1 Universidad Nacional de San Martín Instituto de Investigaciones Biotecnológicas BIOLOGIA CELULAR 2012 GUíA DE TRABAJOS PRÁCTICOS Docentes Lic. Ignacio Durante Lic. Ana González Wusener Lic. Diana Wehrendt Dr. Juan Burdisso Dra. Paula Alvarez 2 CONDICIONES DE CURSADA Y APROBACIÓN DEL TP El horario de los TP será los lunes de 9:00 a 13:00hs. Los TPs son de asistencia obligatoria. Se tomará asistencia a las 9.10hs, después de esa hora se considerará que el alumno llegó TARDE. Dos asistencias computadas como TARDE equivalen a un AUSENTE. Se deberá asistir como mínimo al 80% de las clases de seminarios y laboratorio. Durante el cuatrimestre los alumnos serán evaluados en: (1) Un seminario de bibliografía, (2) Un parcialito, (3) Exposición oral de los resultados del TP, (4) Un informe final donde se explique el trabajo realizado y los resultados obtenidos con el fin de demostrar comprensión global de lo aprendido. (5) Un parcial práctico. Régimen de aprobación: Se deberá aprobar el informe final con nota ≥ 7. De ser desaprobado este informe podrá ser presentado por segunda vez. Se deberá aprobar el Parcial Practico con nota ≥ 7. Este parcial puede ser recuperado. Composición de la nota: La nota final será la nota del Parcial Práctico la cual será “redondeada” de acuerdo al promedio de notas de las instancias de evaluación adicionales. Los TP se aprobarán con una nota final ≥ 7. 3 CRONOGRAMA 2012 Fecha 06/08/2012 13/08/2012 20/08/2012 27/08/2012 03/09/2012 10/09/2012 17/09/2012 24/09/2012 01/10/2012 08/10/2012 15/10/2012 22/10/2012 29/10/2012 05/11/2012 Contenido Clase Teórica (Transfección; Inmunofluorescencia y fluorescencia). Lectura de la Guía. Trabajo Practico.Clase teórica Microscopía. Parcialito. Entrega de papers FERIADO Observación al microscopio Grupo 1 y 2 Observación al microscopio Grupo 3 y 4 Observación al microscopio Grupo 5 y 6 Análisis de imágenes por image J. Ejemplos. Consulta de papers. Presentación y discusión de resultados Entrega de Informes. Exposición de papers primeros tres grupos. FERIADO Entrega de informes corregidos. Exposición de papers últimos tres grupos. Parcial Teórico-Practico. Recuperatorio Parcial Teórico-Practico y de informes. Entrega de notas y cierre de cuatrimestre Nota: Los Prácticos son de 9 a 13 hs, salvo el día 13/08/12 en el cual ocuparemos además la tarde. 4 TRABAJO PRÁCTICO 2012 TITULO: Reconocimiento de estructuras subcelulares mediante transfección de proteínas fluorescentes e inmunocitoquímica. OBJETIVO: En el presente práctico los alumnos recibirán cubreobjetos sobre los cuales se sembraron células de ratón, transfectadas el día anterior con una proteína híbrida fluorescente. Empleando estas células los alumnos realizarán una inmunofluorescencia para detectar un segundo componente subcelular citoplasmático, y una tinción con marcadores fluorescentes para visualizar los núcleos. Luego examinarán las células en un microscopio de fluorescencia de modo de reconocer las distintas estructuras subcelulares. Cada alumno aprenderá las bases teóricas y detalles técnicos de la transfección e inmunofluorescencia, aplicando procedimientos similares a los empleados de rutina en un laboratorio de investigación. Además adquirirá el conocimiento básico para la operación del microscopio de fluorescencia y para la adquisición de imágenes con una cámara digital. INTRODUCCIÓN: Una idea general ampliamente aceptada es que el funcionamiento de las células depende de la interacción dinámica de sus genomas con el medio ambiente. De esta interacción emergen patrones de expresión de genes altamente regulados en el tiempo y el espacio. Un objetivo central de las investigaciones en Biología Celular y Molecular es identificar las reglas que gobiernan la interacción genoma-ambiente y definir los detalles moleculares subyacentes. Esfuerzos multidisciplinarios recientes han permitido secuenciar todo el DNA (genoma) de varios organismos procariotas y eucariotas. Estos