Electrofóresis de ácidos nucleicos

Electroforesis de ácidos nucleicos
No sólo las proteínas presentan carga y son solubles, también los ácidos nucleicos tienen la capacidad de
migrar en un campo eléctrico y, por tanto, son susceptibles de ser separados por electroforesis, aunque con
algunas variaciones con respecto de las proteínas:
• Son moléculas de mayor tamaño: Lo que implica que el tamaño de poro que nos da la acrilamida puede
ser demasiado pequeño.
• Presenta gran cantidad de conformaciones y de tamaños: Lo que supone una gran variabilidad a la hora
de diseñar los experimentos, ya que no es lo mismo separar cromosomas que simples nucleótidos.
En principio, es análoga a la electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes, salvo que aquí no
hace falta el SDS para conferir la misma relación carga/masa es todas las moléculas (aunque se utiliza en el
tampón de carga), ya que en los ácidos nucleicos la parte que confiere la carga es el grupo fosfato, y está
presente de forma regular en la estructura.
En estas condiciones, y al contrario que las proteínas, si realizáramos una electroforesis libre, observaríamos
como todas las moléculas migrarían hacia el polo positivo con la misma velocidad al tener igual. Esta
propiedad no nos sirve de mucho, pero hay que decir que en un soporte en gel, como los que vamos a utilizar,
las moléculas de ácido nucleico se separan en función de su tamaño.
Soportes
Como ya he avanzado, la acrilamida se queda pequeña en la mayoría de las electroforesis de ácido nucleico, y
es por lo que se utiliza otro tipo de soporte.
• Agarosa: polímero que funde a 80 − 90 ºC (aunque hay agarosas de muy diverso tipo, entre las que se
encuentran las de bajo punto de fusión), y forman gel a unos 30 ºC. El rango de concentración oscila entre
el 0,3 %, que puede separar moléculas del orden de 5 a 60 Kb, y el 2% que puede separar ácidos nucleicos
de 0,1 a 0,2 Kb.
• Poliacrilamida: de la que ya hemos hablado y que para ácidos nucleicos ronda unas concentraciones del
orden del 3,5%, con una capacidad separadora de 1.000 a 2.000 bases y del 20%, que puede diferenciar
moléculas de 6 a 50 bases. Permite separar moléculas que sólo difieren en un solo nucleótido, que implica
la utilización de geles de poliacrilamida en secuenciación.
La agarosa es, por tanto, el soporte más utilizado, y supone la aparición de nuevos aparatos, al ser más frágil
que la acrilamida y no poder intercambiarse los moldes. Ésta fragilidad hace que, además de tener que ser
geles más gruesos, se hagan y se utilicen de forma horizontal, ya que si no se resquebrajarían.
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Para los geles de agarosa hay moldes rectangulares que están abiertos por los dos extremos, de modo que
antes de echar la agarosa fundida en el molde hay que sellar esos dos extremos, función que realiza una cinta
adhesiva que se coloca según la figura. Una vez sellado el molde por los cuatro costados se deposita la
agarosa fundida con cuidado de no formar burbujas. Una vez lleno a una altura prudencial, y con la agarosa
todavía líquida se procede a colocar el peine, normalmente a cualquiera de los extremos del molde, teniendo
siempre cuidado de que el peine no toque el fondo del molde. Las formas de sujetar el peine una vez colocado
son muy diversas y suelen depender de la pasta que tenga el laboratorio, desde peines dobles con tuercas
reguladoras (como el que nos enseñó el profesor en clase), hasta sujetar el peine con dos pinzas para papel
pasando por soportes de metacrilato al que se adhiere el peine. En general es conveniente que se haga el ajuste
de altura antes de echar la agarosa en el molde.
Como se observa también en la figura, una vez polimerizado el gel (proceso que requiere enfriamiento de la
agarosa, no reacciones químicas como en la acrilamida), se le retiran las cintas adhesivas, de modo, que la
agarosa queda libre en los dos extremos del gel, lo que se aprovecha para colocarlo en una cubeta en forma de
puente con los pocillos en la cubeta con el electrodo negativo. El gel se encuentra sumergido en un electrolito
tamponado con Tris−Borato (no glicina), para garantizar que los ácido nucleico estén cargados
negativamente; por esto a la técnica se le denomina electroforesis de inmersión. Las moléculas migrarán
hacia el polo positivo, de modo que viajarán en esa dirección por el gel, separándose por tamaño (nº de
nuleótidos).
