1 ANALISIS DE OBJETOS TECNOLOGICOS EL MICROSCOPIO OPTICO 1. DESCRIPCION DEL OBJETO COMO OPERADOR (PARA QUE SIRVE) Antes de plantear aspectos del microscopio como operador, es conveniente tratar algunas conceptualizaciones que exigen su comprensión. Etimológicamente, Microscopio (del griego mikrós, pequeño, y skopeo, examinar, ver) Instrumento que sirve para aumentar considerablemente la imagen de los objetos muy diminutos, o que no son perceptibles a simple vista. Microscopio óptico: Es el tipo de microscopio más utilizado, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. Luz (Del latín, lux, lucis) La luz es el agente físico que hace visibles los objetos. El microscopio óptico hace parte de la microscopía, cual es la técnica de producir imágenes visibles de estructuras o detalles demasiado pequeños para ser vistos a simple vista. Exceptuando técnicas como el microscopio de fuerza atómica y el microscopio de efecto túnel, la microscopía generalmente implica la difracción, reflexión o refracción de radiación incidente en el sujeto de estudio. Difracción (Dispersión) En física, la difracción es un fenómeno ondulatorio: la dispersión y curvado aparente de las ondas cuando enfrentan una obstrucción. La difracción ocurre tanto en ondas electromagnéticas, tales como la luz y las ondas de radio como en ondas de sonido y de agua. También sucede cuando un grupo de ondas de tamaño finito se propaga; por ejemplo, por culpa de la difracción, un haz 2 angosto de ondas de luz de un láser deben finalmente diverger en un rayo más amplio a una distancia suficiente del emisor. Reflexión (Reflejo) En óptica, la reflexión es el proceso por el cual un rayo de luz que incide sobre una superficie lisa que separa dos medios "rebota" sobre ésta. El rayo incidente y el reflejado forman ángulos con la normal iguales. Se produce tambien un fenómeno de absorción diferencial en la superficie, por el cual la energía y espectro del rayo reflejado no coinciden con la del incidente si la velocidad de propagación luminosa es distinta en cada medio, el rayo es desviado y se produce la refracción. La relación entre la energía de la luz reflejada y la incidente se llama factor de reflexión. Refracción (Cambio de velocidad-dirección) En óptica, refracción es el cambio de dirección de una onda debido al cambio de su velocidad. Esto ocurre cuando la onda pasa de un medio con un índice de refracción dado a un medio con otro índice de refracción. En la microscopía de luz clásica, esto implica el paso de luz transmitida a través o reflejada desde el sujeto mediante una serie de lentes, para poder ser detectada directamente por el ojo o impresa en una placa fotográfica. También hay una forma de microscopía que se basa en una sonda muy pequeña que reconoce las perturbaciones que ocurren al extremo de la sonda debidas a efectos eléctricos. Un ejemplo de este fenómeno lo vemos cuando introducimos un lápiz en un vaso con agua: el lápiz parece quebrado (como dato, el origen de la palabra "refracción" es la palabra latina fractum, el mismo que el de la palabra "quebrado"). También ocurre este fenómeno cuando la luz pasa por una capa de aire sobre una superficie caliente, produciendo un espejismo. La refracción de la luz sobre la superficie de un medio es explicada por medio de la ley de Snell. Esta ley, así como la refracción en medios inhomogéneos, son consecuencia del principio de Fermat, que indica que la luz se propaga entre dos puntos siguiendo la trayectoria de recorrido óptico más corto. 3 La refracción se produce cuando la luz pasa de un medio de propagación a otro con una densidad óptica diferente y sufre un cambio de velocidad y un cambio de dirección si no incide perpendicularmente en la superficie. La refracción es el cambio brusco de dirección que experimenta un rayo luminoso en su propagación al cruzar con cierto ángulo de incidencia la superficie de separación de dos medios transparentes de distinta densidad como consecuencia de la distinta velocidad de propagación de la luz en cada uno de estos medios. Óptica La Óptica es la rama de la física que estudia el comportamiento de la luz y, más generalmente, de las ondas electromagnéticas. Según el modelo para la luz utilizado, se distingue entre las siguientes ramas, por orden creciente de precisión (cada rama utiliza un modelo simplificado del empleado por la siguiente): La óptica geométrica: Trata a la luz como un conjunto de rayos que cumplen el principio de Fermat. Se utiliza en el estudio de la transmisión de la luz por medios homogéneos (lentes, espejos), la reflexión y la refracción. La óptica ondulatoria: Considera a la luz como una onda plana, teniendo en cuenta su frecuencia y longitud de onda. Se utiliza para el estudio de difracción e interferencia. La óptica electromagnética: Considera a la luz como una onda electromagnética, explicando así la reflectancia y transmitancia, y los fenómenos de polarización y anisotropía. La óptica cuántica u óptica física: Estudio cuántico de la interacción entre las ondas electromagnéticas y la materia, en el que la dualidad onda-corpúsculo juega un papel crucial. 4 2. DESCRIPCION ANATOMICA (ESTRUCTURA INTERNA Y EXTERNA) El microscopio óptico, se halla constituido por tres partes principalmente: una parte mecánica, una óptica y una de iluminación. Ocular 2. Lentes Objetivas Tornillos: Macro y Revolver Micro métrico Objetivos Brazo o columna Pie Platina Diafragma 2. Lentes Objetivas Espejo Tubo 2.1 La parte mecánica del Microscopio La parte mecánica del microscopio comprende: el pie, el tubo, el revólver, el asa o brazo, la platina, el carro, el tornillo macrométrico y el tornillo micrométrico. Estos elementos sostienen la parte óptica y de iluminación, además permite los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto. El pie. Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular 5 El tubo. Tiene forma cilíndrica y está ennegrecido internamente para evitar las molestias que ocasionan los reflejos de la luz. En su extremidad superior se colocan los oculares. El revólver. Es una pieza giratoria provista de orificios en los cuales se enroscan los objetivos. Al girar el revólver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posición de trabajo, la cual se nota por el ruido de un piñón que lo fija. La columna, llamada también asa o brazo, es una pieza colocada en la parte posterior del aparato. Sostiene el tubo en su porción superior y por el extremo inferior se adapta al pie. 6 La platina. Es una pieza metálica plana en la que se coloca la preparación u objeto que se va a observar. Presenta un orificio en el eje óptico del tubo que permite el paso de los rayos luminosos a la preparación. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmóvil; en otros casos puede ser giratoria, es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares. El tornillo macrométrico. Girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizándose en sentido vertical gracias a una cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rápido de la preparación. El tornillo micrométrico. Mediante el movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y nítido de la preparación. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos. 2.2 Sistema Óptico El sistema óptico es el encargado de reproducir y aumentar las imágenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Está formado por los oculares y los objetivos. El Ocular. El ocular está constituido generalmente por un lentes, dispuesto sobre un tubo corto. El ocular generalmente más utilizado es el de: 8X, 1OX, 12.5X, 15X. La X se utiliza para expresar en forma abreviada los aumentos. 