DILUCIONES Si se sospecha que una muestra tiene una gran cantidad de microorganismos por mL o gm, la muestra se diluye. Al diluir lamuestra antes de hacer la prueba, se evita que las placas tengan exceso de colonias, permitiendo obtener diluciones con un número de colonias entre 25 y 250 CFU/ml o gm. El plan de dilución que más frecuentemente se utiliza envuelve diluir la muestra por un factor de 10. La muestra se diluye con una solución salina estéril, 0.85% NaCl of 0.1% peptona. Usualmente en este laboratorio se utilizan botellas de dilución con un volumen de 90 ó 99 ml. 1 1. La muestra ya sea sólida o líquida se considera que tiene un factor de dilución de 100 ó 1 (no-diluída). 2. Si el diluyente tiene 90 ml de solución estéril, para hacer una dilución 1/10, transfiera 10 ml ó 10 gm al blanco. Esta es la dilución 10-1. 3. Continue haciendo las diluciones necesarias. Para diluciones utilizando un volumen de 99 ml de diluyente, puede añadir 11 ml para hacer solución de 10-1 ó 1 ml para hacer dilución 10-2. El mismo procedimiento aplica al poner la muestra en placa. Si se toma 1 ml de muestra del la dilución 10-3 y se añade agar, tienes la misma dilución en la placa que tienes en el tubo. Si transfieres 0.1 ml de la muestra de la botella de dilución y le viertes agar, has procedido a hacer una próxima dilución (0.1 ml de la dilución 10-3 en la placa se convierte en la dilución 10-4). REPORTE DE RESULTADOS Cuando se contabilizan las placas, es importante seguir las siguientes reglas. Debes incluir: Dos cifras significativas Factor de dilución CFU / ml ó CFU / gm Contaje estándar de placa (SPC) ó contaje estimado estándar de placa (ESPC) SOLO SE REPORTA UN CONTAJE POR MUESTRA, NO POR DILUCION. Cuando se calculan los resultador de placas en duplicado se reporta la media geométrica (promedio). En la práctica, se utiliza el promedio para reducir estadísticamente las muestras que se salen del centro así como para encontrar el contaje de placa promedio cuando se trabaja con un gran número de placas. PLACAS NORMALES: CONTAJE ESTANDAR DE PLACAS (SPC) Primero, anote la dilución de la placa que está contando. Luego cuente las colonias que aparecen en la placa. Anote los resultados de las placas que tengan entre 25 a 250 colonias. Incluya las colonias pequeñas cuanto reporte sus resultados. Para reportar los resultados, promedie los contajes de placas en duplicado. Ajuste para 2 cifras significativas. Incluya el factor de dilución y reporte como “CFU/gm ó CFU/ml” SPC. Muestra Placa 100 10-1 10-2 Leche pausterizada A TNTC 243 22 B TNTC 236 18 Contaje reportado 2.4 x 103 CFU/ml SPC 2 En el ejemplo anterior, no puedes utilizar los resultados de la dilución 10-2 porque el número de colonias en una de las placas está fuera del rango 25-250. Sin embargo sería acceptable reportarlos como estimado (2.0 x 104 CFU/ml ESPC). PLACAS CON MUCHAS COLONIAS: CONTAJE ESTIMADO DE PLACA ESTANDAR Puedes estimar el contaje de varias formas. Si utilizas un contador de colonias, el sistema de rejillas divide la placa en 56 áreas iguales. Escoge un area representativa de la placa y haz un estimado contando por lo menos 6 cuadrados. Saca el promedio de los cuadrados y multiplica por el factor de dilución. De nuevo, promedia los resultados de las placas duplicadas y ajusta a dos cifras significativas. Incluye el factor de dilución y reporta los resultados como “CFU/g ó CFU/ml”ESPC. Muestra Placa 100 10-1 10-2 Ensalada de papas A TNTC TNTC TNTC B TNTC TNTC TNTC Estimado Contaje reportado De 10-2 4.4 x 104 CFU/ml 412 ESPC 478 PLACAS CON POCA DENSIDAD: CONTAJE ESTIMADO DE PLACA ESTANDAR Para placas con contajes bajos, existen dos opciones al reportar los resultados. El primero es contar las colonias y reportarlas como ESPC. La otra situación es cuando no hay colonias en una placa. En este caso el contaje se reporta como “<”que la dilución más baja. CONTAJES BAJOS Muestra Ensalada de papas Placa A 100 12 10-1 0 0 B 6 0 0 Placa A 100 0 10-1 0 0 B 0 0 0 10-2 Contaje reportado 9.0 x 100 CFU/ml ESPC 10-2 Contaje reportado <1.0 X 102 CFU/ml ESPC NO-CRECIMIENTO Muestra Ensalada de pasta 3 OTROS CASOS Crecimiento esparcido: Cuando ambas placas tienen crecimiento esparcido, reporte comjo SPR. Accidente de laboratorio: En el caso de accidentes de laboratorio reporte como tal: LA. Universidad de Puerto Rico Recinto Universitario de Humacao Departamento de Biología Dra. Esther Z. Vega Problemas de práctica de diluciones 1. 1 ml de cultivo de bacterias se diluye con 9 ml de peptona. 1/10 de ml de está dilución se diluye en 9.9 ml de peptona. De ésta dilución 1/10 de ml se pone en una placa con 25 ml de medio. Luego de 24 horas de incubación se contaron 219 colonias. ¿Cuántas células había en el cultivo original? Muestra todo tu trabajo. ¿Tendrá efecto la cantidad de medio de la placa? 2. Cinco gramos de yogurt se mezclan con 45 ml de agua de peptona. Se hacen dos diluciones sucesivas de 1/100. 1/10 de ml se pone en placa de la última dilución. Esto se hace en duplicado. Luego de incubar se obtienen los siguientes resultados: 75 CFU y 73 CFU. Calcula el número de CFU/gm de yogurt. 3. a. La muestra consiste de 10 ml de una dilución de 10-1 de jugo de repollo. La asignación es hacer contaje total de placa aeróbica, tal que cada placa es inoculada con 0.1 ml. Se hacen en placa las siguientes diluciones: 10-2, 10-3, 10-4 y 10-5. Haz un diagrama del procedimiento indicando las cantidades de diluyentes e inóculo a utilizar. b. Si se obtienen 120 colonias en la placa inoculada con 0.1 ml de la dilución 10-2, ¿cuál sera el CFU/ml en el jugo de repollo sin diluir? 4. Se esperaría el mismo # de CFU en 10 ml de la dilución 10-2 de hamberguer que en _______ gm de la muestra sin diluir. 4 5. Un gramo de yogurt se añade a 99 ml de agua de dilución. Se hacen cuatro diluciones de 1/10 y se pone en duplicado en placa 1/10 de ml en PCA. Luego de inucuban y se obtiene los siguientes resultados: Dilución hecha de yogurt Dilución inicial Primera dilución 1/10 Segunda dilución 1/10 Tercera dilución 1/10 Cuarta dilución 1/10 CFU/ml TNTC, TNTC TNTC, TNTC 442, 432 52, 48 7, 3 Utilizando estos datos, calcula el número de CFU/gm de yogurt. 5