estudios han impulsado otros, tendientes a conocer el conjunto de genes que se transcriben (transcriptoma) y se traduce en proteínas (proteoma) en una condición experimental determinada. Mas aún, mediante ensayos de doble híbrido y análisis por espectrometría de masa se están estudiando las interacciones entre proteínas y la formación de complejos multiproteicos a una escala global (interactoma). También se estan diseñando estrategias para analizar la localización subcelular de las proteínas a nivel global (localizoma). Muchas de estas estrategias de análisis global se derivan de técnicas y metodologías de análisis clásicas, que todavía se emplean para examinar la función de proteínas individuales en la mayoría de los laboratorios de investigación. Inmunocitoquímica La Inmunocitoquímica es un conjunto de técnicas en donde se emplean anticuerpos para detectar y localizar, antígenos específicos en células y tejidos. La parte del antígeno reconocida por el anticuerpo se denomina epitope. Los epitopes pueden estar expuestos al medio extracelular, por ejemplo si pertenecen a la porción extracelular de una proteína de transmembrana como las integrinas, el receptor de la insulina, etc. o pueden ser intracelulares (ej. actina). Para acceder a los epitopes intracelulares, los anticuerpos deben ser capaces de cruzar barreras como la membrana plasmática. Esta es la razón de permeabilizar las células, es decir generar poros que permitan el pasaje de los anticuerpos. Antes de permeabilizar, las células usualmente se fijan. La función principal de la fijación es preservar la localización y estructura de los antígenos lo más fielmente posible a la situación que existe in vivo. Por ello los protocolos de fijación 5 difieren dependiendo de la naturaleza de las células, de los tejidos a procesar, y también del antígeno a detectar. Fijadores: -glutaraldehído. Es un di-aldheído de 5 carbonos, que provee la mayor preservación de la estructura celular fina y por lo tanto es el fijador de elección para microscopía electrónica y algunos estudios de inmunofluorescencia (como localización de microtúbulos). El glutaraldehído forma puentes entre los grupos aminos de las proteínas. Se usa en un rango entre 0.2 y 1% (v/v). Las mayores desventajas del uso del glutaraldehído como fijador es que: 1) frecuentemente altera de tal modo los epitopes que impide su reconocimiento por el anticuerpo y 2) provoca autofluorescencia o "ruido" a determinadas longitudes de onda de excitación. Consideraciones para manipular este compuesto. Para su manipulación debe tenerse en cuenta que se trata de un producto que, tras contacto directo o exposición a sus vapores, puede ocasionar sensibilización e irritación de la piel y mucosas. La exposición frecuente a este compuesto puede ocasionar dermatitis, alergia respiratoria y asma. -paraformaldehído. Es un polímero del formaldehído (monoaldehído de 1 carbono, CH2O) que forma puentes entre los aminos de las proteínas. El paraformaldehído es un sólido que usualmente se disuelve en PBS al 3,7-4%. Es uno de los fijadores mas usados en inmunocitoquímica puesto que preserva la mayoría de los epitopes, probablemente debido a su menor capacidad de "crosslinking" comparado al glutaraldehído. También genera menor autofluorescencia y penetra fácilmente a la célula. Consideraciones para manipular este compuesto. Toxicidad del paraformaldehído: (1) Por inhalación: el polvo o vapor produce irritación del tracto respiratorio y edema pulmonar. (2) Por ingestión: quemaduras e irritacion del tracto digestivo, vómito, inconciencia. (3) Por contacto directo con la piel: produce irritación y fisuras de la piel. (3) Por contacto directo con los ojos: produce quemaduras e irritación. La exposición frecuente puede generar efectos crónicos como alergias. -metanol/acetona. Proveen una fijación más rápida que los aldehídos y han sido usados para una gran variedad de estudios, por ej. componentes del citoesqueleto. La