7 Las Lentes: Las lentes son piezas de vidrio especiales, con superficies curvas que producen imágenes de objetos. Las lentes de aumento producen una imagen aumentada de un objeto. Una lente es un medio u objeto que concentra o hace diverger rayos de luz. Entre las lentes más usadas se cuentan las utilizadas para corregir los problemas de visión en gafas, anteojos o lentillas. También se usan lentes, o combinaciones de lentes y espejos, en telescopios y microscopios. El primer telescopio astronómico fue construido por Galileo Galilei usando dos lentes convergentes. Existen también instrumentos capaces de hacer converger o diverger otros tipos de ondas electromagnéticas y a los que se les denomina también lentes. Por ejemplo, en los microscopios electrónicos las lentes son de carácter magnético. En astrofísica es posible observar fenómenos de lentes gravitatorias cuando la luz procedente de objetos muy lejanos pasa cerca de objetos masivos, curvándose en su trayectoria. Tipos de lentes: Existen dos tipos principales de lentes: Lente convergente. Los rayos paralelos procedentes del infinito convergen sobre el plano focal imagen. 8 Lentes convergentes: Son aquellas cuyo espesor va disminuyendo del centro hacia los bordes. En este tipo de lentes, todo rayo que pase paralelamente al eje principal, al refractarse se junta en su foco. Las lentes convergentes forman imágenes reales de objetos. Existen tres clases de lentes convergentes: o o o Lentes bi-convexas. Lentes plano-convexas. Lentes cóncavo-convexas. Lente divergente. Los rayos procedentes de un mismo punto de un objeto divergen al atravesar la lente. Sus prolongaciones convergen a la izquierda de la lente formando una imagen virtual directa y reducida. 9 Lentes divergentes: Son aquellas cuyo espesor va disminuyendo de los bordes hacia el centro. En este tipo de lentes, todo rayo que pase paralelamente al eje principal, al refractarse se separa como si procediera de un foco principal. Las lentes divergentes forman imágenes virtuales de los objetos. Existen tres clases de lentes divergentes: o o o Lentes bi-cóncavas. Lentes plano-cóncavas. Lentes convexo-cóncavas. Los objetivos. Los objetivos producen aumento de las imágenes de los objetos y organismos y, por tanto, se hallan cerca de la preparación que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersión. Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparación. En la cara externa llevan una serie de índices que indican el aumento que producen, la abertura numérica y otros datos. Asi por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromático, su aumento 40 y su abertura numérica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El número de objetivos varía con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos más frecuentemente utilizados son: 6X, 1OX, 20X, 45X y 60X. El objetivo de inmersión está compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a través de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparación, de manera que la lente frontal entre en 10 contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 1 OOX y se distingue por uno o dos círculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior. El objetivo o conjunto de estos, se hallan dispuestos en una pieza giratoria llamada revolver. 2.3 Sistema de Iluminación Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparación u objeto que se va a observar en el microscopio. Comprende los siguientes elementos: El espejo. Están fabricados de vidrio, tiene dos caras: una cóncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cóncava se emplea de preferencia con iluminación artificial, y la plana, para iluminación natural (luz solar). Modernamente se prescinde del espejo en la fabricación de microscopios, ya que éstos traen incorporada una lámpara colocada en el eje del microscopio. El vidrio es un material duro, frágil y transparente. A pesar de comportarse como sólido, es un líquido sobreenfriado, amorfo (sin estructura cristalina). El vidrio ordinario se obtiene por fusión a unos 1.250 ºC de arena de sílice (Si O2), carbonato sódico (Na2 CO3) y caliza (CaCO3). Su manipulación sólo es posible mientras se encuentra fundido, caliente y maleable. Condensador. El condensador está formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparación. El condensador se halla debajo de la platina. El condensador puede deslizarse sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo que determina su movimiento ascendente o descendente. Diafragma. Generalmente, el condensador está provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura y controla la calidad de luz que debe pasar a través del condensador. Los diafragmas se hallan elaborados con materiales metálicos o plásticos 11 3. ANALISIS FUNCIONAL (FUNCIONAMIENTO) Para comprender cómo funciona un microscopio óptico, primero es necesario entender que es la luz y cómo las lentes la desvían. La luz (< latín lux, lucis) es el agente físico que hace visibles los objetos. Hay dos tipos de objetos visibles: aquellos que por sí mismos emiten luz y los que la reflejan. El color de estos depende del espectro de la luz que incide y de la absorción del objeto, la cual determina qué ondas son reflejadas. La luz blanca se produce cuando todas las longitudes de onda del espectro visible están presentes en proporciones iguales. La luz visible está comprendida en una estrecha franja que va desde longitudes de onda de 780 nm (rojo) hasta los 380 nm (violeta). Los colores del espectro se ordenan como en el arco iris, formando el llamado espectro visible. La Frecuencia y longitud de onda de la luz se relacionan por la expresión: donde c es la velocidad de la luz en el vacío. Longitud de onda de la luz Distancia existente entre dos crestas o dos valles de una onda. Se suele representar con la letra grieta λ. 12 Los rayos de luz atraviesan el aire en línea recta, pero al entrar en una sustancia como el agua o el vidrio, chocan contra la superficie y se desvían o refractan, esto se denomina refracción. Las lentes son piezas de vidrio especiales, con superficies curvas que producen imágenes de objetos. Las lentes de aumento producen una imagen aumentada de un objeto. La Óptica es la rama de la física que estudia el comportamiento de la luz y, más generalmente, de las ondas electromagnéticas. Según el modelo para la luz utilizado, se distingue entre las siguientes ramas, por orden creciente de precisión (cada rama utiliza un modelo simplificado del empleado por la siguiente): La óptica geométrica: Trata a la luz como un conjunto de rayos que cumplen el principio de Fermat. Se utiliza en el estudio de la transmisión de la luz por medios homogéneos (lentes, espejos), la reflexión y la refracción. La óptica ondulatoria: Considera a la luz como una onda plana, teniendo en cuenta su frecuencia y longitud de onda. Se utiliza para el estudio de difracción e interferencia. La óptica electromagnética: Considera a la luz como una onda electromagnética, explicando así la reflectancia y transmitancia, y los fenómenos de polarización y anisotropía. La óptica cuántica u óptica física: Estudio cuántico de la interacción entre las ondas electromagnéticas y la materia, en el que la dualidad onda-corpúsculo juega un papel crucial. Trayectoria del Rayo de Luz a través del Microscopio. El haz luminoso procedente del espejo o la lámpara pasa directamente a través del diafragma al condensador. Gracias al sistema de lentes que posee el condensador, la luz es concentrada sobre la preparación a observar. El haz de luz penetra en el objetivo y sigue por el tubo hasta llegar el ocular, donde es captado por el ojo del observador. El microscopio normal u óptico está formado por dos lentes. El objeto que se quiere estudiar se estudiar se coloca en la platina. La luz procedente del objeto 13 penetra en el microscopio por el objetivo, que desempeña la función de una lupa; es decir, produce una imagen muy ampliada del objeto. El objetivo es la