ANALISIS INSTRUMENTAL TALLER DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA Y GASEOSA 1. Lea cuidadosamente el siguiente párrafo y a partir de este responda las preguntas que se encuentran al final del texto en una tabla. Las condiciones cromatográficas empleadas para realizar el análisis por el método de la USP 27, 2004, son las siguientes: un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 254 nm, un dosificador de 100 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realiza isocráticamente sobre una columna Lichrospher 100, RP-8, 250 x 4mm, (5 µm). La fase móvil consiste en una mezcla filtrada y desgasificada de 3 componentes:agua destilada:metanol:acetonitrilo (40:30:30), con una velocidad de flujo de 1,0 mL/min.1 TIPO DE COLUMNA ESPECIFICACIONES DE LA COLUMNA FASE MOVIL FLUJO TIPO DE ELUCION: ISOCRATICO O POR GRADIENTE EQUIPO UTILIZADO DETECTOR 2. Lea cuidadosamente el siguiente párrafo y a partir de este responda las preguntas que se encuentran al final del texto. En el desarrollo del método analítico alternativo, se emplea un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 254 nm, un dosificador de 200 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realiza isocráticamente sobre una columna Lichrospher 100, RP-18, 250 x 4mm, (5 µm). La fase móvil consiste en una mezcla desgasificada de solución de fosfato de amonio anhidro dibásico a pH= 8,0:metanol:tetrahidrofurano (62:50:13) con una velocidad de flujo de 1,5 mL/min. 1 TIPO DE COLUMNA ESPECIFICACIONES DE LA COLUMNA FASE MOVIL FLUJO TIPO DE ELUCION: ISOCRATICO O POR GRADIENTE EQUIPO UTILIZADO DETECTOR 3. Dé ejemplos de los solventes típicos y columnas usados en cromatografía líquida de fase inversa (RP‐HPLC) y fase normal (NP‐HPLC) 4. ¿Cuáles son las ventajas de realizar una elución en gradiente en HPLC? Porqué realiza siempre un gradiente de menor a mayor fuerza del eluyente y no a la inversa? 5. Diga qué modo de cromatografía usaría para separar los componentes de una mezcla en los siguientes casos: a) moléculas neutras de bajo peso molecular (< 2000) solubles en hexano b) moléculas neutras de bajo peso molecular (< 2000) solubles en metanol c) moléculas iónicas de bajo peso molecular (< 2000). 6. Qué es Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia? 7. Tipos de Cromatografía Líquida: 8. Diagrama Básico de un sistema de HPLC 9. Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLC: al menos 3 10. Los detectores más utillizados en HPLC y en cromatografía gaseosa son: 11. Defina: Cromatografía de exclusión por tamaño, Factor Capacidad, Tiempo Muerto, Tiempo de Retención, Selectividad, fase estacionaria, fase móvil, cromatograma, línea base, tiempo muerto, volumen de elución, cromatografía quiral, tiempo de retención ajustado(corregido) 12. Que tipo de moléculas eluyen en último lugar en Cromatografía de exclusión por tamaño 13. Ventajas de la cromatografía gaseosa con relación a la cromatografía de alta eficiencia 14. Para separar una mezcla de proteínas se utiliza una columna que posee una fase estacionaria de celulosa carboximetilada. El diámetro interno de la columna es de 0.75 cm y su longitud de 20 cm. El flujo de la fase móvil está regulado a 1 mL/min. Se trata de una fase aniónica o, por el contrario, de tipo catiónico? 15. El solvente recorre una columna en 3.0 min pero el soluto requiere 9 minutos. Calcular el factor de retención, k. 16. Determinar el porcentaje de ceftriaxona base en cada ampolla utilizando cromatografía liquida de alta resolución. A continuación se describe la preparación de la muestra y el estándar. El estándar utilizado es ceftriaxona base y se preparó de la siguiente manera: se pesan 21.2 mg del 82.4 de pureza y se diluyen con fase móvil hasta completar un volumen de 100 mL. Muestra: Se utilizan 5 viales y se llevan a un volumen de 250 mL con fase móvil y posteriormente se realiza una dilución de 1 mililitro en 50 mL (cada vial tiene 500 mg de ceftriaxona base). Procedimiento se inyectan cantidades iguales de muestra y estándar por separado y por triplicado. A continuación se presenta una tabla con los resultados obtenidos. MUESTRA ESTANDAR AREA PROMEDIO 11149.5 9919.19653 Que consideraciones debe tener en cuenta para realizar el respectivo calculo y además exprese si los resultados son confiables. 