fijación se realiza por precipitación de proteínas y carbohidratos lo cual en algunos casos altera el patrón de localización de los antígenos. Usualmente se fija las células 10-15 min con metanol o acetona pro-análisis, enfriadas a -20°C. Dado que estos compuestos fijan y permeabilizan al mismo tiempo, algunos antígenos solubles del citoplasma/núcleo pueden perderse y también puede verificarse una contracción de la muestra. Consideraciones para manipular metanol. Es un compuesto tóxico por inhalación, por contacto con la piel y por ingestión con peligro de efectos irreversibles muy graves. Además es un compuesto fácilmente inflamable con lo cual debe cuidarse que la mezcla gas/vapor inflamable al aire no supere los límites de explosividad. Consideraciones para manipular acetona. En altas concentraciones es narcótico. Al ser ingerido puede llegar a causar daños a los riñones cambios metabólicos y coma. Es irritante. Permeabilización: Si se desea visualizar un antígeno intracelular, luego de la fijación se debe permeabilizar la membrana con un detergente o un solvente orgánico, para posibilitar que el anticuerpo entre a la célula. Este paso no es necesario si lo que se intenta detectar es un antígeno expuesto en la cara exoplásmica de la membrana plasmática, o es un antígeno asociado la matriz extracelular. Los agentes de permeabilización más 6 comunes son detergentes no iónicos (tritón X100, NP40), los cuales solubilizan los lípidos de la membrana. ¿Que es un detergente? Son moléculas anfipáticas, es decir la misma molécula contiene grupos polares (cabeza) y una larga cadena de carbonos hidrofóbica (cola). Estas moléculas exhiben propiedades únicas en el agua; sus grupos polares forman puentes hidrógenos con moléculas de agua, mientras que las cadenas hidrocarbonadas se agregan debido a interacciones hidrofóbicas. Los detergentes forman estructuras esféricas en soluciones acuosas denominadas micelas, cada una de las cuales contiene numerosas moléculas de detergente. Debido a su naturaleza anfipática, los detergentes son capaces de solubilizar compuestos hidrofóbicos en agua. Las membranas biológicas están compuestas por fosfolípidos y proteínas; los primeros pueden ser vistos como detergentes biológicos. La mayoría de los lípidos que forman la membrana contienen dos grupos hidrofóbicos conectados por una cabeza polar. Esta arquitectura molecular permite a los lípidos formar una bicapa, en la cual las cadenas hidrofóbicas están enfrentadas mientras que las cabezas polares se encuentran hacia el ambiente acuoso (hacia el medio polar ya sea el citosol o el medio extracelular). Proteínas y lípidos (como el colesterol) se encuentran embebidos en esta bicapa. Las proteínas pueden anclarse a la bicapa mediante interacciones hidrofóbicas con las cadenas hidrocarbonadas de los fosfolípidos. Estas proteínas, conocidas como proteínas integrales, son solubilizadas por los detergentes junto a los lípidos. Como actúan los detergentes? Los detergentes solubilizan las proteínas de membrana imitando el ambiente de la bicapa lipídica. Las micelas formadas por los detergentes son análogas topológicamente a las bicapas de las membranas biológicas. Las proteínas se incorporan dentro de estas micelas vía interacciones hidrofóbicas. Las regiones hidrofóbicas de las proteínas de membrana, normalmente embebidas en la bicapa lipídica, son rodeadas por las cabezas apolares de las moléculas de detergente; las porciones hidrofílicas quedan expuestas al medio acuoso solubilizando las proteínas. A bajas concentraciones, las moléculas de detergente se intercalan entre los fosfolípidos; a altas concentraciones que saturan la bicapa, la membrana se desintegra para formar micelas mixtas (con moléculas de detergente. Es importante enfatizar que el esquema de fijación/permeabilización para cada sistema de estudio debe ser determinado empíricamente. Manipulación de células en cultivo Para promover la supervivencia, proliferación