECROSIS
ESTRÉS OXIDATIVO
El estrés oxidativo es un estado de la célula en el cual se encuentra alterada la óxidoreducción intracelular, es decir el balance entre prooxidantes y antioxidantes. Este desbalance se
debe a una excesiva producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y/o por deficiencia en
los mecanismos antioxidantes, conduciendo a daño celular.
ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO.
El oxígeno es necesario para la vida, pero en determinadas condiciones, por reacciones
de naturaleza química, por acción enzimática, por efecto de las radiaciones ionizantes, etc.,
pueden producirse una serie de ROS (moléculas o radicales libres), capaces de reaccionar con
otros compuestos presentes en el organismo y, consecuentemente, llegar a producir un daño
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celular. Un radical libre (RL) es aquella especie química, cargada o no, que tiene en su estructura
al menos un electrón desapareado. Los RL son muy peligrosos porque son muy inestables y, por
tanto, tienen una vida media muy corta (tienden a aparearse robando electrones).
Los radicales libres de oxígeno (RLO) se pueden generar a nivel intra o extra celular.
Una de las principales fuentes es la cadena respiratoria.
FUENTES DE RADICALES LIBRES DE OXÍGENO
EXTRACELULARES
-
Humo de cigarrillos
Luz solar
Oxidación de drogas (CCl4)
Radiaciones ionizantes
Shock térmico
Sustancias cíclicas de
naturaleza redox (paraquat)
INTRACELULARES
- Transporte de electrones mitocondrial
- Reacciones del complejo citocromo P450 en RE
(metabolismo de xenobióticos)
- Metabolismo de ácidos grasos en los peroxisomas
- NADPH oxidasa de membrana
(especialmente en células inflamatorias)
- Subproductos de R. enzimáticas (xantina oxidasa)
- Células fagocíticas
Las ROS más importantes son:
a) Anión superoxido:
O2 + e-
b) Peróxido de hidrógeno:
2O2-. + 2H+
c) Radicales hidroxilo:
H2O2 + O2-.
O2-.
H2O2 + O2
O2 + HO- + HO.
Por otra parte, el H2O2 puede reaccionar con metales divalentes (libres o unidos a
proteínas) y producir HO. vía reacción de Fenton. El ejemplo tipo con Fe++ libre, ocurre según la
siguiente reacción:
.
H2O2 + Fe2+
Fe3+ + HO + HO
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Muchos xenobióticos, directa o indirectamente, pueden causar estrés oxidativo como
un componente de su toxicidad, al formar ROS parcialmente reducidos que son a su vez
oxidantes muy reactivos y, consecuentemente, muy peligrosos.
EJEMPLO. El citocromo c tiene una ruta de oxidación alternativa a la normal por acción del
paraquat (herbicida bipiridilo hepatotóxico). Obsérvese la formación de radicales libres.
O2
Citocromo c
2+2+)
(Fe(Fe
)
oxidasa
H 2O
Citocromo c
3+3+
(Fe(Fe
))
DESTINO MOLECULAR DEL ESTRES OXIDATIVO
Cuando las especies reactivas oxidantes superan las defensas antioxidantes se produce el
estrés oxidativo, hay daño a macromoléculas. El posible destino celular bajo condiciones de
estrés, dependerá de varios factores: el contenido endógeno de defensas antioxidantes, el grado
de estimulación de las mismas bajo la condición de estrés, la reversibilidad de las
modificaciones a macromoléculas producidas, la magnitud del estrés oxidativo y sus
consecuencias funcionales.
LOS COMPUESTOS CELULARES MÁS SENSIBLES a los efectos de estos oxidantes
son:
1. Las proteínas
2. Los lípidos insaturados
3. Los ácidos nucleicos
4. Los carbohidratos.
DESTINOS MOLECULARES DEL DAÑO OXIDATIVO
Oxidación de proteínas
grasos
(enzimas,
sistemas de transporte)
Oxidación de
ác. Nucleicos
OXIDANTE
Grupos de ácidos
poliinsaturados (membranas)
Oxidación de
carbohidratos
GSH
antioxidantes
Dienos conjugados
Ac. Grasos hidroxilados
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(mutaciones,
(ácido hialurónico,
pentano,
etano.
transformación)
sistema inmune)
A continuación, describiremos los daños por radicales libres que pueden sufrir estas moléculas.
1.- Proteínas. Las proteínas son modificadas de diferente manera por ROS. Estas, por ejemplo,
a) Pueden reaccionar directamente con el ligando metálico de muchas metaloproteínas.
Se ha comprobado que el hierro de la hemoglobina puede reaccionar con el radical superóxido o
el peróxido de hidrógeno para formar metahemoglobina. Otra importante hemoproteína
citoplasmática, la catalasa, es inhibida por el O2-., que la convierte en sus formas inactivas
ferroxi y ferrilo. Por último, el peroxido de hidrógeno, también puede reducir el Cu2+ de la
superóxido dismutasa CuZn a Cu1+, reaccionando después con él generando radical hidroxilo.
