CÁTEDRA

CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Licenciatura en Alimentos
TRABAJO PRÁCTICO
PURIFICACIÓN DE FOSFATASA ÁCIDA INESPECÍFICA DE TUBÉRCULO DE PAPA
(Solanum tuberosum) Y DETERMINACIÓN DE SUS PARÁMETROS CINÉTICOS.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas fosfatasas hidrolizan monoésteres de fosfato en una reacción
termodinámicamente favorable. (ΔGo’<-9KJ/mol-1). Son monómeros o dímeros de peso
molecular aproximado a 50 ó 60 kDa. Se diferencian entre sí por su pH óptimo de catálisis
(ácidas o alcalinas), PM, respuesta frente a distintos efectores, activadores e inhibidores. Se
encuentran en una gran variedad de especies y tejidos.
En los seres vivos el anión ortofosfato (Pi) juega un rol vital en la transferencia de energía
y en la regulación metabólica, siendo un importante constituyente estructural de muchas
biomoléculas. Su acumulación a partir del medio ambiente, depósito y metabolismo son
críticos para el desarrollo y crecimiento de todos los organismos, entre ellos los vegetales.
Durante este ciclo de trabajos prácticos se purificará fosfatasa ácida de tubérculo de
papa. Se caracterizará a la enzima purificada mediante determinación de su masa
molecular, determinación de parámetros cinéticos (Km, Vmáx) y se observará el efecto de
su inhibidor natural, el Pi.
Este trabajo práctico se desarrollará durante tres sesiones:
Sesión 1: Purificación de fosfatasa ácida: Etapas I y II
Espectros de pnitrofenol y proteínas
Sesión 2: Purificación de fosfatasa ácida: Etapa III
Determinación de concentración de proteínas
Construcción de la tabla de purificación.
Sesión 3: Determinación de parámetros cinéticos.
Determinación de peso molecular.
MATERIALES
Buffer de extracción(BE):
acetato de sodio 50 mM pH 5,2
sal sódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM
fluoruro de fenil metilsulfonilo (PMSF) 1 mM
β-mercaptoetanol (BME) 2 mM (agregar en el momento de usar)
Polietilénglicol (PEG) 50% (P/V)
Columna de intercambio aniónico QAE-Sepharose®
Buffer de columna (BC):
Tris HCl 50 mM pH 7,5
β-mercaptoetanol 1 mM (agregar en el momento de usar)
EDTA1 mM.
Citrato de sodio 200 mM pH 6,5
p-nitrofenil-fosfato (pNPP) en pastillas conteniendo cada una 25 µmoles de reactivo.
a) 90 mM. Se prepara la solución con citrato de sodio 200 mM (pH= 6,5). Se utilizará
como sustrato en las medidas de actividad enzimática que se realizarán para
seguimiento de la purificación.
b) 50 mM. Se prepara la solución en medio acuoso. Se utilizará como sustrato en las
medidas de actividad enzimática que se realizarán para medir los parámetros
cinéticos de la enzima.
NaOH 500 mM
Fosfato de sodio 100 mM
Reactivo de Comassie: Comassie Blue 6250 0.06 % en 3% P/V de ácido perclórico
(concentración final 0,3 M) para medir concentración de proteínas. (Método de Bradford)
MÉTODOS
Determinación de actividad enzimática
Para la determinación de la actividad de fosfatasa ácida se utilizarán los métodos continuo y
discontinuo. En ambos casos se empleará el sustrato artificial p-nitrofenil-fosfato (pNPP) que
es hidrolizado según la siguiente reacción:
El p-nitrofenol absorbe a 405 nm. El coeficiente de extinción a pH=6,5 (pH de la
determinación por método continuo) es 4400 M-1cm-1. .
Método discontinuo en placa: este método es cualitativo y permite comparar entre muestras
con distintas actividades. Se realizará en un volumen final de reacción enzimática en cada
pocillo de 200 µl empleando pNPP 45 mM (pH=6,5) + H2O csp 170 µl. Iniciar la reacción con
30 µl de muestra y finalizarla luego de tres minutos con el agregado de 50 µl de NaOH 500
mM.
Método continuo: se realizará espectrofotométricamente a 405 nm en cubeta con un
volumen final de 1000 µl,utilizando como buffer citrato 100 mM pH=6,5. La concentración de
sustrato a emplear será a concentración saturante para determinación de actividad
enzimática (pNPP 45 mM) o concentraciones no saturantes (0,5 mM, 1 mM, 2mM, 4 mM, 6
mM y10 mM) para determinación de parámetros cinéticos. La reacción se iniciará con el
agregado de muestra. Se determinará la ΔA/min en condiciones de linealidad.