y diferenciación de las células en un ambiente in vitro, hay dos factores críticos que deber ser cuidadosamente escogidos: el medio de cultivo y el substrato de crecimiento. El medio de cultivo debe poseer una composición de nutrientes, pH y osmolaridad apropiadas para el tipo de células en estudio. La mayoría de las células de organismos pluricelulares además requieren del contacto con un substrato adhesivo para crecer. Una vez determinados estos parámetros el experimentador además debe determinar el volumen de medio y la frecuencia con que se reemplaza por medio fresco. Las células animales usualmente se cultivan en incubadoras que mantienen una temperatura y concentración de CO2 constantes. Factores fisicoquímicos: Varios factores del ambiente de cultivo deben ser monitoreados para evitar fluctuaciones. Como regla general, condiciones óptimas de cultivo para la mayoría de células de mamíferos son las siguientes: pH: 7.2-7.5 OSMOLARIDAD: 280-320 m Osmol 7 CO2: 2-5% en aire TEMPERATURA: 35-37°C Medio de cultivo: El cultivo de células animales es bastante más complejo que el de bacterias y hongos. Los cultivos primarios (aquellos cuyas células resultan del plaqueo directo de los tejidos de origen) y las líneas celulares (células que han sido repicadas) difieren en sus requerimientos nutricionales. Por ello, la formulación del medio de cultivo depende en gran medida de las células a cultivar. Componentes comunes son: - Aminoácidos: La concentración de aminoácidos en el medio de cultivo limita el crecimiento y la supervivencia de las células. Todos los medios de cultivo incluyen los 9 aminoácidos esenciales, los cuales no pueden ser sintetizados por los animales, y los aminoácidos que son sintetizados por células especializadas en los animales intactos. - Vitaminas, deben estar presentes en el medio, ya que la célula no puede sintetizarlas a todas o en las cantidades que son necesarias. - Sales, contribuyen a la osmolaridad del medio. El bicarbonato de sodio contribuye a amortiguar los cambios de pH en células que se cultivan en una atmósfera de CO2. - Glucosa, se incluye en la mayoría de los medios de cultivo como una fuente de energía. - Suero: el suero contiene hormonas, factores de adhesión, factores necesarios para la proliferación celular, etc. El suero mas usado es el fetal de bovino. Ciertos tipos celulares requieren factores de crecimientos específicos no presentes en el suero. Las células animales se cultivan en cajas de Petri, usualmente de un plástico modificado, adherente para las células. Esterilidad y control de la contaminación: Esterilidad significa ausencia de cualquier organismo contaminante (hongos, bacterias, micoplasma, etc). El éxito del cultivo de células es absolutamente dependiente de una rigurosa asepsia. Para lograr esto la manipulación de los cultivos (ej. cambio de medio, repique, etc) se realiza en mesas de flujo de aire laminar, en donde el aire es esterilizado por filtración, evitando así la entrada de partículas en las placas o botellas donde se cultivan las células. * Todo el material usado en cultivo debe estar autoclavado y debe ser abierto únicamente dentro del flujo laminar. * Los medios se esterilizan por filtración, antes del agregado del suero y antibióticos. * Todo el material (cajas de tips, pipetas, frascos de medio, tubos, etc) que se ingresa al flujo laminar debe ser esprayado por fuera con etanol 70%. * Se debe trabajar con guantes limpios. * Antes de comenzar a trabajar, el gabinete de flujo laminar debe ser esterilizado con etanol al 70% y ser expuesto a luz ultravioleta por 10-15 minutos. Preparación de cubreobjetos Es sumamente importante que los coverslips usados para cultivo de células e inmunocitoquímica estén bien limpios. Por ello, usualmente se incuba con ácido un par de horas y luego se los lava extensivamente con agua. Los cubreobjetos limpios se guardan en etanol 70% y se flamean en el flujo antes de ser usados. Las