lente más importante del microscopio para producir una imagen clara de la alta resolución. El objetivo tiene varias funciones importantes. Debe recolectar la luz que viene de cada uno de las varias partes o puntas del espécimen. Debe tener la capacidad de reconstituir la luz que viene de las varias puntas del espécimen en las varias puntas correspondientes de la imagen. El objetivo se debe construir de modo que sea enfocado bastante cerca al espécimen para proyectar una imagen magnificada, verdadera para arriba en el tubo del cuerpo. La imagen se modifica mediante otro sistema de lentes, el ocular. El aumento final conseguido es igual al producto de los aumentos del objetivo por los del ocular. En el microscopio óptico este aumento tiene un límite, que se denomina "poder de resolución" y que es aproximadamente de 1200 – 2000 aumentos. El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible par a crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especimenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra. Debes colocar tu microscopio en una mesa fija, de modo tal que puedas sentarte con comodidad para ver el ocular sin estirarte o apoyarte. Trata que la mesa sea lo suficientemente grande como para colocar sobre ella todo el material que necesites para trabajar. El objeto que se desea examinar (líquidos, plantas, insectos, células animales o vegetales, etc.) debe colocarse en un portaobjetos, que es una lámina de vidrio de 1 mm de espesor y a continuación se cubre con un cubreobjetos, un cuadrado de 2 cm de lado o un círculo con esa medida de diámetro. 14 Es posible que cuando adquieras un equipo de microscopio encuentres en él algunos preparados, pero si no es así, puedes practicar con algunos granos de sal o azúcar en el centro de un portaobjeto húmedo y limpio. Practica hasta que tengas la certeza de saber para qué lado debes mover la perilla de enfoque, para hacer subir o bajar las lentes. En algunos microscopios, al mover el tornillo toda la platina sube o baja, en vez de hacerlo el puente. Para comenzar, selecciona siempre la lente de menor aumento que te permite ver mejor el objeto y encontrar fácilmente la parte que más te interesa observar. Coloca el portaobjeto sobre la platina de manera tal que la parte que quieres observar se encuentre bajo la lente. Utiliza los broches para fijar el portaobjeto en su sitio. Observa desde un costado la platina y mueve la perilla de enfoque para acercar la lente. Luego mira a través del microscopio y sube las lentes girando la perilla de enfoque hasta que el objeto entre en foco y su imagen se vuelva nítida y clara. Ten cuidado!!! No bajes la lente mientras estés mirando por el microscopio. Podrías golpear el portaobjeto y romperlo o romper la lente. El objeto a observar debe estar muy bien iluminado. Si los objetos son opacos deben ser iluminados desde arriba para poder verlos en detalle. Esto se llama "iluminación desde arriba". lo ideal es colocar una lámpara a unos 20 cm del microscopio y ajustarla hasta que la luz apunte directamente hacia el espejo que se encuentra bajo la platina. En el método de "observación al trasluz" la preparación se ilumina desde abajo y permite estudiar cuerpos de muy poco espesor, que permiten que la luz los atraviese. Así se estudian los tejidos vegetales y animales, que se preparan cortándolos en láminas muy finas con un instrumento especial llamado micrótomo. Los tipos más comunes son: el micrótomo de mano y el rotativo Para observar con el microscopio óptico se cortan secciones tan delgadas como la milésima parte de un milímetro (denominada micrón). Algunos materiales son demasiado blandos para ser cortados, y es necesario ponerles cera, dejarlos endurecer y luego seccionarlos. Y si es necesario verlos con mucha prisa, pueden ser congelados para endurecerlos y luego seccionarlos. Para comenzar a descubrir el mundo del microscopio, es conveniente que trabajes en proyectos simples que requieran muy poca preparación. 15 IMAGEN 6 Ojo Humano 1. L e nt e s 4 O c ul 3 ar e s Lente ocular Lente objetiva Especímen 2 Lentes condensadoras 1 Fuente de luz TRAYECTORIA DE LA IMAGEN DE LA MUESTRA, HASTA EL OJO HUMANO El anterior esquema, nos muestra la trayectoria de la imagen del especímen que ha sido colocado en la plantilla para ser percibida por el ojo humano. Este proceso se describe a saber: 1. La fuente proyectada al de luz espejo es del microscopio, luz que puede provenir de una fuente natural o ambiental, como también de una lámpara que puede tener provista el sistema. 2. Esta luz al entrar en contacto con el espejo, Rayos de Luz Espejo Refracción 16 cambia de dirección (se refracta), y es reflejada a las lentes condensadoras las cuales la compactan en un solo haz para iluminar el especímen. 3. El especímen o muestra que se halla dispuesto en la lámina de vidrio sobre la platina, es iluminado por las lentes condensadoras y lo hacen visible a las lentes objetivas. 4. Las lentes objetivas capturan el especímen y amplían su imagen las miles de veces según su resolución, proyectándolo a las lentes oculares. 5. Una vez la muestra, al alcance de las lentes oculares, complementan la ampliación de la imagen según su capacidad de resolución, y la hacen visible al ojo humano. Cabe destacar que el especímen en observación se hace visible al ojo humano por que la luz que lo ilumina, se propaga dentro del tubo del microscopio. 17 4. ANALISIS TECNICO Y CONSTRUCTIVO (MATERIALES PARA SU FABRICACION Y ENSAMBLAJE) Para analizar los materiales y la fabricación de los mismos se tendrá presente atender a las partes que constituyen el microscopio, correspondientes: A. Sistema mecánico, B. sistema óptico, y C. un sistema de iluminación, pasaremos a tratar los materiales de cada uno de estos. A. EL SISTEMA MECANICO Este se halla compuesto por: 1. 2. 3. 4. 5. 6. El brazo o columna (armazón). El pie El tubo El revolver La platina y Los tornillos calibradores (micrométrico y macrométrico) 3. Tubo 1. Brazo o Columna 6. Tornillos: Macrométrico Micrométrico 2. Pie 4. Revolver 5. Platina 18 B. SISTEMA OPTICO Está constituido por: 1. las lentes oculares y 2. Las lentes objetivas 1. Lentes Oculares C. SISTEMA DE ILUMINACION Se halla conformado por: 1. El espejo o lámpara, 2. El condensador y diafragma. 2. Condensador Y Diafragma 1. Espejo o Tubo Lámpara Tubo 19 Para la fabricación del microscopio óptico en sus sistemas A. Mecánico, B. Óptico, C. de Iluminación, exceptuando las lentes y el espejo, se emplean materiales que hacen depender su calidad. Básicamente se utiliza el hierro y aleaciones con cobre, dándole variaciones en su calibre de lámina dependiendo las partes en especial que se desean elaborar. Otro material con que se hallan elaboradas estas partes es el plástico pastificado y recubierto con laminilla metálica que le da esta apariencia en su presentación. 4.1 Fabricación de las partes metálicas La fabricación de las partes metálicas del microscopio están hechas de hierro y aleaciones con cobre. Estas piezas son fabricadas en factorías especiales a donde llega la materia prima en lingotes tubos, varillas o láminas para ser moldeadas de conformidad con las especificaciones según el aparato a elaborar. Existen microscopios hechos en materiales plásticos, pero los de más alta calidad y durabilidad son elaborados en metal. Elemento químico, símbolo Fe, número atómico 26 y peso atómico 55.847. El hierro es el cuarto elemento más abundante en la corteza terrestre (5%). Es un metal maleable, tenaz, de color gres plateado y magnético. Los cuatro isótopos estables, que se encuentran en la naturaleza, tienen las masas 54, 56, 57 y 58. Los dos minerales principales son la hematita, Fe2O3, y la limonita, Fe2O3.3H2O. Las piritas, FeS2, y la cromita, Fe(CrO2)2, se explotan como minerales de azufre y de cromo, respectivamente. El hierro se encuentra en muchos otros minerales y está presente en las aguas freáticas y en la hemoglobina roja de la sangre. 