FICOLL A) Equipamiento. -Tubos de plástico de centrífuga de 50 ml. -Pipetas Pasteur de distintos tamaños. -Centrífuga refrigerada. -Micropipetas automáticas de distintos tamaños. B) Reactivos. -Ficoll-Histopaque de densidad 1.078. -Ficoll-Histopaque de densidad 1.119. -Medio completo (RPMI + 10% FBS). -Suero Salino. -Tampón fosfato PBS. C) Realización de medios. CFSE: Se toman 6 µL de solución madre + 54 µL RPMI-1640. Medio Completo: RPMI + 10% FBS). Dynabeades CD3/CD28 T Cell Expander (solución 1:20, 4 µL T Cell Expander solución madre + 76 µL de medio completo). D) Procedimiento. En un tubo cónico de centrífuga, de 50 mililitros, se depositan los dos gradientes de Ficoll-Histopaque de densidades diferentes, una que se coloca primero de densidad 1.119 y otra que se coloca lentamente sobre la anterior, de densidad 1.078. Sobre estos dos colchones de Ficoll-Histopaque de 10 ml de volumen cada uno, se añaden muy suavemente otros 10 ml de sangre diluida 1:1 en Suero Salino, que ha sido obtenida estérilmente por venopunción en tubos que contienen heparina litio como anticoagulante. La sangre diluida se deja resbalar por las paredes del tubo para que se deposite sobre el gradiente de Ficoll de densidad 1.078. Los tubos se centrifugan a 2.500 rpm durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. PUNTO CRÍTICO!!! No poner el freno en la centrífuga!!! Tras la centrifugación se observan dos halos opacos en la interfase: el superior correspondiente a las células mononucleares y el inferior a las polinucleares. Ambos halos se recogen por separado y se lavan las células tres veces con medio de PBS. Se resuspenden en un medio completo (1 mL). RECUENTO EN PLACA Los botones celulares resultantes se resuspenden en 1 ml o más de medio de cultivo completo cada uno, según el tamaño del botón, se cogen 20 µL de cada muestra, con pipeta de precisión tipo Hamilton, y se extiende en cámaras de Neubauer separadas para su contaje en microscópio. Se ha de teñir con Azul de Tripan para colorear células muertas, en dilución 1:5. (20 µL muestra: 80 µL Azul de Tripan). La cámara de Neubauer consiste en una placa gruesa de cristal en forma de porta, cuya porción central está dividida en tres bandas perpendiculares al eje longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan sobreelevadas 0´1 mm con respecto a la central, y en esta última hay grabado un retículo cuadrangular. La banda central puede estar, a su vez, subdividida en dos semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo al eje longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas hay grabado un retículo idéntico. Lectura y ajuste de concentración celular: Como se cuentan los linfocitos presentes en 4 cuadrados grandes del retículo, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en 1 cuadrado grande. Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrados grandes es de 1 mm, y la longitud del espacio comprendido entre éstos y el cubre es de 0´1mm; hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar el número de linfocitos existentes, no en 0´1 mL, sino en 1 mL. En definitiva, para su cálculo puede emplearse la siguiente fórmula: RL= L/2 x 104 x D RL= Recuento de linfocitos (número de linfocitos por mL de la suspensión celular). L = Linfocitos contados en 4 cuadrados grandes. D= Factor de dilución (1/dilución). CFSE Protocolo ¾ de la muestra la marcaremos. El resto será un control sin marcaje. 1. CFSE a -20oC. Se diluye 1/10 con RPMI-1640. 2. Se preparan 15µL de CFSE con la muestra en una concentración de 5×106/ mL. 3. PUNTO CRÍTICO!!! Agitar con cuidado para no formar espuma!!! 4. Incubar a temperatura ambiente 30 minutos en oscuridad. Agitar cada cierto tiempo. 5. Añadir FBS en dilución 1:1 para parar reacción porque tiene muchas proteínas. 6. Lavar células a 37oC con medio completo y resuspender. 7. Repetir al menos una vez el paso número 5. 8. Se transfiere 100 µL a pocillos estériles. T CELL EXPANDER Para la expansión policlonal de linfocitos T se recomienda usar 3 bolas por cada linfocito T. 1. Se transfieren 4 µL de Dynabeades CD3/CD28 T Cell Expander (solución 1 :20) a cada pocillo. 2. Dejar en incubadora 3. Incubar hasta el cuarto día. MARCAJE Para la conjugación de los anticuerpos monoclonales ha de añadirse 5 µL. El tiempo de incubación lo realizaremos de 20 minutos en frío. Se realizará tres lavados para quitar el exceso de anticuerpo y obtener una imagen lo más clara posible con FBS 1%. Los anticuerpos utilizados serán: FL1 FL2 FL3 FL4 PE PERCP APC CFSE CD8 CD4 CD3 CFSE CD56 CD3 CD19 Tubos de ajuste del citómetro: FL1 FL2 FL3 FL4 PE PERCP APC CFSE CFSE CFSE CFSE CD8 CD8 CD8 CD4 CD4 FLUOROCROMOS Detección de células T. Detección de células T, B y NK. FLUOROCROMOS Células sin marcar CD3 Tubos Controles Controles Negativos: 1. muestra sin marcaje 2. muestra marcada sin proliferación (T CELL EXPANDER) Distribución en placa con pocillos: Leyenda: Células + CFSE + T Cell Expander Células + CFSE Células + T Cell Expander Células Ajustes citómetro PBS para evitar desecación. Ejemplos de cálculos: Si partimos de 20 mL de sangre tomaremos: 10 mL de ficoll + 10 mL de sangre + 10 mL de PBS. (por duplicado) Contaje de células: Suponiendo 20 millones de células: 15 millones de ellas para marcar y 5 para no marcar Aplicando la fórmula CV= C’V’ en el caso de que tengamos 107 células/mL; tomamos 1,5 mL para marcar y 0,5 mL para no marcar. La muestra para marcar se diluye a 1:2 consiguiendo 5 x 106 células/mL. Se añade 15 µL de CFSE. Se añade a la muestra que se va a marcar 4 µL de T Cell Expander. Se añade a la muestra que no se va a marcar 4,5 mL de T Cell Expander. Pocillos: Se añade de la muestra marcada 100 µL al pocillo + 100 µL de medio completo. Se añade de la muestra no marcada 100 µL al pocillo + 100 µL de medio completo.