Al igual que con las proteínas, en estas condiciones se debe añadir un compuesto que aumente la densidad de
la muestra y no difunda, o pase a otros pocillos a la hora de cargar la muestra, y unos marcadores de frente
que nos permitan detener la electroforesis en el momento que lo creamos oportuno.
Para visualizar las bandas, hay que teñir el gel o marcar radiactivamente las moléculas. El método más
utilizado en geles de agarosa es el del BrEt (bromuro de etidio), del que ya hemos hablado. Se comporta
como un agente intercalante, de modo que, además de disminuir la densidad de la molécula, tiene la capacidad
de emitir luz cuando se le excita con luz ultravioleta. Hay que tener cuidado con este compuesto ya que es
altamente cancerígeno. En un principio, una vez corrido el gel se retiraba y se ponía a incubar durante un
tiempo (30 minutos), a continuación se miraba la posición de las bandas con la lámpara de U.V. Ahora, y para
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evitar la difusión que se producía durante la incubación, se añade el BrEt tanto en la agarosa como en el
electrolito, de modo que, puedes parar la electroforesis y visualizar las bandas en la lámpara, y si es necesario
continuar corriendo el gel sin ningún problema.
Hay varios tipos de visores para este tipo de geles, uno que proyecta la luz U.V por arriba, que implica que
tienes que ponerte unas gafas o una careta, además de los guantes para protegerte del BrEt, y que lleva
incorporado una cámara, que saca las fotos en negativo. La foto es muy importante ya que permite trabajar
con algo imperecedero, no como el gel, que poco a poco va difundiendo y perdiendo el BrEt. El otro tipo, sin
embargo, presenta la fuente de luz abajo, y con una pantalla enzima del gel que nos protege de la radiación.
Siguiendo con el soporte de agarosa, nos interesa saber como varía con respecto del tamaño del poro, o lo
que es lo mismo de la concentración de agarosa. Si digerimos una muestra de DNA con una enzima de
restricción y representamos los valores de de cada fragmento en diferentes concentraciones de agarosa,
obtendríamos una gráfica como la de la figura, donde se observa como aparecen líneas de la misma pendiente,
que indican cómo varía la movilidad con respecto de la concentración, haciendo que aumente al aumentar la
concentración.
Fenómenos que alteran
Uno de los fenómenos que más se producen es el denominado de inversión de banda, debido a la tendencia
de los fragmentos de tamaño medio de DNA a formar horquillas, lo que hace que queden retenidos en los
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poros el gel más tiempo del necesario, siendo por tanto, adelantados por fragmentos de mayor tamaño. Los de
mayor y menor tamaño no presentan esta tendencia, con lo que migran sin problemas.
Esta variación de del DNA debida a la estructura nos permite separar fragmentos de igual tamaño y con
diferente conformación, como en el caso del superenrollamiento. Un fragmento circular de DNA se puede
encontrar en formas relajadas o superenrolladas (supercoiled). Si introducimos moléculas de igual tamaño y
con estructura más o menos enrolladas veremos como se nos separan, quedando las más enrolladas con una
movilidad mayor que las relajadas. De este modo, también podemos diferenciar formas O.C. de C.C; de
DNAs s.s. y d.s.; de formas enrolladas y relajadas. Todas, aunque de igual tamaño presentan diferentes
movilidades electroforéticas. Esta propiedad es muy útil a la hora de identificar elementos extracromosomales
(plásmidos).
Visualización de los ácidos nucleicos
A parte del método instantáneo del BrEt, hay otras formas de visualizar los ácidos nucleicos en un gel, entre
los que destacas la autorradiografía y la transferencia.
• Autorradiografía: exactamente igual que en proteínas, exceptuando el núcleo radiactivo más utilizado, que
ahora es el 32P.
