IA-MBA-PT-008 Recuento Total Aerobio

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1. Objetivo
Disponer de un método para realizar un recuento total de microorganismos mesófilos aerobios.
2. Alcance
Para aplicar en muestras de alimentos.
3. Responsabilidad y autoridad
Jefe de Sección: debe velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento.
Analistas de laboratorio: deben realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento.
4. Definiciones
No aplica
5. Abreviaturas y/o Siglas
ufc: unidad formadora de colonia
6. Referencias y/o Bibliografía
AOAC Official Method 990.12: Aerobic Plate Count in Foods, Dry Rehydratable Film Method (3M Petrifilm
Aerobic Plate Count)
AOAC Official Method 986.33: Bacterial and Coliform Counts in Milk, Dry Rehydratable Film Method (3M
Petrifilm Aerobic Plate Count)
AOAC Official Method 989.10: Bacterial and Coliform Counts in Dairy Products, Dry Rehydratable Film
Method (3 M Petrifilm Aerobic Plate Count)
Instrucciones 3M Petrifilm Recuento Aerobio
IA-MBA-PE-009-RE- 008 Hoja de trabajo
IA-MBA-PE-009-RE- 019 Hoja de trabajo- Análisis de lácteos
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7. Descripción del procedimiento
7.1 Fundamento Teórico
Diluciones seriadas de la muestra son sembradas en las placas Petrifilm de Conteo Aerobio, que es un
medio de cultivo deshidratado listo para usar , el cual tiene elementos nutritivos, un agente gelificante
soluble en agua y un indicador de tetrazolio que facilita la enumeración de las colonias, las cuales
adquieren un color rojo.
7.2 Equipo, materiales y medios de cultivo
7.2.1 Equipo
Incubadora 32 °C ± 1 °C
Incubadora 35 °C ± 1 °C
Balanza sensibilidad ± 0,1 g
Contador de Colonias Quebec
Stomacher
Vortex
7.2.2 Materiales
Termómetro -5 °C a 15 °C
Bolsas plásticas para stomacher 7 ½ x 11 ¾ pulg (ancho x largo) con cierre de alambre
Pipetas estériles de 1 ml o 2 ml
Esparcidor de Petrifilm
7.2.3 Medios de cultivo
Placas de Petrifilm 3M para recuento aerobio
Buffer Butterfield
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7.3 Procedimiento
Para muestras lácteas:
7.3.1
Mantener las muestras y el control de temperatura de la muestra en hielera (0-4,4°C) mientras se
realiza el análisis. En muestras fluidas tomar la temperatura de la muestra control insertando un
termómetro, previamente enfriado, dentro de la muestra, la temperatura debe estar entre 0 °C a
4,4 °C.
7.3.2
Para muestras líquidas, se debe agitar la muestra 25 veces en 7 segundos en un arco de 30 cm
antes de tomar la alícuota para realizar el análisis.
7.3.3
Para leche deshidratada se debe remojar la muestra por inversión y luego dejar reposar por 2
minutos. Luego agitar 25 veces en 7 segundos en un arco de 30 cm, antes de tomar la alícuota
para realizar el análisis.
7.3.4
Para la leche cruda, sin tocar los bordes del recipiente de la muestra, tomar 1 ml y depositarlo
en una botella de 99 ± 1 ml para una dilución 1/100 (10-2). Agitar la botella 25 veces en 7
segundos en un arco de 30 cm. A partir de esta dilución tomar 11 ml y agregar en botella de 99
ml de buffer de dilución, para una dilución 1/1000 (10.-3).
7.3.5
Para productos procesados líquidos hacer la dilución 1/10, para esto tomar 11 ml de la muestra y
agregar a 99 ml de buffer de dilución. Preparar la dilución 1/100 (10-2); tomar 11 ml de la dilución
1/10 en 99 ml de buffer de dilución.
7.3.6
Para productos procesados sólidos, pesar 11 g de muestra, agregar 99 ml de buffer Butterfield
para obtener la dilución 1/10 luego agitar la dilución 25 veces en 7 segundos en un arco de 30 cm.
Preparar la dilución 1/100; tomar 11 ml de la dilución 1/10 en 99 ml de buffer de dilución.