20 El uso más extenso del hierro (fierro) es para la obtención de aceros estructurales; también se producen grandes cantidades de hierro fundido y de hierro forjado. Entre otros usos del hierro y de sus compuestos se tienen la fabricación de imanes, tintes (tintas, papel para heliográficas, pigmentos pulidores) y abrasivos (colcótar). Exiten varias forma alotrópicas del hierro. La ferrita es estable hasta 760ºC (1400ºF). El cambio del hierro B comprende principalmente una pérdida de permeabilidad magnética porque la estructura de la red (cúbica centrada en el cuerpo) permanece inalterada. La forma alotrópica tiene sus átomos en arreglos cúbicos con empaquetamiento cerrado y es estable desde 910 hasta 1400ºC (1670 hasta 2600ºF). 4.2 Fabricación del Vidrio El espejo y las lentes de un microscopio óptico, se hallan fabricadas con vidrio. Materiales y técnicas El ingrediente principal del vidrio es la sílice, obtenida a partir de arena, pedernal o cuarzo. 21 SÍLICE Arenas de Sílice El cuarzo (Si O2) El Pedernal (Si O4) Descripción técnica La arena de Sílice es un compuesta resultante de la combinación del Sílice con el Oxigeno. Su composición química esta formada por un átomo de sílice y dos átomos de Oxigeno, formando una molécula muy estable: Si O2. Esta molécula es insoluble en agua, y en la naturaleza se encuentra en forma de cuarzo. Si el cuarzo esta cristalizado se denomina Cristal de Roca. Usos industriales Los usos industriales del sílice derivan de sus importantes propiedades físicas y químicas, destacándose especialmente su dureza, resistencia química, alto punto de fusión, piezoelectricidad, piroelectricidad y transparencia. Es la materia prima fundamental para la fabricación del vidrio (aproximadamente el 70 % de su composición es de sílice) y de la porcelana. Sus arenas son utilizadas especialmente como lecho filtrante para depuración y potabilización de las aguas (para la retención de los flóculos de tamaños muy pequeños que no son separados por decantación), y por su dureza son 22 utilizados para la fabricación de lejías, abrasivos industriales y arenados. Es una materia prima muy importante en la composición de las fórmulas de detergentes, pinturas, hormigones y morteros especiales, y constituyen la materia prima básica para la obtención del silicio, así mismo son la base para la fabricación de refractarios de sílica y arenas de modelo, dado su alto punto de fusión. A partir de las arenas silíceas se pueden producir fracciones granulométricas específicas destinadas a mercados industriales tan diversos como: Filtros de agua, Perforaciones, Fundición, Vidrio, Morteros, Plantas Potabilizadoras, Arenados, Pisos de cerámica, Pinturas, Resinas, Loza, Epoxi, Campos deportivos (Fútbol, Golf, Paddle, Tenis, etc.), Piletas de natación. Composición y propiedades La sílice se funde a temperaturas muy elevadas para formar vidrio. Como éste tiene un elevado punto de fusión y sufre poca contracción y dilatación con los cambios de temperatura, es adecuado para aparatos de laboratorio y objetos sometidos a choques térmicos (deformaciones debidas a cambios bruscos de temperatura), como los espejos de los telescopios. El vidrio es un mal conductor del calor y la electricidad, por lo que resulta práctico para el aislamiento térmico y eléctrico. En la mayoría de los vidrios, la sílice se combina con otras materias primas en distintas proporciones. Los fundentes alcalinos, por lo general carbonato de sodio o potasio, disminuyen el punto de fusión y la viscosidad de la sílice. La piedra caliza o la dolomita (carbonato de calcio y magnesio) actúa como estabilizante. Otros ingredientes, como el plomo o el bórax, proporcionan al vidrio determinadas propiedades físicas. Fabricación de vidrio El vidrio se fabrica a partir de una mezcla compleja de compuestos vitrificantes, como sílice, fundentes, como los álcalis, y estabilizantes, como la cal. Estas materias primas se cargan en el horno de cubeta (de producción continua) por medio de una tolva. El horno se calienta con quemadores de gas o petróleo. La llama debe alcanzar una temperatura suficiente, y para ello el aire de combustión se calienta en unos recuperadores construidos con ladrillos refractarios antes de que llegue a los quemadores. El horno tiene dos recuperadores cuyas funciones cambian cada veinte minutos: uno se calienta por contacto con los gases ardientes mientras el otro proporciona el calor acumulado al aire de combustión. La mezcla se funde (zona de fusión) a unos 1.500 °C y avanza hacia la zona de enfriamiento, donde tiene lugar el recocido. En el otro extremo del horno se alcanza una temperatura de 1.200 a 800 °C. Al vidrio así obtenido se le da forma por laminación (como en el esquema superior) o por otro método. Vidrio de borosilicato Este vidrio contiene bórax entre sus ingredientes fundamentales, junto con sílice y álcali. Destaca por su durabilidad y resistencia a los ataques químicos y 23 las altas temperaturas, por lo que se utiliza mucho en utensilios de cocina, aparatos de laboratorio y equipos para procesos químicos. Color Las impurezas en las materias primas afectan al color del vidrio. Para obtener una sustancia clara e incolora, los fabricantes añaden manganeso con el fin de eliminar los efectos de pequeñas cantidades de hierro que producen tonos verdes y pardos. El cristal puede colorearse disolviendo en él óxidos metálicos, sulfuros o seleniuros. Otros colorantes se dispersan en forma de partículas microscópicas. Ingredientes diversos Entre los componentes típicos del vidrio están los residuos de vidrio de composición similar, que potencian su fusión y homogeneización. A menudo se añaden elementos de afino, como arsénico o antimonio, para desprender pequeñas burbujas durante la fusión. Propiedades físicas Según su composición, algunos vidrios pueden fundir a temperaturas de sólo 500 °C; en cambio, otros necesitan 1.650 ºC. La resistencia a la tracción, que suele estar entre los 3.000 y 5.500 N/cm2, puede llegar a los 70.000 N/cm2 si el vidrio recibe un tratamiento especial. La densidad relativa (densidad con respecto al agua) va de 2 a 8, es decir, el vidrio puede ser más ligero que el aluminio o más pesado que el acero. Las propiedades ópticas y eléctricas también pueden variar mucho. Mezcla y fusión Después de una cuidadosa medida y preparación, las materias primas se mezclan y se someten a una fusión inicial antes de aplicarles todo el calor necesario para la vitrificación. En el pasado, la fusión se efectuaba en recipientes de arcilla (barro) que se calentaban en hornos alimentados con madera o carbón. Todavía hoy se utilizan recipientes de arcilla refractaria, que contienen entre 0,5 y 1,5 toneladas de vidrio, cuando se necesitan cantidades relativamente pequeñas de vidrio para trabajarlo a mano. En las industrias modernas, la mayor parte del vidrio se funde en grandes calderos, introducidos por primera vez en 1872. Estos calderos pueden contener más de 1.000 toneladas de vidrio y se calientan con gas, fuel-oil o electricidad. Las materias primas se introducen de forma continua por una abertura situada en un extremo del caldero y el vidrio fundido, afinado y templado, sale por el otro extremo. En unos grandes crisoles o cámaras de retención, el vidrio fundido se lleva a la temperatura a la que puede ser trabajado y, a continuación, la masa vítrea se transfiere a las máquinas de moldeo. Moldeado 24 Los principales métodos empleados para moldear el vidrio son el colado, el soplado, el prensado, el estirado y el laminado. Todos estos procesos son antiguos (véase Vidrio (arte)), pero han sufrido modificaciones para poder producir vidrio con fines industriales. Por