Cuantificación de proteínas
Se utilizará el método de Bradford (ver fundamento al final). Se emplearan 0,5 ml de reactivo
de Comassie y 0,5 ml de agua más muestra. Leer absorbancia a 595 nm. Se recomienda
realizar la lectura de absorbancia dentro de las 2 horas de agregado el reactivo, ya que
después de este período el complejo proteína-colorante aumenta de tamaño y precipita.
Realizar una curva de calibración usando una solución testigo de albúmina 0,1 mg/ml. La
cantidad de proteína a emplear en este ensayo debe estar en el rango de sensibilidad del
método (2 a 12 g). Se recomienda hacer el blanco por duplicado y emplear 5 volúmenes
distintos de testigo.
Electroforesis en condiciones desnaturalizantes en geles de poliacrilamida
Se emplearán geles con una concentración de poliacrilamida del 10%. Se sembrarán 20 µl
de cada muestra junto con marcadores de peso molecular conocido.
Determinación de espectros
a) Espectro de absorción del pnitrofenol
Las enzimas fosfatasas ácidas tiene un pH óptimo de alrededor de 5,0. A ese pH no se
podría realizar una medida de actividad enzimática con aparición de pnitrofenol pues se
vería la interferencia del pnitrofenol fosfato (ver gráfico). Por esto es que se hacen las
medidas a pH 6,5. No se ve actividad máxima de la enzima (no es su pH óptimo), pero
se puede detectar casi sin interferencias la aparición de pnitrofenol a 405 nm.
Se realizará el espectro de absorción del pnitrofenol a 3 pHs distintos: 2,3; 6,5 y 9,2,
utilizando distintos buffers: acetato, citrato y dietanolamina, respectivamente.
b) Seguido a esto se realizarán espectros de absorción de distintas proteínas y se
discutirá la utilidad de las medidas de absorción a 220 nm y 280 nm como métodos
para la determinación de la concentración de las mismas. (ver fundamento al final del
cuadernillo)
PRIMERA SESIÓN
1- Purificación de fosfatasa ácida de papa.
Se obtendrá un extracto crudo de las enzimas de tubérculo de papa mediante tratamiento
con un homogeneizador de mesa Polytron®, posterior precipitación con PEG y por último,
cromatografía de intercambio iónico en QAE- Sepharosa. De cada una de las fracciones
se medirá el volumen y se reservará una fracción para la posterior determinación de
actividad enzimática por método continuo, concentración de proteínas (datos
necesarios para la realización de la tabla de purificación) y electroforesis en
condiciones desnaturalizantes.
1-a Obtención de extracto crudo. Etapa I.
A 22,5 g de tubérculo de papa adicionar 10 ml de buffer de extracción y homogeneizar en
frío. Centrifugar en tubos de Eppendorf a 13.000 rpm por 3 min. Se medirá el volumen del
sobrenadante. (Etapa I en la tabla de purificación). Separar 1 ml para posterior medición de
actividad enzimática, concentración de proteínas y electroforesis en gel de poliacrilamida.
1-b Precipitación con PEG (50 %). Etapa II.
Al volumen restante de extracto crudo agregar un volumen de PEG (50%) de manera que
la concentración final del mismo sea del 20 % (ver cálculo en pág 8). Agitar 40 min en baño
de hielo. El total del volumen se fraccionará en tubos de Eppendorf. Centrifugar a 13000 rpm
por 10 min. Descartar el sobrenadante, resuspender todos los precipitados obtenidos con
0,9 ml total de BC (se recomienda pasar de un tubo a otro).
Centrifugar a 13000 rpm por 10 min. Reservar el sobrenadante (a).
Resuspender el precipitado con 0,5 ml del mismo buffer BC y volver a centrifugar en las
mismas condiciones anteriores. Reservar el sobrenadante (b).
Reunir los sobrenadantes (a) y (b).
Resumen del paso:
Precipitación con PEG
+ Centrifugación
Sobrenadante DESCARTAR
Precipitado REDISOLVER con 0,9 ml de BC
Nueva Centrifugación
Sobrenadante GUARDAR (a)
Precipitado REDISOLVER con 0,5 ml de BC
Última Centrifugación
Sobrenadante GUARDAR (b)
Precipitado DESCARTAR
Reunir fracciones (a) y (b)
Luego de mezclar por inversión, medir el volumen (Etapa II). Separar 100 µl para medición
posterior de actividad enzimática, determinación concentración de proteínas y electroforesis
en gel de poliacrilamida.