células no se adhieren efectivamente al vidrio, por ello los cubreobjetos deben ser tratados con sustratos de adhesión apropiados. Factores de adhesión o sustratos Los factores de adhesión incluyen polímeros cargados positivamente (ej. polilisina), que facilitan la adherencia inespecífica de las células mediante interacciones electrostáticas. Otros factores de adhesión 8 son derivados de la matriz extracelular (ej. fibronectina, laminina, colágenos, etc.), y requieren de la expresión de receptores específicos en la superficie de las células. Solo las células que expresan tales receptores se adhieren efectivamente. Introducción y expresión de cDNAs en células cultivadas Una estrategia experimental ampliamente usada para investigar la localización subcelular y la función de las proteínas es introducir el cDNA que codifica para su expresión en células en cultivo. La expresión de diversas mutantes de la proteína puede arrojar importante información acerca de los dominios funcionales. Si se desea estudiar la localización, y no se posee de buenos anticuerpos, al cDNA de la proteína puede adicionársele la secuencia de un epitope para el cual exista un anticuerpo obtenido comercialmente (ej. cmyc, hemaglutinina, etc). Si se quiere analizar una proteína en el contexto de la célula viva (o el tejido), usualmente se fusiona al cDNA de la proteína el cDNA de una proteína fluorescente (ej. GFP, YFP, DsRed, etc). Existen diversos métodos para introducir cDNAs en células eucariotas: Métodos químicos * Coprecipitacion por fosfato de calcio: * DEAE-dextran y polibreno * Fusión de protoplastos * Lípidos catiónicos Métodos mecánicos * Microinjección * Biolistica (gene gun) * Electroporación Métodos biológicos * transducción de DNA mediada por virus Vectores de expresión eucariota Secuencias necesarias: origen de replicación eucariota y procariota resistencia a antibiótico eucariota y procariota (marcador de selección) promotor (ej. CMV, SV40) RBS (sitio de unión al ribosoma) MCS (sitio de clonado múltiple) Expresión heteróloga de proteínas fluorescentes Una alternativa para examinar la localización subcelular de las proteínas es generar fusiones de sus cDNA al de proteínas fluorescentes. Hay varias proteínas fluorescentes, la primera en ser descripta y la mas popular en los estudios actuales es la GFP (GFP = "Green Fluorescent Protein"), clonada de la medusa Aequorea victoria. Para producir una proteína híbrida primero necesitamos unir el cDNA de la proteína fluorescente, por ejemplo la GFP, al cDNA que codifica para nuestra proteína de estudio (X). Es imprescindible que ambos cDNAs esten en el mismo marco de lectura. Los cDNAs obtenidos, GFP-X, luego se clonan en un plásmido de expresión y se introducen en las células por transfección. Existen diversos métodos para transfectar células, el mas popular actualmente se basa en la formación de complejos mixtos [DNA-liposomas catiónicos] que luego se agregan sobre las células. Las células 9 internalizan los complejos lípido-DNA, los cuales se importan al núcleo y sirven de molde para la síntesis de la proteína híbrida fluorescente. Usualmente el plásmido que se utiliza como vector posee un promotor viral "fuerte" (ej. CMV, SV40), es decir que es capaz de inducir altas tasas de transcripción del cDNA clonado. Si se dispone de un microscopio invertido equipado para fluorescencia y acoplado a una cámara digital se puede registrar la localización y dinámica de la proteína híbrida fluorescente en las células vivas. Cámaras digitales En la microscopía moderna la fotografía digital ha reemplazado a la tradicional basada en los conocidos rollos de película. En la fotografía tradicional, las imágenes son captadas por una emulsión sensible a la luz (de haluros de plata o "granos" en la jerga fotográfica) depositados en la película. La imagen latente formada luego es revelada para obtener el negativo de las fotos. El positivo de las imágenes se obtiene a partir de los