17. Determinar el porcentaje de glibenclamida en cada tableta utilizando cromatografía liquida de alta resolución. A continuación se describe la preparación de la muestra y el estándar. El estándar utilizado es glibenclamida y se preparó de la siguiente manera: se pesan 10.7 mg del 99.2 de pureza y se diluyen con fase móvil hasta completar un volumen de 25 mL. Muestra: Se utilizan 10 tabletas se disuelven con fase móvil y se llevan hasta completar un volumen de 100 mL (cada tableta tiene 5 mg de glibenclamida). Procedimiento se inyectan cantidades iguales de muestra y estándar por separado y por triplicado. A continuación se presenta una tabla con los resultados obtenidos. Que consideraciones debe tener en cuenta para realizar el respectivo calculo y además exprese si los resultados son confiables. MUESTRA ESTANDAR AREA PROMEDIO 1490716.64 1479028.25 18. En la determinación de polisacáridos (almidón), compuestos con un peso molecular muy elevado, es necesario eliminar previamente restos de glucosa (C6H12O6) y sacarosa (C12H22O11). Estos compuestos son hidrosolubles. a) ¿Qué tipo de separación cromatográfica se debe realizar? b) ¿Qué características tiene la fase estacionaria que se utiliza durante esta separación? 19. Al laboratorio llegó una muestra de aceite esencial de eucalipto para la separación, identificación y cuantificación de 6 tipos de monoterpenos, los cuales son compuestos orgánicos volátiles. En el laboratorio disponemos de los siguientes equipos y reactivos. Seleccione los indicados para este tipo de análisis. Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC) Cromatógrafo gaseoso Columna capilar de 50 m Columna de fase reversa (RP) Superspher 100 RP-18 Gas portador, hidrógeno (fase móvil) Fase estacionaria líquida soportadas en un sólido inerte Termostato (Horno) Fase móvil polar, MeOH-agua (50:50) Columna de fase normal (NP) LiChrosorb Si 60 20. A un laboratorio de ensayos clínicos llegó una muestra de sangre que tenía las siguientes hormonas: prednisolona, testosterona, metiltestosterona y progesterona. La muestra fue procesada y se obtuvo una disolución que contenía a estas hormonas, las cuales son compuestos orgánicos no polares. Si usted dispone en el laboratorio de los siguientes equipos y reactivos químicos. Seleccione las condiciones de trabajo necesarias para realizar la separación, identificación y cuantificación de estas sustancias. Cromatógrafo de Gas Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC) Columna de fase normal (NP) LiChrosorb Si 60 Columna de fase reversa (RP) Superspher 100 RP-18 Fase móvil polar, AcN-agua (50:50) Fase móvil apolar, n-Heptano/Dioxano (98:2) Columna capilar Termostato (Horno) 21. Los siguientes datos corresponden a una columna para Cromatografía de líquidos. Longitud del relleno =24,7 cm; Caudal =0,313 mL/min; Vm = 1,370 mL y Vs = 0,164 mL. El cromatograma de una mezcla de compuestos A, B, C y D proporciona los siguientes datos: Tiempo de retención (tR), min. Anchura del pico en la base (W), min No retenido 3,1 - A 5,4 0,41 B 13,3 1,07 C 14,1 1,16 D 21,6 1,72 Calcule: El factor de retención para cada compuesto La resolución.para (By C) y (CyD) El factor de selectividad, para (By C) y (CyD) FORMULAS t’r = t r – t m = (t’r2 / t’r1) = (k2 /k1) k = (t r - tm )/ tm = (Vr - Vm )/ Vm Convenciones Tiempo de retención ajustado = t’r Tiempo muerto = tm Tiempo de retención = tr Retención relativa = Factor de retención ó de capacidad = k Volumen muerto = Vm Volumen de retención = Vr