VITAMINA A H3C CH3 CH3 CH3 R O CH3 R=H R=CO-CH3 R=CO-C2H5 R=CO-C15H31 C20H30O C22H32O2 C23H34O2 C36H60O2 PM: 286,5 PM: 328,5 PM: 342,5 PM: 524,9 Sinonimia - Palmitato de Retinol. Definición - La Vitamina A refiere a un número de sustancias de estructura muy similar (incluyendo los isómeros (Z), que se encuentran en tejidos animales y que poseen actividad semejante). La sustancia principal y biológicamente más activa es aquella que posee todos sus enlaces en posición (E): todo-(E)-3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilciclohex1-enil)nona-2,4,6,8-tetra-en-1-ol (C20H30O). La vitamina A se emplea en forma de ésteres tales como acetato, propionato y palmitato. La expresión éster de retinol sintético se refiere a un éster de retinol sintético (acetato, propionato o palmitato) o una mezcla de ésteres de retinol sintético. La actividad de la Vitamina A se debe expresar en equivalentes de retinol (ER). 1 mg de ER corresponde a la actividad de 1 mg de todo-(E)retinol. La actividad de los otros ésteres de retinol se calcula estequiométricamente, de modo que 1 mg de ER de Vitamina A equivale a la actividad de: 1,147 mg de acetato de todo-(E)-retinol, 1,195 mg de propionato de todo-(E)-retinol, 1,832 mg de palmitato de todo-(E)-retinol. Se emplean también las Unidades Internacionales (UI) para expresar la actividad de la Vitamina A. 1 UI de Vitamina A equivale a la actividad de 0,300 g de todo-(E)-retinol . La actividad de los otros ésteres de retinol se calcula estequiométricamente, de modo que 1 UI de Vitamina A equivale a la actividad de: 0,344 g de acetato de todo-(E)-retinol, 0,359 g de propionato de todo-(E)-retinol, 0,550 g de palmitato de todo-(E)-retinol, 1 mg de equivalente de retinol corresponde a 3333 UI. Caracteres generales - El acetato de retinol se presenta como cristales de color amarillo pálido, con un punto de fusión de aproximadamente 60 °C. Cuando funde, el acetato de retinol, tiende a formar una masa sobreenfriada. El propionato de retinol se presenta como un líquido oleoso pardo rojizo. El palmitato de retinol es un sólido lipoideo amarillo claro, o si se funde, un líquido oleoso amarillo, con un punto de fusión de aproximadamente 26 ºC. Todos los ésteres de retinol son solubles o parcialmente solubles en etanol, miscibles con solventes orgánicos y prácticamente insolubles en agua. La Vitamina A y sus ésteres son muy sensibles a la acción del aire, luz, calor y los agentes oxidantes y ácidos. Sustancia de referencia tinol SR-FA. Ésteres de re- CONSERVACIÓN En envases inactínicos de cierre perfecto. ENSAYOS [NOTA: efectuar la valoración y todos los ensayos tan rápidamente como sea posible, evitando la exposición a la luz actínica y al aire, a los agentes oxidantes, a los catalizadores de oxidación, como por ej., cobre, hierro), a los ácidos y al calor. Identificación Emplear la siguiente técnica cromatográfica: Fase estacionaria - Emplear una placa para cromatografía en capa delgada (ver 100. Cromatografía) recubierta con gel de sílice para cromatografía con indicador de fluorescencia, de 0,25 mm de espesor. Fase móvil - Ciclohexano y éter (80:20). Solución estándar - Preparar una solución de aproximadamente 0,01 mg de Ésteres de retinol SR-FA por l (3,3 UI de cada éster por l) en ciclohexano. Estabilizar con una solución de butilhidroxitolueno al 0,1 %. Solución muestra - Preparar una solución de aproximadamente 3,3 UI de Vitamina A por l en ciclohexano. Estabilizar con una solución de butilhidroxitolueno al 0,1 %. Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 3 l de Solución muestra y 3 l de Solución estándar. Dejar secar las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar al aire. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm: el cromatograma obtenido a partir de la Solución estándar debe presentar las manchas individuales de los ésteres correspondientes. El orden de migración debe ser: acetato, propionato y palmitato de retinol. La composición de la Solución muestra se debe confirmar por la correspondencia de la o las manchas principales obtenidas a partir de la Solución estándar. Límite de retinol Fase estacionaria y Fase móvil - Proceder según se indica en Identificación. Solución muestra - Preparar una solución de aproximadamente 330 UI de Vitamina A por l en ciclohexano. Estabilizar con una solución de butilhidroxitolueno al 0,1 %. Solución estándar - Agitar 1 ml de la Solución muestra con 20 ml de solución de hidróxido de tetrabutilamonio 0,1 M en alcohol isopropílico, durante 2 minutos y diluir a 100 ml con ciclohexano. Estabilizar con una solución de butilhidroxitolueno al 0,1 %. Procedimiento - Aplicar por separado sobre la placa 3 µl de Solución muestra y 3 µl de Solución estándar. Dejar secal las aplicaciones y desarrollar los cromatogramas hasta que el frente del solvente haya recorrido aproximadamente tres cuartas partes de la longitud de la placa. Retirar la placa de la cámara, marcar el frente del solvente y dejar secar al aire. Examinar la placa bajo luz ultravioleta a 254 nm: a excepción de la mancha principal en el cromatograma obtenido a partir de la Solución muestra, ninguna mancha debe ser más intensa que la mancha principal obtenida con la Solución estándar (1 %). [NOTA: en el cromatograma obtenido a partir de la Solución estándar se debe observar sólo trazas o no se debe observar ninguna mancha correspondiente al éster de retinol.] Sustancias relacionadas Determinar el máximo de absorción de la solución empleada en el ensayo Actividad (ver 470. Espectrofotometría ultravioleta y visible). La solución debe presentar un máximo de absorción entre 325 y 327 nm. Medir las absorbancias A a 300, 350 y 370 nm y calcular la relación A/A326 para cada longitud de onda: ninguna de las relaciones A/A326 debe ser mayor de: 0,593 a 300 nm. 0,537 a 350 nm, 0,142 a 370 nm. ACTIVIDAD Examinar por espectrofotometría de absorción ultravioleta (ver 470. Espectrofotometría ultravioleta y visible). Pesar exactamente entre 25 y 100 mg de Vitamina A, disolver en 5 ml de pentano y diluir con alcohol isopropílico hasta una concentración de 10 a 15 UI por ml. Determinar la absorbancia a la longitud de onda de máxima absorción, aproximadamente 326 nm. Calcular la actividad de la Vitamina A en Unidades Internacionales por g por la fórmula siguiente: A326V 1.900 100 P en la cual A326 es la absorbancia a 326 nm, P es el peso de Vitamina A en g, V es el volumen total al que ha sido diluida la Vitamina A para dar una concentración de 10 a 15 UI por ml y 1.900 es el factor de conversión de la absorbancia específica de los ésteres de retinol en Unidades Internacionales por g. ROTULADO En el rótulo se debe indicar el número de Unidades Internacionales por g y el nombre del éster o ésteres.