2- Determinación de actividad enzimática de etapas I y II.
Determinar la actividad enzimática por el método continuo empleando 30 µl y 60 µl del
extracto crudo (Etapa I) obtenido para comprobar linealidad con cantidad de proteína.
Para la medida de las fracciones (a) y (b) reunidas (Etapa II) utilizar sólo 30 µl.
La concentración de sustrato es saturante (45 mM) para asegurar linealidad en el tiempo. El
medio de reacción contiene buffer citrato 100 mM, pH 6,5, y se trabaja a temperatura de 30
ºC..Las cubetas se preparan a partir de 500 µl de pNPP 90 mM (en citrato 200 mM) + 470 µl
de H2O + iniciar la reacción con los volúmenes antes descriptos.
Nota: por reacción no enzimática el sustrato pNPP (en citrato 200 mM pH 6,5) genera
pnitrofenol al mezclarlo con agua. La absorción a 405 nm se estabiliza
aproximadamente a los 10 min. Por ello se recomienda hacer la solución 10 min
previos a la medición de actividad)
3- Realización de espectros de absorción de pnitrofenol y proteínas.
Se hará entre las longitudes de onda 200 y 500 nm, con un máximo de absorción de 3,0 y
un intervalo de lecturas entre 2 y 5 nm.
SEGUNDA SESIÓN
4- Separación cromatográfica en QAE-Sepharosa. Etapa III.
Se utilizará una columna de 5 ml, con 3 ml de volumen de lecho, previamente equilibrada
con 2 volúmenes de etanol al 20 % más 2 volúmenes de buffer de columna BC. Se
sembrará lo que reste del sobrenadante anterior (a)+ (b) y se agregarán en forma sucesiva a
la columna, con pipeta:
6 ml de buffer BC,
6 ml de (buffer BC + NaCl 25 mM)
6 ml de (buffer BC + NaCl 200 mM)
6 ml de (buffer BC + NaCl 500 mM)
Se recogerán fracciones de 6 ml (recordar invertir cada tubo varias veces para lograr una
correcta homogeneización del eluído). Se seguirá la aparición de actividad fosfatasa
midiendo actividad enzimática por método discontinuo, en placa. Se colocará en 5 pocillos
(1 pocillo blanco de reactivos, en donde se reemplazará el eluído por H2O y 4 pocillos para
cada tubo eluído de la columna), 100 µl de pNPP (90 mM en citrato) + 70 µl de H2O . Se
inicia la reacción con 30 µl de cada una de las muestras a analizar en forma secuencial,
agitando mediante pequeños golpes laterales en la placa para la mezcla adecuada de los
reactantes. Al término de 4 min se finaliza la reacción con 50 µl de NaOH 500 mM y se
visualiza en qué fracción hay más actividad fosfatasa. Se medirá el volumen de la misma
(Etapa III de la tabla de purificación) y se separará 1 ml para medición posterior de actividad
enzimática, determinación de concentración de proteínas y electroforesis en gel de
poliacrilamida.
5- Determinación de actividad enzimática de la etapa III.
Se empleará el método continuo. Iniciar la reacción con 30 µl de la fracción del eluido de
columna con mayor actividad.
6- Determinación de proteínas de Etapas I, II y III.
Se empleará el método de Bradford. El protocolo se muestra en forma incompleta en el
siguiente cuadro:
B
1
2
3
4
5
EC
a
EC
b
PE
Ga
PE Elui Elui
G b do a do b
Testigo (µg)
0
--
--
--
--
--
--
Testigo (µl)
0
--
--
--
--
--
--
Muestra (µl)
--
H2O (µl)
Rvo color
(µl)
Abs a 595
nm
--
--
--
--
--
20
80
20
80
20
80
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500 500
Abs - blanco
Se recomienda utilizar 20 y 50 µl de una dilución 1/20 de las etapas I y II. Los mismos
volúmenes para la etapa III sin diluir.
TERCERA SESIÓN
7- Determinación de Km, V máx y Ki (Efectos de la concentración de sustrato y del
inhibidor sobre la actividad enzimática)
Se realizarán en forma conjunta según se indica en los puntos 7a y 7b.
7a- Determinación de Km y V máx (Efectos de la concentración de sustrato
sobre la actividad enzimática)
Se utilizará la fracción eluída de la columna con mayor actividad fosfatasa para las medidas
cinéticas.
El sustrato pNPP 50 mM se preparará en solución acuosa como se indicara anteriormente .