ejemplo, se han desarrollado procesos de colado por centrifugado en los que el vidrio se fuerza contra las paredes de un molde que gira rápidamente, lo que permite obtener formas precisas de poco peso, como tubos de televisión. También se han desarrollado máquinas automáticas para soplar el vidrio. Vidrio óptico La mayoría de las lentes que se utilizan en gafas (anteojos), microscopios, telescopios, cámaras y otros instrumentos ópticos se fabrican con vidrio óptico. Éste se diferencia de los demás vidrios por su forma de desviar (refractar) la luz. La fabricación de vidrio óptico es un proceso delicado y exigente. Las materias primas deben tener una gran pureza, y hay que tener mucho cuidado para que no se introduzcan imperfecciones en el proceso de fabricación. Pequeñas burbujas de aire o inclusiones de materia no vitrificada pueden provocar distorsiones en la superficie de la lente. Las llamadas cuerdas, estrías causadas por la falta de homogeneidad química del vidrio, también pueden causar distorsiones importantes, y las tensiones en el vidrio debidas a un recocido imperfecto afectan también a las cualidades ópticas. En la antigüedad, el vidrio óptico se fundía en crisoles durante periodos prolongados, removiéndolo constantemente con una varilla refractaria. Después de un largo recocido, se partía en varios fragmentos; los mejores volvían a ser triturados, recalentados y prensados con la forma deseada. En los últimos años se ha adoptado un método para la fabricación continua de vidrio en tanques revestidos de platino, con agitadores en las cámaras cilíndricas de los extremos (llamadas homogeneizadores). Este proceso produce cantidades mayores de vidrio óptico, con menor coste y mayor calidad que el método anterior. Para las lentes sencillas se usa cada vez más el plástico en lugar del vidrio. Aunque no es tan duradero ni resistente al rayado como el vidrio, es fuerte y ligero y puede absorber tintes. Vidrio (industria), sustancia amorfa fabricada sobre todo a partir de sílice (SiO2) fundida a altas temperaturas con boratos o fosfatos. También se encuentra en la naturaleza, por ejemplo en la obsidiana, un material volcánico, o en los enigmáticos objetos conocidos como tectitas. El vidrio es una sustancia amorfa porque no es ni un sólido ni un líquido, sino que se halla en un estado vítreo en el que las unidades moleculares, aunque están dispuestas de forma desordenada, tienen suficiente cohesión para presentar rigidez mecánica. El vidrio se enfría hasta solidificarse sin que se produzca cristalización; el calentamiento puede devolverle su forma líquida. Suele ser transparente, pero también puede ser traslúcido u opaco. Su color varía según los ingredientes empleados en su fabricación. El vidrio fundido es maleable y se le puede dar forma mediante diversas técnicas. En frío, puede ser tallado. A bajas temperaturas es quebradizo y se rompe con fractura concoidea (en forma de concha de mar). 25 Vidrio soluble, compuesto de silicato de sodio (o potasio), incoloro y de aspecto vidrioso, de fórmula Na2SiO3 (véase Vidrio; Silicio). Es soluble en agua y alcohol, y se emplea comercialmente como cemento, para fabricar hormigón y como capa protectora en materiales ignífugos. También se utiliza en la elaboración de jabones y detergentes sintéticos y en procesos de refinado del petróleo. La disolución de vidrio soluble también se utiliza para conservar huevos y madera. Aplicaciones Se utiliza en la industria del acero como componente de las aleaciones de silicio-acero. Para fabricar el acero, se desoxida el acero fundido añadiéndole pequeñas cantidades de silicio; el acero común contiene menos de un 0,03% de silicio. El acero de silicio, que contiene de 2,5 a 4% de silicio, se usa para fabricar los núcleos de los transformadores eléctricos, pues la aleación presenta baja histéresis (véase Magnetismo). Existe una aleación de acero, el durirón, que contiene un 15% de silicio y es dura, frágil y resistente a la corrosión; el durirón se usa en los equipos industriales que están en contacto con productos químicos corrosivos. El silicio se utiliza también en las aleaciones de cobre, como el bronce y el latón. El silicio es un semiconductor; su resistividad a la corriente eléctrica a temperatura ambiente varía entre la de los metales y la de los aislantes. La conductividad del silicio se puede controlar añadiendo pequeñas cantidades de impurezas llamadas dopantes. La capacidad de controlar las propiedades eléctricas del silicio y su abundancia en la naturaleza han posibilitado el desarrollo y aplicación de los transistores y circuitos integrados que se utilizan en la industria electrónica. La sílice y los silicatos se utilizan en la fabricación de vidrio, barnices, esmaltes, cemento y porcelana, y tienen importantes aplicaciones individuales. La sílice fundida, que es un vidrio que se obtiene fundiendo cuarzo o hidrolizando tetracloruro de silicio, se caracteriza por un bajo coeficiente de dilatación y una alta resistencia a la mayoría de los productos químicos. El gel de sílice es una sustancia incolora, porosa y amorfa; se prepara eliminando parte del agua de un precipitado gelatinoso de ácido silícico, SiO2·H2O, el cual se obtiene añadiendo ácido clorhídrico a una disolución de silicato de sodio. El gel de sílice absorbe agua y otras sustancias y se usa como agente desecante y decolorante. El silicato de sodio (Na2SiO3), también llamado vidrio, es un silicato sintético importante, sólido amorfo, incoloro y soluble en agua, que funde a 1.088 °C. Se obtiene haciendo reaccionar sílice (arena) y carbonato de sodio a alta temperatura, o calentando arena con hidróxido de sodio concentrado a alta presión. La disolución acuosa de silicato de sodio se utiliza para conservar huevos; como sustituto de la cola o pegamento para hacer cajas y otros contenedores; para unir gemas artificiales; como agente incombustible, y como relleno y adherente en jabones y limpiadores. Otro compuesto de silicio importante es el carborundo, un compuesto de silicio y carbono que se utiliza como abrasivo. 26 El monóxido de silicio, SiO, se usa para proteger materiales, recubriéndolos de forma que la superficie exterior se oxida al dióxido, SiO2. Estas capas se aplican también a los filtros de interferencias. Fabricación de las lentes opticas Una lente es un sistema óptico limitado por dos superficies refringentes que tienen un eje común. Cabe mencionar que según su composición, tendrán diferentes índices de refracción. El índice de refracción es lo que determina la desviación de la luz en el interior del material que compone la lente. Podemos señalar que según la composición del vidrio, variará el índice de refracción. Los materiales que componen las lentes pueden ser: Vidrio Común Verde Borosilicato Flint Vidrio Siliceo (Crown) Vidrio Común Blanco Otros Las lentes son clasificadas según su forma: |) Plano Convexa |( Plano Cóncava () Biconvexa )( Bicóncava || Plano (Visor sin aumento) 27 El proceso parla fabricación de una lente comienza con una placa de vidrio determinada. Esta se corta en la medida justa, obteniendo así un trozo de vidrio con el peso adecuado. Lo cual nos permite dar el primer paso, el prensado. El prensado también llamado horneado, es el procedimiento mediante el cual se calienta el trozo de vidrio hasta ablandarlo. A continuación se lo prensa y se obtiene la forma gruesa del lente requerido. Una vez enfriado el vidrio (en hornos especiales) se da paso a la etapa final, el tallado y el pulido. El siguiente paso es el refinado y pulido, que consiste en dejar la lente sin rayones, estriíllas o poros abiertos. Para ello utiliza la pulidora y algunos químicos color mostaza. Aquí procederemos a tallar para dar la curvatura exacta con moldes especiales. Luego se pule para obtener la transparencia necesitada. Este refinado y pulido, que consiste en dejar la lente sin rayones, estriíllas o poros abiertos. Para ello utiliza la pulidora y algunos químicos color mostaza. Boris Reynoso selecciona el molde que le servirá en el generador para darle la curvaturaa las lentes 28 29 30 4.3 ENSAMBLE DE LA ESTRUCTURA DEL MICROSCOPIO OPTICO El proceso requerido para el montaje de las diferentes partes del microscopio óptico debe tener presente: 1. Brazo, columna, asa o soporte 2. Pie o base 3. Oculares 4. Tubo 5. Objetivos 6. Revolver 7. Platina 8. Condensado y diafragma 9. Espejo o lámpara es el siguiente: 1. Montaje del brazo y el pie. El brazo se une con el pie atornillándolos de manera firme, y en este se ensamblarán las demás partes del microscopio. 