Bioquímica de Macromoléculas Estructura y Química de proteínas Trabajo Práctico "Determinación del Radio de Stokes de proteínas globulares por cromatografía de exclusión molecular (SEC-FPLC)" Objetivos Determinar los Radios de Stokes de la lisozima en distintas condiciones por cromatografía de exclusión molecular (Fast Protein size-exlusion liquid chromatography (SEC-FPLC)). Introducción El tamaño de una proteína globular medido por cromatografia de exclusión molecular es el volumen promedio que ésta molécula ocupa en solución y es frecuentemento expresado como el Radio de Stokes. Este parámetro es especialmente sensible a la forma y a las propiedades físicas de la proteína. El peso molecular de dicha proteína puede ser estimado a partir de los dato de la filtración molecular sólo si la columna utilizada es apropiadamente calibrada con proteínas que tienen aproximadamente la misma forma, las mismas propiedades fisicas y se conoce por otros métodos su Radiode Stokes y su peso molecular. Según lo reportado en la literatura (Uversky, V., Biochemistry, 32 (1993), 13288-13298) el Radio de Stokes determinado por FPLC se correlaciona con los valores obtenidos por métodos utilizados frecuentemente, como cálculo a partir de la viscosidad intrínseca de la solución. Procedimiento experimental Equipamiento Para los experimentos de filtración molecular mencionados, utilizamos un aparato de FPLC (Pharmacia, Uppsala, Sweden) equipado con una columna de Superosa 12. El loop de inyección, posee 100l de capacidad y todas las corridas se realizaran a un flujo de 0.5 ml/min. La detección se realiza a una longitud de onda de 280nm y la sensibilidad del detector es fijada a 0.1. Todos los buffers son pasados a través de un filtro de Nylon 66 de 0.2 m (Rainin Instrument Co.) antes de ser introducidos en la columna. En este caso, todas las corridas se efectuarán en buffer fosfato de sodio 0.1M pH 7. Calibración de la columna de Superosa 12 Para la calibración de la columna se utiliza un set de proteínas de peso molecular conocido. 100l de la mezcla a separar se siembran en la columna y luego se grafica la dependencia del tiempo de retención con el Log10 del Radio de Stokes. Este último valor, se obtiene a partir de la siguiente ecuación: log Rs= 0.369 (log MW) - 0.254 que relaciona el peso molecular de la proteína con su Radio de Stokes. La mezcla de proteínas a utilizar para calibrar la columna (BIO RAD , Molecular Weight Markers) consta de: Thyroglobulin (670 kDa), bovine globulin (150 kDa), chicken ovoalbumin (44 kDa), equine myoglobin (17 kDa), vit.B12 (1.35 kDa). Una vez obtenido el gráfico de log Rs vs tiempo de retención para las proteinas de radio de Stokes conocido, obtengo la ecuación de la recta ajustada que caracterizará a la columna. Determinación del Rs de las proteínas problema Se inyectarán en la columna 100 l de las soluciones de lisozima obtenidas en todos los puntos del TP ¨Determinación de tioles libres y puentes disulfuro en proteínas", parte B. En el caso en que las proteínas se hayan obtenido en condiciones nativas (buffer fosfato de 2 sodio), la columna deberá estar quilibrada en el mismo buffer. Si la proteína se encuentra desnaturalizada (en buffer con clruro de guanidinio), la cromatografia debe realizarse en las mismas condiciones (se deberá equilibrar previamente la columna en dicho buffer). De esta manera, se obtendrán el Rs de la proteína reducida, sin reducir, nativa y desnaturalizada mediante la ecuación de la recta que se obtuvo en la calibración. Esta ecuación permitirá averiguar el radio de Stokes de la proteína problema a partir de sus datos de tiempo de retención en la columna. 3