A su vez, este radical hidroxilo, ataca un residuo adyacente de histidina del centro activo del
enzima, necesario para la actividad catalítica.
b) Debido a la reactividad de los radicales libres con las moléculas insaturadas o que
contienen azufre, las proteínas con proporciones elevadas de Trp, Tyr, Phe, His, Met y Cys
pueden sufrir modificaciones de aminoácidos mediadas por radicales libres. En este sentido se
ha observado que enzimas tales como la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa o superoxido
dismutasa, que dependen de estos aminoácidos para presentar su actividad, se inhiben en
presencia de radicales libres. Las reacciones de los radicales libres con estos aminoácidos dan
lugar también a alteraciones estructurales en las proteínas provocando entrecruzamientos y
fenómenos de agregación, que se ven favorecidos por la formación de puentes disulfuro intra e
intermoleculares.
c) Los procesos de oxidación, pueden a su vez alterar la homeostasis del calcio,
probablemente como consecuencia de una disminución en la actividad de la Calcio-ATPasa en
las membranas plasmáticas secundaria a la oxidación de tioles esenciales en la proteína o por
formación de aductos covalentes. Ello supone la alteración en los procesos en los que está
implicado el calcio, como por ejemplo la contracción muscular, sistemas de transporte, etc., que
dañan gravemente las células.
d) Los enlaces peptídicos también son susceptibles de ser atacados por los radicales
libres (proteolisis). Estos enlaces pueden romperse tras la oxidación de residuos de prolina por
radicales hidroxilo o superóxido.
e) Finalmente, la reacción de los radicales libres con las proteínas también puede generar
subproductos que amplificarían el daño inicial. Un ejemplo lo constituye la oxidación del Trp
hasta H2O2.
2.- Lípidos. Los radicales libres hidroxilo e hidroperoxilo pueden reaccionar con los ácidos
grasos poliinsaturados (PUFA) de los fosfolípidos y de otros componentes lipídicos de las
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membranas para formar hidroperóxidos que pueden alterar la estructura y función de las
membranas. Los PUFA de las membranas celulares, son muy vulnerables a los ataques
oxidativos por los RLO o por ROS, puesto que contienen grupos metileno separados por dobles
enlaces que debilitan el enlace C-H metileno.
Peroxidacion lipidica:
Los fosfolípidos de membrana son muy accesibles para retirarles electrones. La
peroxidación lipídica se puede estimular por agentes generadores de RLO durante su
biorreducción, como es el caso del paraquat, ozono, Cl4C, óxidos de nitrógeno, sales de hierro,
alcohol etílico, paracetamol, etc. (iniciación de la peroxidación lipídica). Los radicales, para
completar su par electrónico, pueden reaccionar con otro radical (con lo cual ambos dejan de
serlo, terminación de la peroxidación), o bien sustraer un electrón de otra molécula (por
ejemplo, un PUFA), la cual se convierte entonces en un radical (fase de propagación). Así,
cuando se origina el radical lipídico (iniciación), sufre inmediatamente un reajuste molecular
produciéndose un dieno conjugado que puede reaccionar con el oxígeno y formar un radical
peroxilo (propagación). Este radical puede formar de nuevo un radical libre lipídico y un
hidroperóxido. Por tanto, una vez iniciada la peroxidación de lípidos, tiene lugar una reacción en
cadena de producción de radicales libres que lleva a la formación de peróxidos orgánicos a partir
de los PUFA propagándose el daño peroxidativo.
Por su parte, el hidroperóxido, que es un compuesto estable, puede entrar en contacto
con iones metálicos de transición, produciendo más radicales libres que iniciarán, y propagarán
otras reacciones en cadena, o bien sufrir procesos de ruptura (ramificaciones). Los RLO
formados con los componentes lipídicos de la membrana celular y mitocondrial son los
causantes de algunos de los efectos citotóxicos observados, como por ejemplo, el aumento de
hidrofilicidad de la membrana, lo que altera la estructura y función de la misma, inhibición
enzimática, etc. (el efecto sobre los eritrocitos es la presencia de anemia y formación de
metahemoglobina).
Por último, los productos finales del proceso de peroxidación lipídica, entre los que se
encuentran hidrocarburos volátiles, alcoholes o aldehidos, pueden difundir lejos del lugar donde
se originaron y causar edema celular e influir en la permeabilidad vascular, inflamación y
quimiotaxis. El malondialdehido, que es otro producto final de la peroxidación de ácidos grasos
con tres o más dobles enlaces, puede causar entrecruzamientos y polimerización de distintos
componentes de la membrana, alterando aún más sus propiedades.