2. Selección de las lentes oculares. Estas se seleccionan de conformidad con la resolución de imagen que se quiere observar, las cuales van desde 10X hasta 20X o más aumentos. 3. Montaje de las lentes en el porta oculares. Una vez seleccionadas las lentes que constituirán el ocular, se insertan en un tubo cilíndrico llamado portaoculares. Estas lentes están sujetas a desplazamiento interno de arriba hacia abajo y viceversa para determinar el enfoque 31 deseado. 4. Montaje del Ocular en el Tubo. El ocular se monta en el tubo óptico mediante un ensamble de enroscado sinfín, provisto en el extremo del porta ocular y el tubo. 5. Montaje del Tubo en el brazo, columna, asa o soporte. Una vez ensamblado el ocular en el tubo, se procede a montarlo en el brazo del microscopio. Este al igual que el ocular, se enrosca al brazo hasta darle firmeza. 6. Montaje del revolver. El revolver es la parte del microscopio que consta de un sistema básico de tres cilindros giratorios, donde se ensamblan las lentes ópticas de los diferentes tipos de aumentos. Este se une al brazo enroscándolo y entra en contacto con el tubo a manera de una pieza integral con el ocular. 32 7. Montaje de la platina y tornillos calibradores. La platina se une al brazo con tornillos milimétricos. Esta se halla provista de un sistema llamado cremallera que le permite su desplazamiento de arriba a bajo y viceversa para calibrar los enfoques por medio de los tornillos micrométrico y macrométrico. 8. Montaje del condensador. El condensador además del lente se halla acompañado de un diafragma que se puede cerrar o abrir para regular el paso de la luz. Este se ensambla debajo de la platina y su orificio debe quedar en dirección perpendicular al de la platina para posibilitar el paso del rayo lumínico. 2. Condensador Y Diafragma 1. Espejo o Tubo Lámpara Tubo 33 9. Montaje del espejo o lámpara. El espejo o la lámpara va anclado en el pie o en el brazo del microscopio orientado de tal manera que dirija la luz a la lente del condensador. 10. Estructura final del equipo. Una vez montadas en forma correcta todas las piezas , queda armado el microscopio y listo para ser utilizado. 34 5. ANALISIS SITEMÁTICO (UTILIZACIÓN) 5.1 utilización El microscopio es la herramienta principal que se utiliza en la técnica denominada microscopia, la cual consiste en la observación y análisis de cuerpos y partículas que no son visibles al ojo humano en condiciones normales, es decir a simple vista. La forma de utilizar el microscopio óptico se puede describir a continuación: Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas, la mayoría de ellas pueden verse, algunas a simple vista, y otras mediante instrumentos. Si lo que queremos observar implica la utilización de instrumentos por que estos son demasiado pequeños o diminutos, recurrimos a la microscopia, que estudia este tipo de cuerpos, por medio del microscopio. El siguiente esquema muestra la forma como se apreciarían ciertos elementos vistos a traves del microscopio según su escala de tamaños, desde la visualización en centímetros, milímetros, micrómetros, nanómetros hasta unidades ángstrom. Para usar el microscopio de objetivos secos o de inmersión, se deben tener en cuenta los siguientes pasos: 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: 35 a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítida la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 6. Empleo del objetivo de inmersión: a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 36 h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. 5.2 Observaciones Microscópicas EJEMPLO: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE HONGOS OBJETIVOS 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan MATERIAL Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol Aguja enmangada o lanceta Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos Solución de lactofenol al azul algodón Cinta adhesiva transparente PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS TÉCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra. 2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado 37 sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos. 3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se seccionarán con un bisturí. 4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado. 5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios. PREPARACIÓN EN CINTA ADHESIVA TÉCNICA 2. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. 3. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. 4. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentración de esporas. 5. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. 6. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro. RESULTADOS Moho del tomate: x600 x1500 Aspergillus: x150 x600 (foto a / foto b) Penicillum: x600 x1500 Moho del tomate: x600 x1500 38 Aspergillus: x150 x600 (foto a / foto b) Penicillum: x600 x1500 OBSERVACIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS MATERIALES TÉCNICA Microscopio Portaobjetos Mechero de alcohol Lanceta estéril Cubeta de tinción Frasco lavador Alcohol absoluto Hematoxilina Eosina 39 1. Con la lanceta estéril realizar una punción en un pulgar. 2. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos. 3. Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del porta de manera que se pueda obtener una fina película de sangre. 4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tinción y añadir unas gotas de alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparación. 5. Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar la desecación del colorante agregando más líquido. 6. Lavar la preparación y añadir unas gotas de eosina dejándola actuar 1 minuto. 7. Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante. 8. Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero. 9. Observar al microscopio. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Al microscopio se verán con un dominio predominante los glóbulos rojos, hematíes o eritrocitos teñidos de color rojo por la eosina. No tienen núcleo y son más delgados por el centro que por los bordes. Los glóbulos blancos o leucocitos se identifican fácilmente por la presencia de núcleo, teñido de morado por la hematoxilina. Hay varias clases de leucocitos: 1. Linfocitos (foto): de tamaño aproximado al de los glóbulos rojos, tienen un solo núcleo que ocupa casi todo el glóbulo. 2. Monocitos: son los leucocitos mayores, poco frecuentes normalmente, núcleo grande, redondo, son los más móviles y su función principal es la fagocitosis. 40 3. Polimorfonucleares (foto): núcleo fragmentado o arrosariado. Pueden ser eosinófilos, con abundantes granulaciones teñidas de rojo por la eosina, neutrófilos y basófilos. Las plaquetas no son visibles ya que precisan una técnica especial de tinción. OTRAS OBSERVACIONES Animales: *Insectos: Abeja (Insecto perteneciente al orden de los himenópteros) Avispa (Insecto perteneciente al orden de los himenópteros) Ala de mosca 41 Escarabajo (Insecto coleóptero) * Marinos: Estrella de mar (Animal equinodermo, de cuerpo comprimido, en figura de estrella de cinco puntas, que vive en el mar a diferentes profundidades, según las especies) Cangrejo (Crustáceo comestible de varias formas y clases) Ceritio rupestre (Molusco gasterópodo) Pecten (Molusco lamelibranquio, denominado comunmente vieira) 42 Madrépora (pólipo que se cría formando un polípero poroso) Moluscos varios Tubos de poliqueto *Animales varios: Médula de gato. Glandulas suprarrenales de cerdo. 