7.3.7
A partir de las diluciones anteriores y sin pasarse de los 3 minutos después de la agitación,
sembrar placas de Petrifilm Conteo Aerobio rotuladas con la identificación de la muestra, dilución y
la fecha del análisis , seguir con el apartado 7.3.14 al 7.3.16
7.3.8
Mientras se realiza el análisis se debe llevar control de esterilidad del ambiente, de pipetas y del
buffer de dilución utilizado.
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Para otros alimentos (pescado, mariscos, carnes, embutidos):
7.3.9
En una bolsa de stomacher estéril, pesar 25 gramos de la muestra.
7.3.10 Agregar 225 ml de buffer Butterfield para realizar una dilución 1/10 (10-1)
7.3.11 Homogenizar en stomacher por 2 minutos.
7.3.12 Hacer diluciones seriadas de la muestra, tomar 1 ml de dilución 10-1 y agregar a un tubo de 9 ml
de buffer Butterfield para obtener una dilución 10-2, realizar así sucesivamente dilución hasta 10-6
(esto según el tipo de alimento )
7.3.13 A partir de las diluciones anteriores y sin pasarse de los 3 minutos después de la agitación,
sembrar placas de Petrifilm Conteo Aerobio rotuladas con la identificación de la muestra, dilución y
la fecha del análisis.
7.3.14 Poner las placas en una superficie plana y lisa. Levantar la lámina superior y colocar 1 ml de la
dilución en el centro de la placa de Petrifilm Conteo Aerobio sin hacer burbujas, tocar suavemente
la superficie de la placa con la pipeta para depositar la última gota. Dejar caer la lámina superior
suavemente
7.3.15 Colocar el esparcidor con la superficie lisa hacia arriba en el centro de la placa y presionar
suavemente para distribuir la muestra de manera uniforme. Esperar por 1 minuto para permitir que
solidifique el gel.
7.3.16 Dentro de los 10 minutos posteriores a la inoculación de las placas, incubar en posición horizontal
con el lado transparente hacia arriba; a 35 °C ± 1 °C por 48 ±3 horas (para muestras lácteas
incubar a 32 °C ± 1 °C por 48 ±3 horas) Se puede colocar hasta 20 placas de Petrifilm una
sobre otra.
7.3.17 Haciendo uso del Contador Quebec, contar las colonias rojas independientemente de su tamaño o
intensidad, tener en cuenta las siguientes consideraciones:
-
el rango contable es de 25 ufc a 250 ufc,
-
Si el conteo de colonias es menor de 25 en todas las diluciones, registre el conteo en la
dilución menor.
-
Si las placas no muestran colonias reportar como menos de 1 X 101 ufc/ g o ml; para
muestras lácteas ver apartado 7.4.3
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Si el conteo de colonias en las placas de todas las diluciones es mayor de 250 ufc puede
realizar estimaciones contando el número de colonias en uno o más cuadros representativos
y obtener el promedio, multiplicar dicho número por 20 (ya que el área de crecimiento de la
placa es de 20 cm2) para obtener el recuento total por placa.
-
Si se observa un área de crecimiento roja o rosada en toda la placa indica que a la muestra
debe de realizarse más diluciones.
NOTA:
a) Durante el pipeteo se debe ajustar el volumen poniendo la punta de la pipeta en contacto con
la pared del contenedor y no dentro de la muestra.
b) La pipeta se debe insertar no más de 2,5 cm dentro de la muestra.
c) Se debe agitar los tubos en vortex por 15 segundos antes de hacer cada dilución y antes de
tomar la alícuota para realizar el análisis.
d) Para productos sólidos el líquido de dilución debe estar precalentado a 40 °C – 45 °C.
7.4 Reporte de resultados
7.4.1 El resultado obtenido y los cálculos realizados se registran en el formulario IA-MBA-PE-009-RE- 008
Hoja de trabajo y IA-MBA-PE-009-RE-019 Hoja de trabajo- Análisis de lácteos según corresponda.
7.4.2 Si el conteo es entre 25 y 250, reportar el número de colonias contadas por mililitro o gramo por el
recíproco de la dilución; reportar con dos cifras significativas.
7.4.3 Para muestras lácteas:
- si el conteo es de 0 a 24 ufc, reportar como menos de 25 ufc /ml o g por el recíproco de la
dilución; reportar como Estimado.
-si el conteo es mayor de 250 ufc, reportar como mayor de 250 ufc/ml o g por el recíproco de la
dilución; reportar como Estimado.
8. Anexos
No aplica
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