•
Transferencia: de nuevo la transferencia se realiza en papel de nitrocelulosa o membrana de nylon, pero
ahora no es una electrotransferencia, sino que el principio utilizado es el de la capilaridad. Si lo que se
transfiere es DNA, se llama Southern Blot, y si es RNA Northern Blot. En ambos se realiza un
apilamiento de distintos papeles, empezando por el gel son:
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• Papel de nitrocelulosa.
• De 6 a 8 hojas de papel W 3MM.
• Papel de filtro (plegado o no) desnaturalizado con sosa.
• Cristal para compactarlo todo y un peso sobre todo el complejo.
Debajo del gel se coloca una hoja de papel W 3MM que esté en contacto con el tampón de transferencia, de
modo, que nunca quede seco. El líquido ascenderá por la hoja hasta el gel arrastrando hacia arriba a las
moléculas de ácido nucleico, que quedarán atrapadas en el papel de nitrocelulosa. El proceso puede durar unas
horas, aunque suele ser menos.
Una vez en papel, podemos efectuar un gran número de tratamientos y técnicas, entre las que destaca la de la
hibridación. Teniendo una sonda para un fragmento de DNA, se digiere la molécula con enzimas de
restricción y se realiza la electroforesis. Una vez terminada, el resultado puede observarse por medio del ya
conocido BrEt, pero como tenemos una sonda podemos hacer que hibride con el fragmento correspondiente, y
para eso tenemos dos caminos que parten de la transferencia a papel. El primero es el de las bolsas de
hibridación, que no difieren mucho de las utilizadas para anticuerpos en proteínas. Hay que tener en cuenta
que las condiciones de hibridación deben realizarse en condiciones de máxima especificidad, de modo, que la
temperatura debe ser elevada. La segunda consiste en los hornos de hibridación, no muy diferentes de los
asadores de pollos, sólo que consta de unos cilindros que, además, giran sobre su propio eje. En el interior de
los mismos se introduce el papel y la sonda, cerrando el cilindro y dejando que hibride durante un tiempo.
La base del proceso de hibridación reside en la forma en que se une el ácido nucleico al papel, a través de los
grupos alcohol de la ribosa, y dejando las bases nitrogenadas libres. Hay que tener cuidado, ya que el RNA
presenta una gran tendencia a formar estructuras secundarias y terciarias en forma de horquillas, lo que haría
que la hibridación fuera totalmente deficiente. Lo que se hace es desnaturalizarlo con formaldehído o
hidroximetil mercurio.
Una vez realizada la hibridación, nos encontramos con que no podemos visualizar el lugar donde se encuentra
la sonda, o lo que es lo mismo el fragmento deseado. Lo que se hace es marcar previamente la sonda
radiactivamente, de nuevo con 32P (a través de ATP radiactivo) y luego realizar una autorradiografía.
• Electroelución: equivalente a la de proteínas, y aún más fácil debido a al tamaño de poro de la agarosa.
Campo pulsado
Si quisiéramos separar moléculas de ácido nucleico de gran tamaño, nos encontraríamos con que, si son
capaces de entrar en el gel no avanzarían casi nada al quedar enganchadas en la trama del gel, por muy poco
concentrado que se encuentre. Una forma de resolver el problema sería cambiando la dirección y/o el sentido
del vector campo eléctrico en forma de pulsos. Con eso, haríamos que la molécula fuera cambiando de
dirección y/o el sentido de la migración sacándola de los atolladeros y, por tanto, haciendo que se mueva.
Esta técnica se denominó campo pulsado, y consiste en lo explicado, en la variación de la migración a la que
sometemos la muestra, sin más que cambiar de posición los electrodos. Existen varios tipos de juegos de
electrodos, de los más simples con 4 que se van alternando; a tres y uno puntual; o seis; o incluso dos, que se
turnan la polaridad (uno durante más tiempo que el otro), pero todos ellos se encuentran conectados a la
fuente pulsadora.