43 Bazo de oveja. Plantas: Alga marina (planta celular) Granos de polen Algodón Esporas de helecho Objetos varios: Lentejuela 44 Hilo Limaduras de hierro Chinche 5.3 mantenimiento y precauciones al usar el microscopio 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el 45 papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos. 10. Debe ser protegido, guardándolo en el respectivo estuche para evitarle la penetración del polvo y el exceso de humedad. 46 6. ANÁLISIS HISTÓRICO La historia del desarrollo y progreso de la Ciencia Óptica va aparejada, o mejor dicho, es la del Microscopio. Como aparato óptico auxiliar en la investigación científica ha adquirido con el transcurso del tiempo una importancia trascendental, sin precedentes en la historia de los grandes progresos de las ciencias, de la biología en particular. No es exagerado ni aventurado afirmar que entre los múltiples instrumentos destinados a la exploración científica no existe en la actualidad otro que tenga tantas aplicaciones, que se haya generalizado tanto y rinda mayores ventajas que el microscopio. Virtualmente ello encarna un imponderable valor definitivo en el campo de la Ciencia. En efecto, hay ciencias basadas exclusivamente en él y cuyo desarrollo no había sido posible hasta que el microscopio alcanzó cierto grado de perfección. La Bacteriología, la Petrografía y la Metalografía son buenos ejemplos de ello. Otras hay, como la Medicina, la Biología, la Historia Natural, la Química, etcétera, que precisan apelar ineludiblemente a la Microscopia para completar los estudios hechos a simple vista (microscópicamente). Sin su hallazgo el estudio de las cosas y de los seres, o entidades sumamente pequeñas, microscópicas para el alcance de la vista normal del micrógrafo, habría sido prácticamente imposible. El ojo humano, por su especial estructura anatómica, tiene su capacidad visual; de ahí la necesidad de ampliar las impresiones percibidas por nuestra retina con el auxilio de distintos mecanismos o medios ópticos, como es el caso del microscopio, por ejemplo. El conocimiento objetivo, especialmente de los diminutos individuos vivientes que pululan a millares en una gota de agua _ponemos por caso- positivamente ha sido asombro del científico de todos los tiempos. Y la comprobación experimental de que la textura de animales y plantas en último análisis se reduce a una confederación de tejidos y éstos a su vez de células federadas, potencialmente capaces cada una de ellas de vida independiente, con una organización y estructura complejas; así como el hecho comprobado de que la suma total de energías elaboradas por cada uno de estos microscópicos componentes celulares, imprimen a la totalidad del individuo, vegetal o animal, el sello específico de su estirpe en la escala correspondiente, es, repetimos, cosa que maravilla y causa sensación al hombre de ciencia. Con la invención del microscopio se resolvieron problemas esenciales, algunos de los cuales cambiaron nuestra forma de pensar. A continuación se muestra todo lo relacionado con la historia de este instrumento maravilloso. El microscopio se invento, hacia 1610, por Galileo, según los italianos, o por Jansen, en opinión de los holandeses. La palabra microscopio fue utilizada por primera vez por los 47 componentes de la "Accademia dei Lincei" una sociedad científica a la que pertenecía Galileo y que publicaron un trabajo sobre la observación microscópica del aspecto de una abeja. Sin embargo las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopia aparecen en 1660 y 1665 cuando Malpighi prueba la teoría de Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Hooke publica su obra Micrographia. A mediados del siglo XVII un comerciante holandés, Leenwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricación propia describió por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos. Durante el siglo XVIII el microscopio sufrió diversos adelantos mecánicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso aunque no se desarrollaron mejoras ópticas. Las mejoras mas importantes de la óptica surgieron en 1877 cuando Abbe publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss mejora la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro lo que permite obtener aumentos de 2000A principios de los años 30 se habia alcanzado el limite teórico para los microscopios ópticos no consiguiendo estos, aumentos superiores a 500X o 1000X sin embargo existia un deseo científico de observar los detalles de estructuras celulares ( núcleo, mitochondria... etc.). El microscopio electrónico de transmisión (T.E.M.) fué el primer tipo de microscopio electrónico desarrollado este utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de 100.000 X. Fue desarrollada por Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM). 48 Los primeros en usar el microscopio, usaron sistemas de lentes que producían aumentos mucho mayores que los obtenidos con una sola lente. Sin embargo, empleaban lentes imperfectos, de superficies irregulares y con fallas internas. Si se intentaba lograr un aumento apreciable, la visión de los detalles se hacía confusa. El comerciante holandés, Antón van Leeuwenhork usaba lentes simples de pequeños trozos de cristal perfecto. Puliéndolos cuidadosamente, logró aumentar un objeto hasta 270 veces sin perjuicio de la nitidez. Tenía 419 lentes alguna de las cuales eran de cristal de roca y hasta de diamante, en algunos casos no eran mayores que el tamaño de un alfiler, por lo que sus microscopios tenían un tamaño diminuto comparados con otros de la misma época. Con esas lentes observaba todo lo que podía y logró describir los glóbulos rojos de la sangre y los capilares con mayor detalle. Fue el primero en ver a lo que más tarde se llamarían bacterias y a los protozoarios, que él denominó “animalículos”. En el siglo XVIII aparecieron una gran variedad de microscopios. Estos son algunos de ellos: El microscopista danés Otto Muller consiguió en 1773 distinguir lo suficientemente bien a aquellos pequeños seres para clasificarlos en dos tipos: bacilos (que significa “pequeños vástagos”) y espirilos (por su forma espiral). El microscopio se fue perfeccionando con gran lentitud, uno de los defectos de los microscopios primitivos era que sus lentes descomponían la luz blanca en los colores que la constituyen. Los objetos pequeños se veían rodeados de anillos de color (aberración cromática) que impedían observar con claridad los detalles. Pero alrededor de 1820 se perfeccionaron cuando Joseph Jackson Lister, un óptico inglés, diseñó un microscopio acromático capaz de eliminar los anillos de color que limitaban la claridad de la imagen. Lister descubrió que los glóbulos rojos eran en realidad, discos bicóncavos. El microscopio acromático constituyó un gran avance, iniciando una serie de perfeccionamientos que dieron como resultado el moderno microscópio óptico. En 1930 el mundo submicroscópico se amplió con la aparición del microscopio electrónico cuya ventaja principal con respecto al microscopio óptico es un aumento de 1000 veces en la 49 magnificación del material observado acompañado de una mayor capacidad de resolución generando una mejor definición y una ampliación del mundo microscópico. ADN, virus y pequeñas organelas fueron observadas por primera vez con este microscopio. La