FASES DE LA PEROXIDACION LIPIDICA
a) Iniciación:
RH + Iniciador (OH.)
R. + H2O
b) Propagación:
R. + O2
ROO.
ROO. + RH
ROOH + R.
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c) Ramificaciones:
d) Terminación:
ROOH
RO. + OH.
2ROOH
ROO. + RO. + H2O
ROO. + ROO.
O2 + productos no radicales (ceto)
RH = ácido graso insaturado
OH. = radical hidroxilo
R. = radical alilo
RO. = radical alcoxilo
ROO. = radical peroxilo
ROOH = hidroperóxido
3.- Ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos también pueden ser atacados por los radicales libres.
Realmente la citotoxicidad de estas especies químicas, en gran parte, es una consecuencia de las
aberraciones cromosómicas producidas por las modificaciones químicas que sufren las bases y
los azúcares del DNA al reaccionar con los radicales libres, especialmente con el radical
hidroxilo, con consecuencias similares a las de los agentes carcinógenos.
Las modificaciones químicas de los nucleótidos provocan, en muchos casos, la ruptura
de las hebras del DNA. Si el daño que se origina es tan grande que no puede ser reparado, se
produce una mutación, o bien, la célula muere. A continuación se muestra un esquema del daño
causado en el ADN por los radicales libres de oxígeno (se verá con más detalle en el Tema
18).
4.- Carbohidratos. Los carbohidratos son dañados por los radicales libres en menor proporción
que otras moléculas. Azúcares tales como glucosa, manitol o ciertos desoxiazúcares pueden
reaccionar con el radical hidroxilo para producir sustancias reactivas. Asímismo, los
polisacáridos pueden sufrir el ataque de los radicales libres, en este caso, fragmentándose a
unidades más sencillas (despolimerización del ácido hialurónico).
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PROTECCION CELULAR CONTRA LOS OXIDANTES
Las células de mamíferos han desarrollado sistemas de protección para minimizar el
daño resultante de la biotransformación de xenobióticos y productos oxidativos normales del
metabolismo celular.
Existen, al menos, cuatro mecanismos que contribuyen a aminorar los efectos
perjudiciales de estos oxidantes en la célula. Los tres primeros de los citados son enzimáticos y
el cuarto es no enzimático.
DEFENSAS ENZIMÁTICAS
1.- Reacción de la superoxido-dismutasa (solo en arerobios):
2O2-. + 2H+
H2O2 + O2
2.- Reacción de la catalasa (peroxidasas):
2H2O2
O2 + 2H2O
H2O2 + DH2
D + 2H2O
3.- Reacción de la glutation-peroxidasa. Es el principal sistema de protección endógeno. Tiene
3 funciones:
a) ROOH + 2GSH
b) H2O2 + 2GSH
c) Proteína-S-S-R + 2GSH
GSSG + ROH + H2O
GSSG + 2H2O
Proteína-SH + GSSG + HS-R
El GSSG formado se reduce por acción del NADPH mediante una reacción catalizada por la
glutation-reductasa:
GSSG + NADPH + H+
2GSH + NADP+
Localización de las enzimas protectoras. Las tres enzimas mencionadas se localizan en
distintos sitios intracelulares y parecen desempeñar funciones complementarias entre sí. La
catalasa se encuentra predominantemente en los peroxisomas y mitocondrias La glutationperoxidasa en lisosomas, mitocondrias y citosol, pero no en peroxisomas. La superoxido
dismutasa en el citosol, aunque existe una segunda forma que también aparece en las
mitocondrias (espacio intermembranal).
DEFENSAS NO ENZIMÁTICAS
4.- Antioxidantes. Diversos compuestos naturales tienen la capacidad de reaccionar con los
radicales libres sin generar nuevos radicales. Algunos ejemplos son el tocoferol (vitamina E) ,
ácido ascórbico (Vit. C), selenio y el ß-caroteno (Vit. A).
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EL GLUTATION COMO AGENTE PROTECTOR
Las células de mamíferos han desarrollado un sistema de protección para minimizar el
daño resultante de la biotransformación de xenobióticos y productos oxidativos normales del
metabolismo celular. Este sistema es dependiente de glutation. El glutation es un tripéptido (glutamil-cisteinil-glicina) con gran facilidad para ceder electrones debido a su grupo sulfhidrilo
(-SH). Es un importante antioxidante en fase acuosa y un cofactor esencial de enzimas
antioxidantes. Da protección también a la mitocondria contra radicales de oxígeno endógenos.
En las células se encuentra a concentraciones elevadas (del orden de mM), principalmente en el
hígado (10 mM), lo que contribuye a su gran poder reductor. La disminución de GSH conduce a
la muerte celular y ha sido descrita en muchas condiciones degenerativas. Las dos funciones
principales son:
a) Como basurero nucleofílico de muchos compuestos y sus metabolitos, vía mecanismos
químicos y enzimáticos, convirtiendo centros electrofílicos en uniones tioeter.
b) Como sustrato en el metabolismo de hidroperóxidos (mediado por GSH peroxidasa) a los
correspondientes alcoholes.