Previo al inicio de las medidas cinéticas se deberá observar linealidad con la menor
concentración de sustrato programado (en este caso 0,5 mM) durante 2 min de reacción.
(Ver problema Nº 7 de la guía de problemas de enzimología). Si no se observa linealidad
disminuir el volumen de muestra empleado.
Se determinará la velocidad inicial de la reacción por el método continuo para distintas
concentraciones de sustrato. Las concentraciones de sustrato a emplear son 0,5, 1, 2, 4, 6 y
10 mM y el volumen final de reacción es de 1 ml. Iniciar la reacción con el agregado de
eluído. El protocolo de trabajo se indica en forma incompleta en el siguiente cuadro
[pNPP]
0,5 mM
citrato 200 mM
pNPP 50 mM
H2O
Eluido
(Sugerido)
500 l
1 mM
2 mM
4 mM
6 mM
10 mM
250 l
7b- Determinación de Ki (Efecto del inhibidor sobre la actividad enzimática)
Se evaluará al fosfato (Pi) como inhibidor. Se trabajará con concentraciones de fosfato 0,5,
1,0 y 2,0 mM. Para ello, sobre las mismas cubetas con concentraciones de sustrato 4, 6
y 10 mM empleadas en el punto anterior se harán agregados sucesivos de fosfato 50 mM
según se muestra en la tabla siguiente
pNPP
Control (A/min)
+ 10 µl Pi 50 mM
(A/min)
+ 10 µl Pi 50 mM
(A/min)
+ 20 µl Pi 50 mM
(A/min)
Completar los datos
agregado.
0,5 mM
1 mM
2 mM
-----
-----
----
-----
-----
----
-----
-----
----
4 mM
6 mM
10 mM
hallados en la tabla. Se determinarán las pendientes luego de cada
Determinar gráficamente Km y Vmáx.
De la misma manera indicar que tipo de inhibidor es el fosfato y cuál es su Ki.
8- Electroforesis en geles de acrilamida: evaluación de los pasos de purificación y
determinación de la masa molecular.
Se mostrarán geles previamente preparados y procesados por los docentes. La muestra de
proteínas a sembrar previamente debe hervirse 3 min en presencia de “sample buffer” (5X).
Se siembran 20 µl de muestra y 20 µl de marcadores de masa molecular (MM). Se corre
durante una hora a 40 mA. Se extrae el gel de corrida y se tiñe con azul de Coomassie (1
hora) y se decolora.
Se observarán las distintas bandas de proteínas y se determinará la MM de la fosfatasa
ácida purificada.
PRESENTACIÓN DEL INFORME
En el informe se deberá presentar:
 Un perfil de la columna de QAE-Sepharosa en el cual se graficará la actividad
enzimática, cualitativamente, versus el volumen de elución.
 Una tabla de purificación con los siguientes items: volumen, actividad (U/ml),
concentración de proteína (mg/ml), cantidad total de proteína (mg), U totales,
actividad específica (U/mg), rendimiento (parcial y total) y purificación (parcial y total).
 v =f(s) para comprobar cinética hiperbólica.
 1/v= f(1/s) para cálculo de Km y Vmáx.
 1/v= f(I) para determinación de Ki.
 Masa molecular aproximada de la enzima purificada utilizando un método gráfico
conocido.
INFORMACIÓN ADICIONAL
 EDTA: es un quelante que secuestra metales pesados que potencialmente podrían inhibir
la actividad enzimática.
 PMSF: es un inhibidor de proteasas. Se incluye en el medio de extracción porque durante
la homogeneización se liberan proteasas endógenas que pueden afectar la
estructura molecular de la enzima en estudio, y consecuentemente, la medida de su
actividad.
 β-mercaptoetanol: es un reductor de grupos disulfuro, necesario para preservar la
actividad de la enzima frente a oxidantes naturales que se liberan durante el proceso
de homogeneización.
 Polietilenglicoles: son polímeros no iónicos de óxido de etileno cuyo tamaño varía de
200 a 20000 Da. Son muy solubles en agua debido a la formación de múltiples
enlaces de hidrógeno.
La estructura química es la siguiente
HO-CH 2 -(CH 2 -O-CH 2 -) n -CH 2 -OH
Estos polímeros en solución atraen moléculas de agua de la capa de solvatación
alrededor de la proteína. Esto aumenta las interacciones proteína-proteína y
favorece la precipitación de las mismas. El proceso es independiente del pH y de la
fuerza iónica. Sólo depende de la concentración del polímero y las dimensiones de la
macromolécula.