negativos, empleando papel fotográfico (la emulsión en este caso esta depositada sobre papel). En la cámara digital las imágenes se captan en el chip, es decir el chip es la parte sensible a la luz. Los chips se fabrican a partir de cristales de silicio, por una serie compleja de pasos, de modo de obtener un arreglo bidimensional de fotodiodos. Los fotodiodos (= pixels) operan convirtiendo la energía de los fotones en cargas eléctricas. Durante el tiempo de exposición (= integración) las cargas generadas por la interacción de los fotones incidentes con los átomos de sílice son acumuladas en los fotodiodos. Asi, cada fotodiodo va a acumular una cantidad de cargas ~ proporcional al número de fotones. El tamaño del pixel puede ser modificado por un proceso denominado "binning" (ver figura). El binning permite que las cargas de un grupo de pixels vecinos sea procesada como si fuera un "super pixel" o pixel mayor único. Binning 2 x 2 significa que 4 pixels vecinos son tratados como si fueran uno solo. El binning aumenta la sensibilidad, pero a costa de reducir la resolución (ver mas adelante). chip pixels amplifier CCD: En el tipo mas común de cámaras digitales, denominadas CCD ("Charge Coupled Device") las cargas acumuladas en cada fotodiodo durante el período de integración son transferidas ordenadamente a un amplificador y posteriormente son transformadas en una señal digital. Este proceso de digitización convierte la señal análoga recibida del amplificador a una señal digital (electrones --> bits). La señal digital luego se envia a la computadora para formar la imagen en un monitor. La resolución de una cámara depende del tamaño y número de pixels del chip. Por ejemplo, para tamaños equivalentes, un chip de 2048 x 2048 pixels permite tomar fotografías de mayor resolución que uno de 512 x 512. El rango dinámico de una cámara es un parámetro relacionado con la capacidad de captar diferencias cuantitativas entre la señal mas débil y la mas intensa. En el caso de una cámara monocromática (blanco y negro) seria equivalente a la gama de grises producida. El rango dinámico se define típicamente como la máxima cantidad de cargas que puede acumularse en un fotodiodo dividido el ruido. Por ej. si la máxima cantidad de cargas que puede acumularse en un fotodiodo es 20.000 electrones y el ruido es 10 electrones, el rango dinámico es 2.000. Este valor corresponde a ~ una imagen de 11 bits. Intuitivamente se puede deducir que mayor cantidad de bits significa una imagen mas rica en grises. El ruido condiciona el valor mínimo del rango. Existen varios componentes del ruido, uno de ellos ("dark noise") depende de la temperatura. Esto quiere decir que la temperatura provee energía suficiente para provocar acumulación de cargas en el fotodiodo, aun en ausencia de luz (de ahí la denominación "dark noise"). Este tipo de ruido se minimiza enfriando el 10 chip. Las cámaras de alta performance usadas en investigación usualmente son refrigeradas a temperaturas por debajo de cero grado celcius. 11 PARTE PRACTICA Esquema de las actividades del práctico: 1 células transfectadas que expresan proteínas fusionadas a GFP inmunotinción de antígeno intracelular adquisición de imágenes mediante cámara digital 5 2 mitocondrias marcación del DNA microtúbulos 3 retículo endoplásmico 4 observación en el microscopio de fluorescencia núcleo focos de adhesión filamentos de actina INMUNOCITOQUÍMICA Se comienza con la fijación de células en cultivo transfectadas con una proteína quimera fusionada a la GFP. 1) Fijación. Aspirar el medio de cultivo y agregar 1.5 ml de la solución de paraformaldehído (PF) al 4%. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min. 2) Descartar la solución de PF y agregar 2 ml de PBS. Incubar 5 min y repetir 2 veces. 3) Permeabilización. Descartar el PBS y agregar 100 µl de la solución de Triton X-100 al 0.5 % (en PBS) sobre el cubreobjeto. Incubar 5 min a temp ambiente. 