La cubeta de campo pulsado tiene dos niveles, el inferior donde el tampón se refrigera con unos tubos (ya que
sufre un gran calentamiento durante el proceso) y, se regenera mediante una bomba. El superior es donde se
deposita el gel de agarosa, que se sumerge en tampón. La habitación también debe encontrarse refrigerada
debido al calor que desprende toda la maquinaria implicada en el proceso.
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Geles de acrilamida
Cuando queremos aislar moléculas pequeñas, nos encontramos con que la agarosa tiene un tamaño de poro
muy grande, de modo que se utiliza la acrilamida. Hay varios tipos de electroforesis en geles de acrilamida
para ácidos nucleicos.
• Geles PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida): con un grosor de 0,1 mm un porcentaje alto de urea
y una temperatura de unos 40 ºC. En estas condiciones el DNA permanece desnaturalizado y en forma de
monohebra, de modo, que se pueden llegar a separar moléculas que difieran en un solo nucleótido. Esta
base permite secuenciar el DNA por los dos métodos que conocemos el dideoxi y el de secuenciación
química. En ambos el marcaje puede ser radiactivo, leyéndose la secuencia en la autorradiografía o con
colorantes fluorescentes con emisión a diferente longitud de onda, con lo que el secuenciador automático te
da ya la secuencia en forma de picos (espectro).
En estas mismas condiciones de corrida, se pueden separar moléculas de DNA con diferente cantidad de poli
A, que confiere curvatura a la molécula, de modo, que moléculas con igual tamaño presentan diferente
debida a esa curvatura característica. El resultado es el que se observa en la figura, teniendo mayor las
moléculas sin poli A, seguidas de las que presentan colas y por último aquellas que presentan la región en el
centro, formándose realmente un arco.
• Geles de retardo: Para averiguar la posible interacción de proteínas con el DNA se pueden realizar este
tipo de geles. Es sencillo únicamente hay que cargar las proteínas que sospechas que interaccionan con el
DNA, el DNA molde, y en un pocillo todo junto. El resultado nos indicará cual es la proteína que
interacciona con el DNA ya que en el pocillo mezcla presentará una banda con movilidad intermedia y
bandas correspondientes a las proteínas que no se unen al DNA.
• Geles de Footprints o Fingerprints: un paso más que el gel anterior, ya que lo que trata de averiguar es
exactamente que bases interaccionan con la proteína. Para ello hacemos que la proteína este unida al DNA
y añadimos DNAasa I (que corta 1 nucleótido por molécula), de modo, que al cargar la muestra en un
pocillo observaremos bandas de secuenciación menos en el tramo de unión de la proteína, región del DNA
protegida de la digestión. La relación molar entre los dos tipos de macromoléculas debe ser de 1:1, ya que
se hay DNA sin unir se cortaría y aparecerían bandas que nos llevarían a equívoco.
Fraccionamiento celular
Al principio del tema dijimos que en electroforesis utilizaríamos sobre todo macromoléculas, pero no
descartamos separar en un campo eléctrico partes de una célula. Con esta intención se diseñó la técnica de
fraccionamiento celular por electroforesis, que se basa en la electroforesis libre continua, y cuando funciona
es simple y eficaz.
Se trata de pasar una corriente o flujo de líquido (tampón de electroforesis), a través de dos cristales de
tamaño considerable, colocando dos electrodos a los dos lados. Abajo colocamos unos 200 tubos para que
recoja la muestra una vez separada. En el centro, y por arriba, añadimos un homogeneizado que se separará
durante la caída, recogiéndose en los tubos.
Al tratarse de una electroforesis libre hay mucha difusión, de modo, que las fracciones se recogen por zona,
no individualmente. Como ventaja tenemos que tarda 2 o 3 minutos y que al ser continua podemos añadir gran
cantidad de muestra, lo que nos da una gran purificación a bastante concentración.
Kilobases. 1Kb = 1.000 bases nitrogenadas = 1.000 nucleótidos.
En la figura el peine se encuentra en el medio del gel con la única intención de que la forma de colocación se
vea bien.
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Técnicas de Separación
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Electroforesis de ácidos nucleicos
eje
sonda
Papel de nitrocelulosa
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Muestra
+
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Fragmentos y orgánulos celulares recogidos en fracciones según la carga
electrolito
electrolito
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