Son menos propensos a desnaturalizar los biomateriales de precipitación que los
iónicos.
Además, los PEG son los preferidos para la precipitación de proteínas, porque la
viscosidad de las soluciones concentradas es más baja que la hallada en otros
polímeros no iónicos (dextranos, polivinilpirrolidona y polipropilenglicoles) y la
formación de los precipitados toma mucho menos tiempo que con sulfato de amonio
o etanol.
Una desventaja de PEG es la dificultad de la eliminación cuando se usa a altas
concentraciones.
- Cálculo de volumen de PEG 50 % a utilizar.
Se tiene en cuenta la siguiente fórmula:
Ci . Vi = Cf . Vf, reemplazando
50% . Vx = 20 % (Vext crudo + Vx)
Se despeja de la ecuación Vx y es ése el volumen de PEG 50 % que se tiene que
agregar al Vext crudo para que la concentración final sea de PEG 20 %.
 QAE-Sepharose® (Dietil-(2-hidroxipropil) aminoetil (QAE) – Sepharose: es una matriz
empleada para preparar columnas de intercambio aniónico. Sepharose es un nombre
comercial de un reticulado, material polímero polisacárido extraído de algas marinas
al que se incorpora químicamente una amina cuaternaria. La estructura química de la
amina cuaternaria es la siguiente:
Reticulado-OCH2CH2N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3
Regeneración: Usualmente el lavado la columna con una solución salina de alta
fuerza iónica (por ejemplo NaCl 1 M) o con los pHs extremos tolerables es suficiente
para remover todo el material reversiblemente unido. Cuando es necesario los lípidos
y proteínas precipitados pueden eliminarse lavando con NaCl 1-2 M (un volumen de
columna (VC)), seguido de 1 VC de NaOH 0,1 M en NaCl 0,5 M y enjuague con
varios VC de agua. Luego se reequilibra la columna con el buffer de columna y el pH
adecuados.
 Método de Bradford
Se basa en que el colorante azul brillante de Coomassie sufre un cambio en
absorbancia a 595 nm cuando se une a proteínas.
Las ventajas de esta técnica con respecto a otras que también dosan proteínas son:
rapidez y simplicidad, ya que requiere un solo reactivo y el desarrollo de color es
inmediato, estabilidad de la absorbancia del complejo del complejo proteína colorante
y presencia de pocas interferencias.
Sensibilidad del método 2 a 12 µg de proteína.
Entre las desventajas se encuentra que diferentes proteínas producen distintas
intensidades de color.
 Electroforesis en geles de acrilamida
La acrilamida en presencia de radicales libres, aportados por persulfato de amonio y
estabilizados por TEMED, inicia una reacción en cadena en la que monómeros de
acrilamida son polimerizados en largas cadenas. Cuando se incluye bisacrilamida las
cadenas se entrecruzan para formar un gel, cuya porosidad es determinada por el largo
de las cadenas y el grado de entrecruzamiento.
Esta mezcla se vuelca entre dos vidrios separados por espaciadores y sellados con
agar. Así se evita la exposición al aire, ya que el oxígeno inhibe la polimerización,
quedando sólo la capa superior, la cual se cubre con isobutanol o agua.
Estos geles se usan para separar proteínas y ácidos nucleicos que tengan entre 5 y 500
pares de bases.
En primer lugar se prepara la parte inferior del gel llamada gel de separación. Una vez
gelificado se prepara la parte superior, más laxa, en la que se coloca un peine que
determina las distintas calles, llamada gel de concentración, en el que se concentra la
muestra, lo que permite sembrar cantidades mayores de muestra que en agarosa. La
muestra se prepara en “sample buffer” que contiene azul de bromofenol para seguir la
corrida y SDS y betamercaptoetanol para desnaturalizar las proteínas.
 Espectros de absorción de proteínas
Ninguno de los 20 aminoácidos hallados en las proteínas absorbe luz en la zona del
espectro visible. Las proteínas simples tampoco absorben en el visible, pero hay
proteínas conjugadas (con grupos prostéticos) que absorben porque lo hace el grupo
prostético.
Todos los aminoácidos y proteínas absorben en la región del ultravioleta lejano (180-220
nm), debido a la absorción del enlace peptídico.
Los aminoácidos aromáticos – triptofano, tirosina y fenilalanina- absorben luz en el
ultravioleta cercano, con un máximo en las longitudes de onda 278-280 nm. Dado que
las proteínas contienen restos de estos aminoácidos, las medidas de absorbancia a 280
nm constituyen un método rápido para la determinación del contenido de proteínas de
una solución.