UNIVERSIDAD INTERAMERICANA Recinto de Bayamón

UNIVERSIDAD INTERAMERICANA
Recinto de Bayamón
Bioquímica
CHEM 4220 Laboratorio
Prof. J. R. Ramirez Vivoni
Prof. Alberto Vivoni Alonso
Lab #3: Análisis espectroscópico de p-nitrofenol
Introducción
P-nitrofenol imita las propiedades espectrofotométricas de una proteína típica. Esto se
debe a que las proteínas contienen tres aminoácidos aromáticos cuya absorción de luz
es similar al p-nitrofenol. Estos aminoácidos son fenilalanina, tirosina y triptófano. Como
muchos cromóforos (grupos que absorben luz), tales como indicadores de pH y tintes,
los grupos aromáticos son sensitivos al pH. En la Parte I de este experimento se
obtendrá el espectro de una solución p-nitrofenol en medio básico y acídico y se
determinará el max de las soluciones, esto es, la longitud de onda de mayor
absorbancia en el espectro.
Luego que se determine el pH al cual p-nitrofenol absorbe y el max, en la Parte II de
este experimento se obtendrá la absorbancia de diferentes concentraciones de pnitrofenol para hacer una curva de calibración. Con la curva se determinará la
concentración de un desconocido.
Procedimiento
Parte I
1. Coloque 1 mL de la solución de p-nitrofenol en cada una de dos (2) cubetas
2. Añada 3 mL de la solución amortiguadora de pH 5 en una cubeta y de pH 10 en
la otra. Asegúrese de identificar cada una. La solución de pH 5 consiste de
ácido acético y agua; la de pH 10 consiste de glicina, agua y un poco de NaOH
diluido.
3. Como blanco utilice 4 mL del amortiguador correspondiente en otra cubeta.
4. Utilizando el blanco correspondiente y la preparación a pH 5, determine la
absorbancia entre 340 a 900 nm.
5. Repita el procedimiento utilizando la otra cubeta con p-nitrofenol a pH 10 y el
blanco correspondiente.
Parte II
1. En matraces volumétricos de 10 mL, prepare las siguientes cuatro (4) soluciones
con los volúmenes de 0.1 mM de p-nitrofenol que se le indica en la Tabla 1.
Llene hasta la marca del matraz con el amortiguador a que obtuvo absorbancia
en la Parte I.
Tabla 1. Diluciones de la solución de 0.1 mM de p-nitrofenol.
# de solución
Volumen de pnitrofenol (mL)
Volumen total
(mL)
1
7.5
10.0
2
5.0
10.0
3
3.0
10.0
4
1.0
10.0
2. Mida la absorbancia de cada una de estas 4 diluciones a la longitud de onda
determinada anteriormente.
3. Determine la absorbancia del desconocido asignado por el profesor.
Informe

Introducción: a) Explique lo que es análisis cuantitativo y análisis cualitativo. b)
Explique los tipos de análisis que hizo en este experimento. c) Explique el
objetivo del experimento, las condiciones bajo las cuales llevó a cabo el
experimento y como determinaron esas condiciones.

Teoría: a) Explique lo que es la ley de Beer-Lambert. b) Explique qué es cada
símbolo en la ecuación de Beer-Lambert, como se relacionan entre sí y como
afecta el paso de la luz por la muestra.

Instrumentación: a) Describa las partes básicas de un espectrofotómetro. b)
Explique a qué corresponden los ejes en un espectro de absorción y como se
obtienen los valores de graduación de cada uno de los ejes. c) Explique
absorbancia y trasmitancia en base a la luz que entra y sale de la muestra. d)
Explique la relación entre absorbancia y trasmitancia.

Datos: a) Reporte el pH a que obtuvo absorbancia y el max en la Parte I del
experimento.

Cálculos: a) Calcule las concentraciones de las soluciones en la Tabla 1 y
muestre un ejemplo de un cálculo. b) Haga una curva de calibración en EXCEL
de absorbancia vs concenración. c) Obtenga la ecuación y R2 de la línea recta.
d) Con la ecuación de la línea recta, calcule la concentración del desconocido.

Resultados: a) Presente una tabla con los datos de volumen de solución de 0.1
mM de p-nitrofenol, su concentración y su absorbancia para las soluciones en la
Tabla I. b) Presente la gráfica de la curva de calibración.

Discusión: a) Dibuje la estructura molecular de p-nitrofenol en una solución ácida
y en una solución alcalina. ¿A qué conclusiones puede llegar en base a lo que
observó en este experimento? b) Describa la información que obtuvo en la Parte
I de este experimento y como la usó en la Parte II. c) Analice sus datos de la curva
de calibración en base a R2 y describa posibles fuentes de error.