EL GLUTATION COMO AGENTE PROTECTOR
Acidos mercaptúricos
Glutamato
Cisteína
Acetil-CoA
Glutamilcistein sintasa
Conjugados tioester
Glicina
Glutation sintasa

GSH-transferasas
DEM
CDNB
NADP+
Glutation
reductasa
Glutation reducido
GSH
NADPH
Glutation oxidado
GSSG
H2 O2
Glutation
oxidasa
 2H2O
En determinadas situaciones, como por ejemplo el ayuno, se incrementa la toxicidad de
algunos xenobióticos al disminuir la disponibilidad de aminoácidos, como metionina,
importante para la formación de cisteína (componente del glutation).
Las principales funciones de las células relacionadas con el poder reductor del GSH son
las siguientes:
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Síntesis de
proteínas y
DNA
Protección
celular/antioxidante
Conjugación de
xenobióticos en hígado
Crecimiento y
división
celular
Poder
reductor
del GSH
Resistencia a UV,
Protección lente/córnea
Reacciones de
reducción metabólica
Síntesis de
leucotrienos
Regulación de
enzimas-SH
PROCESOS PATOLÓGICOS RELACIONADOS CON LAS ROS
La citotoxicidad provocada por los RL, origina una amplia patología, de manera que se
han relacionado con RL las siguientes enfermedades y procesos clínicos:
Envejecimiento, Alzheimer, aterosclerosis, procesos autoinmunes, cáncer, cataratas, dermatitis
de contacto, gota, enfermedades inflamatorias, malaria, esclerosis múltiple, pancreatitis,
Parkinson, artritis reumatoide, demencia senil, talasemias y colitis ulcerosa.
En vista de todo ello, se hace necesario un mejor conocimiento de estos metabolitos tan
reactivos y su papel en el organismo. Solo así se podrán encontrar tratamientos eficaces para
curar estas enfermedades.
La acumulación de especies de oxígeno reactivas (ROS), es uno de los factores que
contribuyen a la senescencia celular, el acortamiento de telómeros, daño al ADN e
inestabilidad genómica. Lo anterior ha generado un gran interés en su estudio, en particular
para analizar su participación en la carcinogénesis, infertilidad, ateroesclerosis y otras
condiciones patológicas, así como en el proceso de envejecimiento.
ESPECIES REACTIVAS DEL NITRÓGENO (ERNs)
Las principales ERNs son el óxido nítrico (NO.) y el peroxinitrito (ONOO-.)
considerado como uno de los más potentes oxidantes biológicos. Las ERNs pueden dañar y
matar células por distintos mecanismos: inactivación de los distintos complejos de la cadena
respiratoria, daño a proteínas y a lípidos, inhibición de síntesis proteica o de ADN, depleción
de GSH o de ATP entre otros.
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La principal fuente de NO, en células de mamíferos, es la oxidación enzimática de Larginina por una NO sintasa dependiente de calcio.
Arginina + ½NADPH + 2O2
NO + citrulina + 2H2O + 1½NADP+
El NO. es una molécula de señal ubicua, que funciona en la regulación de distintos
procesos en los sistemas nervioso, cardiovascular e inmune. Está asociado a procesos
inflamatorios neurotóxicos y de isquemia/reperfusión. El NO difunde desde su célula de
origen a las células vecinas ya que es suficientemente apolar para cruzar las membranas
plasmáticas sin un transportador. En la célula diana activa el enzima citosólico guanilil
ciclasa, que cataliza la formación del segundo mensajero cGMP. En el corazón el cGMP
ocasiona contracciones menos enérgicas al estimular la bombas (o bombas) de iones que
expulsan Ca2+ del citosol. El NO es inestable y su acción es breve, segundos después de
formarse sufre una oxidación a nitrito o nitrato. Los nitrovasodilatadores producen una
relajación continua del músculo cardíaco ya que tardan varias horas en degradarse,
produciendo una corriente continua de NO (nitroglicerina para tratamiento de la angina,
1860). Se ha propuesto también que el NO. actuaría induciendo la producción mitocondrial de
peroxinitrito. Este produciría a su vez la inhibición del complejo I de la cadena respiratoria
(NADH:Ubiquinona reductasa), lo cual tiene un efecto crítico sobre el suplemento de energía
en varios tejidos y sobre la producción de EROs. Este daño irreversible de la cadena de
transporte mitocondrial sería el responsable, en parte, de la muerte neuronal observada en
procesos neurodegenerativos asociados a la enfermedad de Parkinson y al Alzheimer.
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