4) Lavar con PBS dos veces (2 ml por lavado, 5 min. c/u). 5) Hacer una cámara húmeda poniendo una servilleta de papel absorbente en una cápsula de 10 cm. Agregar H2O destilada hasta saturar el papel (no agregar de mas!). Poner un cuadrado de Parafilm sobre el papel húmedo. 6) Drenar el exceso de PBS del cubreobjetos tocando suavemente sobre papel absorbente y depositarlo rápidamente en cámara húmeda. 7) Bloqueo. Inmediatamente (evitar que las células se sequen!) agregar 100 µl de solución de albúmina (BSA) al 5% sobre el cubreobjetos. Incubar 1 h a temperatura ambiente. 12 8) Secar con papel el exceso de BSA y agregar inmediatamente 100 µl de la solución de anticuerpo primario (evitar que las células se sequen!). Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Nota: Los anticuerpos o drogas utilizadas se diluyen en una solución de BSA al 5% a una concentración adecuada. Por Ej: Anticuerpo anti-tubulina (1/4000); Anticuerpo anti-vinculina (1/500). 9) Lavados. Tomar con cuidado el cubreobjetos, drenar la solución de anticuerpo tocando suavemente sobre papel absorbente. Transferir inmediatamente (no dejar secar!) el cubreobjetos a una cápsula de 35 mm con 2 ml de PBS. Incubar 5 min. Repetir el lavado 2 veces mas. 10) Drenar el exceso de PBS del cubreobjetos tocando suavemente sobre papel absorbente y depositar el cubreobjetos en cámara húmeda (usar un trozo de Parafilm nuevo). Inmediatamente agregar 100 µl de la solución de anticuerpo secundario. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. 11) Repetir lavados (como en el paso 8). 12) Incubar 5 min con 1 ml de una solución de Hoechst (5 g/ml) en PBS (tinción de núcleos). 13) Montaje. Poner 15 l del líquido de montaje en un portaobjetos limpio. Tomar el cubreobjetos con cuidado, drenar el exceso de líquido. Inmediatamente montar el cubreobjetos sobre la gota de líquido (OJO→ la superficie donde están las células queda en contacto con el portaobjetos). Rotular portaobjetos y pegar cubre con esmalte. Fin -------------------------------------------------------------------------------------------------------------OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO DE LOS PREPARADOS A: Observar en contraste de fases a 100x AN 1.4. a- Tomar 1 foto en blanco y negro a 8 (imagen 1) y a 12 bits (imagen 2) - agrandar las imágenes tomadas al máximo. En cual observa mayor gama de grises?................... b- tomar 1 foto en blanco y negro a 8 bits sin binning (imagen 3). - tomar una segunda imagen del mismo campo con 4 x 4 binning. - que observa? la misma imagen.................todo blanco.....................todo negro.................... - intercalar 1 o dos filtros y regular la intensidad de luz hasta obtener una segunda imagen similar a la primera (imagen 4). - agrandar las imágenes tomadas al máximo. En cual nota mas el pixelado?.............................. B: Observar con fluorescencia. a- Empleando el objetivo de 100x AN 1.3, tomar una foto (Tiempo de exposición =.........segundos). (Imagen 5) -Repetir empelando el objetivo de 100x AN 1.4, a igual tiempo de exposición que la imagen anterior (imagen 6) - comparar las imágenes 5 y 6, 13 -¿En cuál observa más intensidad de fluorescencia?.............. -¿En cuál observa mayor definición en los detalles?.............. b- Empleando el objetivo de 100x, tomar una foto en blanco y negro a 12 bits (Tiempo de exposición =.........segundos). (Imagen 7) - exponer el mismo campo y el mismo fluorescente 2 minutos. - sin mover el preparado tomar una segunda foto exponiendo el mismo tiempo que la primera foto (imagen 8). - comparar las imágenes 7 y 8 con o sin zoom. - tienen las dos la misma gama de grises? .................................................. Fin ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- DISCUSIÓN DE RESULTADOS Literatura en la web: Digital imaging http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/index.html http://www.microscopyu.com/articles/digitalimaging/digitalintro.html