GUIA DE USUARIOS DE GENOTIPADO (STRs, VNTRs,…) El uso de marcadores moleculares para la identificación de genotipos de interés mediante microsatélites es susceptible de ser analizadas a través de la instrumentación existente en la Unidad de Secuenciación. El servicio se encarga de la etapa final de esta técnica la cual consiste en la cuantificación del tamaño de los fragmentos de DNA proporcionados por el usuario y generados en el desarrollo de la técnica mencionada. Dicha cuantificación se realiza en relación a estándares internos que se añaden a las muestras cuando se analizan mediante secuenciación en electroforesis capilar. Se pueden utilizar hasta 5 marcadores fluorescentes simultáneamente (uno de ellos reservado para el marcador de tamaños moleculares) y combinar diferentes tamaños alélicos en la misma muestra por lo que por cada capilar en una misma electroforesis se pueden analizar multitud de fragmentos 1. ENTREGA DE MUESTRAS. El envío de las muestras puede realizarse de alguna de las siguientes formas: Servicio de mensajería con portes pagados a la dirección: Unidad de Genómica. Universidad de Córdoba. Campus de Rabanales. Edificio Ramón y Cajal. 3ª Planta. 14071. Córdoba. Tel: 957-218587 e-mail: genomica@uco.es Entrega directa en la Unidad. Para la solicitud del Servicio de Análisis de fragmentos el horario de recepción de muestras será de 9 a 14 horas los días laborables. Las muestras deberán de ir acompañadas del “formulario de solicitud” (ver apartado de Formularios y Manuales) correspondiente debidamente cumplimentada. 2. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. El Servicio realiza la etapa final de este tipo de análisis la cual consiste en la cuantificación del tamaño de fragmentos de DNA proporcionados por el usuario con relación a estándares internos mediante secuenciadores automáticos de capilares AbiPrism 310 o 3130XL. 2.1.Requisitos de las muestras. a. Las muestras deben ser presentadas en placas de 96 pocillos con al menos 8-10 l de la/s reacción/es de PCR en la que se halla realizado el/los marcajes. Para el secuenciador ABI 310, las muestras se deberán cargar en las placas por filas. Para el secuenciador multicapilar ABI 3130XL, las muestras se deberán cargar en las placas por columnas. En el Servicio se les proporcionará todas las indicaciones necesarias al respecto. b. Indicar el rango de tamaños esperado para cada marcador y la combinación de fluorocromos utilizados (ver “formulario de solicitud”). -1- c. El servicio dispone de los siguientes marcadores de tamaño: 350 TAMRA; 400HD ROX; GS 1000 ROX, LIZ 500 Y LIZ 120 y de las siguientes matrices de análisis: Nombre Matriz Azul Verde Amarillo Rojo C1 6-FAMTM TET HEXTM TAMRATM D 6-FAMTM HEXTM NEDTM ROXTM D** 6-FAMTM VIC® NEDTM ROXTM F 5-FAMTM JOETM NEDTM ROXTM PowerPLex® JOE FL TMR CXR G5 6FAMTM VIC® NEDTM PET® LIZ® E5 dR110 dR6G dTAMRATM dROXTM LIZ® Naranja Utilidad de la Matriz Genotipaje y microsatélites Genotipaje y microsatélites Genotipaje y microsatélites Genotipaje (AFLP’s; Forense...) Genotipaje Forense Genotipaje y microsatélites SNPs (ABI PRISM® SNaPshot® kit) 1: Sólo disponible para el 310. d. Si el usuario necesitase otro Standard o matriz distinto de los disponibles contactar con la Unidad. e. Todos los marcadores fluorescentes son compatibles con el equipamiento disponible en la Unidad (ABI310 y ABI3130) a excepción de TET para el cual no existe filtro en el instrumento ABI3130 que permita su lectura. f. En algunos casos puede ser necesario un paso de purificación de los fragmentos (precipitación con etanol o purificación con "kits" específicos) antes del proceso de electroforesis. Los precursores fluorescentes no incorporados pueden afectar a la detección del estándar interno y dar lugar a datos no informativos. No se aceptan muestras cubiertas con aceite mineral. Si la PCR se hizo bajo una capa de aceite el usuario deberá retirarlo y remitir las muestras en placas limpias. g. La estimación precisa de un tamaño depende del tipo de instrumento y pueden haber diferencias entre analizadores (ABI Prism 310, 3130…), polímeros (POP4, POP6, POP7…). Por ello puede ser recomendable evitar cambiar de tipo de instrumento y química durante el desarrollo de un mismo proyecto. 2.2. Propiedades de los fluoroforos. Como hemos visto en el apartado anterior, una de las principales ventajas de la electroforesis capilar es la detección multicolor. A continuación, se detallan algunos aspectos de utilidad a la hora de elegir un fluocromo u otro para marcar las parejas de primers de interés. Detección multicolor. Intensidad relativa de los fluorocromos más utilizados. Dyes 5-FAM™ 6-FAM™ JOE™ VIC® HEX™ NED™ TAMRA/TAMRA™ PET® ROX™ LIZ® Max A (nm) 494 494 528 538 535 546 560 558 587 638 Max E (nm) Intensidad Rel 530 522 554 554 553 575 582 595 607 655 100 100 100 100 50 40 25 25 12 50 + -2- - Propiedades óptimas de los fluorcromos a. Deben tener Amax lo más diferente posible para: - Facilitar la generación de las matrices/calibración espectral b. Deben ser lo más brillante posible: - Aumentará la sensibilidad del ensayo - Regla general: Azul>Verde >Amarillo > Rojo c. Deben ser lo más estable posible - VIC es más estable que el HEX d. Su síntesis debe ser lo más fácil posible - JOE y 5-FAM son los más complicados para sintetizar 3. ENTEGA DE RESULTADOS. Los resultados se pueden enviar en formato electrónico a través de e-mail o en disco. En este último caso, el soporte informático deberá ser suministrado junto con las muestras y podrá ser recogido en la Unidad o ser enviado a portes debidos a la dirección que se indique. Las muestras de análisis de fragmentos serán conservadas durante un mes. En caso de que el usuario quiera recuperar dichas muestras podrá hacerlo personándose en la Unidad dentro del plazo. Programas para visualizar los ficheros: Si el usuario no dispone de los softwares de análisis específicos (GeneScan, Genotyper o GeneMapper), existe en la Unidad un ordenador con dichos programas y a disposición del usuario que lo solicite. Además, existen algunos visores que permiten la lectura de los datos y que se puede descargar gratuitamente en las siguientes direcciones: - Peak ScannerTM Software v1.0: http://www.appliedbiosystems.com/support/ software_community/free_ab_software.cfm - Genescan View http://bmr.cribi.unipd.it/ 4. INFORMACIÓN ADICIONAL. El Servicio pone a disposición de los usuarios la asesoria científica-técnica necesaria para ser usuarios de este Servicio asi como para la optimización de cualquier técnica compatible con la instrumentación científica disponible en la Unidad de Genómica. En caso de duda, aclaratorias sobre cualquier punto, etc... puede ponerse en contacto con la Unidad a través de nuestros teléfonos o e-mail. 957 21 85 87 o genomica@uco.es -3- -4-