CITOGENÉTICA

CITOGENÉTICA
La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la estructura,
función y comportamiento de los cromosomas. Incluye análisis de bandeado G en
cromosomas, otras técnicas de bandeado citogenético, y también la citogenética
molecular de hibridación por fluorescencia in situ (FISH) e hibridación por genómica
comparativa (CGH).
TÉCNICA (para sangre periférica)
La muestra deben ser 5ml de sangre venosa recogida en tubo con anticoagulantes de
heparina de litio. Se coge la capa de leucocitos.
1. Identificación de la muestra.
Se debe identificar el tubo y la historia clínica dándole un número de registro.
2. Observación de la muestra.
El paciente no debe haber sido transfundido en los últimos 2 meses. La extracción debe
hacerse en ayunas (preferiblemente). Anotar en el mismo cuaderno, el día de la siembra
y si el cultivo va a ser de 48 o 72 horas.
3. Preparación de la muestra.



Centrifugar la muestra durante 5 min a 1000 r.p.m.
Si la muestra está turbia ó muy icterica hay que realizar un lavado con
suero fisiológico, volviendo a centrifugar y decantando el sobrenadante
del lavado.
Preferiblemente hay que pasar a la fase de siembra en las primeras 24
horas, si no es posible debe mantenerse la muestra a 4º C en la nevera.
4. Preparación de medio de cultivo RPMI.
El medio RPMI se debe suplementar, por cada 100ml de medio RPMI se añade:




11 ml de suero bovino fetal al 20% (para enriquecer el medio).
0.75 ml de penicilina al 2% (para evitar la contaminación).
1ml e glutamina al 2% (aa esencial para el crecimiento celular).
1.5 ml de buffer hepes (para mantener el pH del medio).
5. Siembra y cultivo.
En campana estéril, y para cada cultivo coger 2 tubos de 10 ml (específicos para
cultivo), identificar cada tubo con el número de registro y en uno de ellos se debe de
poner Be (bromuro de etidio, se le añade para obtener cromosomas con más bandas).


Añadir a cada tubo 5 ml de medio.
Echar 0.5 ml de muestra en cada uno de los tubos.
 Añadir 0.15 de fitohemaglutina PHA (mitógeno de linfocitos T).
Homogeneizar, poner el tapón y colocarlos en una gradilla inclinada. Meterlos en la
estufa de cultivos a 37º C durante 72 horas; cada día se deberan mover suavemente.
6. Sacrificio/Extracción del cultivo.
A las 72 horas de cultivo:






Añadir a cada tubo 0.25 ml de Colcemid (para la división celular en la
metafase). Además, al tubo de Be se le añadirá 0.1 ml de bromuro de
etidio.
Sacar los tubos de la estufa y centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min;
decantar sobrenadante con una pipeta Pasteur dejando 1 ml.
Añadir a cada tubo 5 ml de solución de KCl y ponerlos durante 18 min al
baño (37º C). Es para realizar un choque hipotónico, para que las células
se hinchen.
Centrifugar a 1300 r.p.m. durante 10 min; decantar el sobrenadante con
una pipeta evitando tocar el pellet celular.
Preparar la solución fijadora Carnoy en l momento (metanol/ac acético,
en proporción 1:3).
Realizar con la solución de Carnoy 4 lavados del pellet, cada uno
seguido de centrifugación y decantado. En el último lavado, se decanta y
resuspende el botón manualmente, añadiendo 1-2 ml de Carnoy,
dependiendo del tamaño del pellet celular.
7. Extensiones en portaobjetos.


Impregnar el portaobjetos con una solución fijadora de Ac acético al
45%.
Realizar la extensión “tirando” la gota de muestra.
8. Visualización microscópica de las preparaciones para su clasificación.
Con el microscopio y objetivo de 10X, se verifica la calidad de las preparaciones. Una
buena preparación debe tener un número suficiente de metafases bien extendidas y
libres de citoplasma. Influye la temperatura, la humedad y el choque hipotónico. La alta
temperatura y la humedad favorecen las buenas extensiones, así como la altura desde la
que se realiza la extensión.
Una vez realizadas las extensiones, se colocan a 37º C en estufa. Se dejan envejecer 1
semana aproximadamente, hasta su posterior tinción.
9. Tinción de las muestras.
Una vez que las extensiones han envejecido en la estufa se procede a tratarlas para su
posterior análisis.
 Se coloca el porta en una solución de sales de citrato de sodio durante 10
min.
 Se lavan con agua y se sumergen en tripsina durante 6 seg y se vuelven a
lavar.


Y se tiñen durante 1,5 min. El colorante se prepara con una mezcla de 2
ml de Wrigh, 3 ml de Sorensen y 3 ml de buffer.
Se lavan, se dejan secar y se meten en xilol para limpiar la preparación
de posibles residuos.
10. Análisis de la muestra.









Se mira la preparación en el microscopio con el objetivo de 10X.
Cuando se encuentra una metafase abierta se cambia de objetivo al de
100X con aceite de inmersión.
Se deben observar del orden de 15-30 metafases para ver si existe alguna
alteración.
Cuando vayamos encontrando las metafases vamos apuntando en una
hoja las coordenadas para luego encontrarlas en el cytovisión.
En el cytovisión se coloca el porta y se pone en las coordenadas que
hemos apuntado antes.
Se mira con el microscopio de contraste de fases con el objetivo de 10X
y después con el de 100X.
Con un programa informático se hace una foto a lo que hay en el porta y
se ajusta la luz hasta que se vean claramente los cromosomas y sus
bandas.
El cariotipados se encarga de realizar un agrupamiento automático, pero
no todos los cromosomas se agrupan correctamente, es entonces cuando
los tenemos que colocar manualmente.
Una vez realizado el cariotipo se imprime y se lleva a los médicos
correspondientes.
Los cromosomas se clasifican en 7 grupos, de la A a la G, atendiendo a su longitud y a
la posición del centrómero. De esta manera, el cariotipo humano queda formado así:

Grupo A: Se encuentran los pares cromosómicos 1, 2 y 3. Se caracterizan
por ser cromosomas muy grandes, casi metacéntricos. En concreto, 1 y 3
metacéntricos; 2 submetacéntrico.
 Grupo B: Se encuentran los pares cromosómicos 4 y 5. Se trata de
cromosomas grandes y submetacéntricos (con dos brazos muy diferentes
en tamaño).
 Grupo C: Se encuentran los pares cromosómicos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X.
Son cromosomas medianos submetacéntricos.
 Grupo D: Se encuentran los pares cromosómicos 13, 14 y 15. Se
caracterizan por ser cromosomas medianos acrocéntricos con satélites.
 Grupo E: Se encuentran los pares cromosómicos 16, 17 y 18. Son
cromosomas pequeños, metacéntrico el 16 y submetacéntricos 17 y 18.
 Grupo F: Se encuentran los pares cromosómicos 19 y 20. Se trata de
cromosomas pequeños y metacéntricos.
 Grupo G: Se encuentran los pares cromosómicos 21, 22, Y. Se
caracterizan por ser cromosomas pequeños y acrocéntricos (21 y 22 con
satélites).
Mediante el cariotipado se pueden analizar anomalías numéricas y estructurales, cosa
que sería muy difícil de observar mediante genética mendeliana.
Cariotipo de un hombre: 46 XY