mayoría de los pioneros en la microscopía electrónica en biología siguen vivos y los dos de los más importantes son: Albert Claude y George Palade, quienes recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1974 por sus logros en biología celular utilizando el microscopio electrónico. Existen dos tipos básicos de microscopios electrónicos los cuales fueron inventados al mismo tiempo pero tienen diferentes usos. El microscopio electrónico de transmisión (MET) proyecta electrones a través de una fina capa de tejido o material a observar produciendo una imagen en dos dimensiones sobre una pantalla fosforescente. El microscopio electrónico de barrido (MEB) produce una imagen que da la impresión de ser en tres dimensiones. Este microscopio utiliza dos o tres puntos de la muestra donde llegan los electrones que escanean la superficie del espécimen a observar y salen del espécimen como electrones secundarios siendo detectados por un sensor. La imagen se produce como el espécimen entero, a diferencia del MET donde la imagen corresponde sólo a los electrones transmitidos. El microscopio cuántico fue presentado por Binning y Röler en 1982 y recibieron en 1986 el Premio Nobel de Física. Este microscopio forma parte de los instrumentos llamados nanoscopios porque posibilitan ver objetos del tamaño en nanómetros. Se lo conoce como "microscopio de barrido de efecto túnel". MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO El Microscopio Electrónico de Barrido permite obtener imágenes de gran resolución en materiales pétreos, metálicos y orgánicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. Los electrones secudarios se asocian a una señal de TV. 50 CARACTERÍSTICAS TÉCNICAS Microscopio Electrónico de Barrido. Imágenes digitales hasta 2048 x 2048 pixel. Resolución de 25 nm a 1 kV y de 3,5 nm a 30 kV. Lentes magnéticas y bomba turbomolecular refrigeradas por agua. Detector de centelleo para electrones secundarios, de Si para electrones dispersados y de Si(Li) para rayos X. Sistema de Microanálisis de Rayos X. Detector de Si(Li) refrigerado con NL para rayos X. Espectros de energía de rayos X con una resolución de 128 eV. Detección cualitativa de elementos. Imagen de los elementos en la muestra. APLICACIONES HORMIGONES Y ARIDOS Mineralogía de cementos: clínker, alitas, etc... Mineralogía de áridos: granito, calizas, etc... Crecimientos cristalinos, texturas, fisuraciones, porosidades, fragilidad, etc... Fases reactivas, productos expansivos. Interferencia árido pasta, índice de huecos, etc... Composición microquímica, alteraciones, etc... Cuantificación de parámetros de caracterización METALES Y ORGANICOS Análisis morfológico y fractográfico. Análisis de inclusiones. Corrosión de superficies y oxidaciones. Estudio, análisis y evaluación de fases. Cartografía de elementos químicos. Ataques superficiales por alteración. Espesores y distribución de capas. Microscopio electrónico de transmisión 51 Un microscopio electrónico de transmisión es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto debido a que la potencia amplificadora de un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de la luz visible. Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz pueden mostrar estructuras mucho más pequeñas. Las partes principales de un microscopio electrónico son: Cañón de electrones, que emite los electrones que chocan contra el espécimen, creando una imagen aumentada. Lentes magnéticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios ópticos no funcionan con los electrones. Sistema de vacío es una parte muy importante del microscopio electrónico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las moléculas del aire, se debe hacer un vacío casi total en el interior de un microscopio de estas características. Placa fotográfica o pantalla fluorescente que se coloca detrás del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora. El microscopio electrónico de transmisión emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrónico de transmisión debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ángstroms. Los microscopios electrónicos de transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de veces. El primer microscopio electrónico de transmisión fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ruska y sus colaboradores. La óptica básica de ese primer microscopio electrónico se mantiene hasta nuestros días; los cambios en los microscopios modernos consisten en adicionar más lentes para incrementar el ámbito de aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrónico de transmisión comercial lo construyó la Siemens en 1939. 52 Bibliografía B.N Begunov, N.P Zakarnov, Teoría de sistemas ópticos, Págs. 172-229, 264391. Editorial MIR-Moscú. México-URSS 1976 CETTO Ana María. La luz en la naturaleza y en el laboratorio. Colección La ciencia para todos, fce, 6ª reimpresión, México, 1996. DOUGLAS C. Giancoli. Física, principios con aplicaciones. Prentice-Hall Hispanoamericana, S.A. 4ª edición, 1997. DREYFUS Cortés, Georges. El Mundo de los microbios. Colección La ciencia para todos, fce, 5ª reimpresión, México, 1996. VELASCO Oyarzabal, Félix. Lecciones de física, Editorial cecsa, México, 1979. Hecht, Eugene, Óptica Págs. 151-241 3a edición, Editorial Adisson Wesley iberoamericana España 2000. M.N Mirkovich, W.N Makarenko, sistemas ópticos avanzados y principios ópticos cuanticos, Págs. 259-315, 1a edición, Moscú, URSS 1967. DIRECCIONES ELECTRÓNICAS: http://www.aldeaeducativa.com/aldea/Tareas2.asp?which=40 http://www.joseacortes.com/practicas/microscopio.htm http://www.monografias.com/trabajos12/micros/micros.shtml http://www.biologia.arizona.edu/cell/cell.html http://www.correodelmaestro.com http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar Bibliografía temática: Curiosas microfotografías con microscopía de barrido y posibilidad de manejar virtualmente uno de estos microscopios http://www.denniskunkel.com/ Completa colección de técnicas de tinción, con sus correspondientes protocolos http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html 53 Completo tratado sobre microscopía electrónica: fundamentos, microscopios, preparación de muestras y procesado digital de las imágenes http://emoutreach.sdsc.edu/web-course/toc.html Completo tutorial de digitalización de imágenes, donde se explican los términos básicos http://www.library.cornell.edu/preservation/tutorialspanish/contents.html Descripción y funcionamiento del microscopio electrónico de barrido y galería de imágenes http://www.mos.org/sln/sem/ Descripción y fundamento de los microscopios electrónicos de transmisión y barrido http://www.unl.edu/CMRAcfem/em.htm Fundamentos de la microscopía de resonancia magnética y completa galería de imágenes animadas http://wwwcivm.mc.duke.edu/civmGallery/L1Gallery.html Fundamentos del microscopio electrónico de barrido, descripción del funcionamiento con numerosos esquemas. Galería de imágenes http://www.mse.iastate.edu/microscopy/home.html Fundamentos teóricos de microscopía óptica, fluorescencia y confocal http://www.btrip.mednet.ucla.edu/bri/homepage.htm Manual de técnicas de preparación de muestras y tinción http://bris.ac.uk/pathandmicro/cpl/lablinks.html Microscopía confocal y de fluorescencia http://www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/ Numerosos tutoriales en java sobre el manejo de distintos microscopios. Se puede descargar un completo manual sobre microscopía en formato Acrobat. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html Página de la casa Leica, sobre fundamentos de este microscopio y modelos http://www.leica-microsystems.com/llt_index.html Página de introducción al funcionamiento del microscopio confocal, preparación de muestras y procesado de las imágenes http://www.cs.ubc.ca/spider/ladic/intro.html