UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA

Espectro de absorción de la hemoglobina
UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA BIOLOGÍA MOLECULAR Y
FARMACOLOGÍA
LABORATORIO EN BIOQUÍMICA 2007-II
PRÁCTICA 4: ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA HEMOGLOBINA
Coordinador de Práctica: Jorge Arévalo
Asistentes de enseñanza: Maxy De los Santos, Livia Santiváñez
OBJETIVOS
o
o
Obtener y analizar espectros de absorción de biomoléculas.
Aplicar las técnicas espectrofotométricas para el estudio funcional de las biomoléculas.
FUNDAMENTOS
Espectrofotometría
El espectro electromagnético está compuesto de un continuo de ondas con
propiedades distintas. Las regiones de principal importancia en bioquímica son la ultravioleta
(UV, 180-350 nm) y la visible (VIS, 350-800 nm). La luz de estas regiones tiene suficiente
energía para excitar los electrones de valencia de las moléculas, de tal forma que produce dos
procesos: dispersión y absorción de energía. Ambos procesos son la base de muchas técnicas
útiles para la caracterización y el análisis de biomoléculas.
El espectro UV-VIS se obtiene al medir la luz absorbida por una muestra de
biomoléculas en función de la longitud de onda. Esto puede ayudar en la identificación de una
molécula debido a que la longitud de onda de absorción dependerá de la presencia de grupos
funcionales o arreglos de átomos de la muestra. Así, tenemos que el espectro de la
hemoglobina oxigenada (Oxihemoglobina, HbO2) se debe a la presencia del hierro porfirínico y
esto es útil para la caracterización de derivados del núcleo Hemo o hemoproteínas. Cabe
anotar que los picos de máxima absorbancia serán de gran significación en la identificación y
cuantificación de moléculas desconocidas.
La hemoglobina
El oxígeno (O2) es el aceptor final de los electrones en la respiración mitocondrial. Por
lo tanto, el suministro del O2 a la célula es fundamental para obtener la energía en forma de
ATP. En los organismos unicelulares o en los multicelulares de pequeño tamaño, es suficiente
la difusión pasiva del O2 en el entorno para cubrir las demandas celulares. Sin embargo, una
vez que el animal excede un tamaño determinado se requiere de sistemas y moléculas que
garanticen la entrega de O2 en la cantidad necesaria para satisfacer las demandas metabólicas
del organismo. Es así que a lo largo de la evolución biológica se generó:
(a) un sistema de transporte denominado circulatorio, que incluye arterias, venas y capilares,
para el transporte de gases, y
(b) una molécula compleja, la Hemoglobina (Hb), capaz de transportar eficientemente los
gases a y desde los tejidos.
1
Espectro de absorción de la hemoglobina
Figura 1. Molécula de hemoglobina.
Esta molécula lleva oxígeno a los tejidos, y captura el anhídrido carbónico (CO2), bajo la
forma de bicarbonato, luego conduce el CO2 a los pulmones para descargarlo al medio
ambiente durante la respiración pulmonar. Por lo tanto, la hemoglobina debe adaptarse a las
variaciones de pH en los tejidos; es decir, una molécula que responda a las necesidades
fisiológicas, según donde se encuentre, de modo que los cambios de estado funcional
necesariamente deben ir acompañados de cambios estructurales. Dichos cambios pueden ser
monitorizados mediante procedimientos analíticos como la determinación de su espectro de
absorción dentro de un rango determinado de longitud de onda.
Espectros de absorción
Cuando la luz blanca atraviesa una solución coloreada, ciertas longitudes de onda son
absorbidas mientras que otras son transmitidas, es decir prosiguen su camino. Así, una
solución es de color azul porque es la longitud de onda del azul a la que se transmite o
refleja, mientras que todo el resto del espectro se absorbe. El espectrofotómetro, es el
instrumento que permite medir la cantidad de luz que se absorbe a una determinada longitud
de onda.
Una experiencia muy conocida en los vertebrados, es la diferencia de color entre la
sangre arterial y la venosa. La primera es de un color rojo brillante, mientras que la segunda es
de un rojo oscuro. El cambio de color se debe a la diferente concentración de oxígeno presente
en cada tipo de sangre. Este hecho no es exclusivo de los vertebrados, por ejemplo el
pigmento respiratorio hemocianina, presente en ciertos invertebrados, no tiene color cuando
está desoxigenada, pero es azul cuando está completamente oxigenada. Este cambio en el
color, implica que el patrón de absorción de la luz (espectro de absorción) cambió con el
grado de oxigenación del pigmento y esto puede ser empleado para medir la proporción
relativa de las formas oxigenada y desoxigenada en la sangre de los vertebrados.
LECTURAS RECOMENDADAS
1. Boyer R.F. (1993) Spectroscopic Análisis of Biomolecules. En Modern Experimental
Biochemistry 2nd Ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.
2. W.G. Zjilstra, Buurrsma, A., y Meenwaen van der Roest, W.P. (1991). Absorption Spectra
of Human Fetal and Adult Oxyhemoglobin, De-Oxyhemoglobin, Carboxyhemoglobin, and
Methemoglobin. Clin. Chem. 37(9): 1633-8.
3. Horecker B.L. (1942) The absorption spectra of hemoglobin and its derivatives in the visible
and near infra-red regions. J.Biol. Chem. 173-83.
2
Espectro de absorción de la hemoglobina
PARTE PRÁCTICA
Experimento 1: Espectro de absorción de la hemoglobina
1. Obtener 200 L de sangre fresca siguiendo las normas de bioseguridad.
2. Añadir 9.8 mL de agua destilada y agitar. Distribuir en tubos de 1.5 mL.
3. Centrifugar a 12,000g por 5 minutos.
4. Recuperar el sobrenadante y distribuirlo en tres grupos de prácticas: A, B y C.
5. Preparar una solución de Hemina en NaOH 0.5 N
6.
Distribuir las muestras para el barrido de espectro de la siguiente manera (volumen
expresado en microlitros):
GRUPO
A
B
C
Hemina
20
0
0
Lisado con Hb
0
200
200
Reactivo Drabkin
0
0
800
Agua destilada
980
800
0
7. Realizar un Barrido entre 390 nm y 630nm, con un intervalo de 10 nm. Siempre utilizar una
cubeta control o blanco para cada lectura. Refinar el barrido en las regiones de mayor
absorbancia mediante lecturas con intervalos de 5nm.
8. Graficar en papel milimetrado y establecer las longitudes de onda de máxima absorbancia.
Preguntas:
1. ¿Por qué se lee la absorbancia de la hemoglobina entre 390 y 630 nm?
2. ¿Qué diferencias encuentra entre los máximos de absorbancia de la hemina y las muestras
de hemoglobina?- Explique el origen de esas diferencias.
3. ¿Qué longitud de onda utilizaría para identificar hemoglobina en una solución? Explique el
porqué.
4. ¿Existe alguna razón estructural que origine el espectro de absorción de la hemoglobina?
Explique.
Experimento 2: Tabulación de datos para el espectro de absorción de la hemoglobina.
Este ejercicio interesante está en la web. Los datos que se muestran a continuación comparan
los resultados obtenidos de dos fuentes:
1. Scott Prahl ha revisado y colectado espectros para producir una curva de hemoglobina
“ideal”, usando datos proporcionados por W.B. Gratzer, Medical Research Council Labs, Holly
Hill, Londres; N. Kollias de Wellman Laboratorios, Harvard Medical School, Boston y otros.
3
Espectro de absorción de la hemoglobina
2. W.G. Zijlstra, A. Buursma y O. W. van Assendelft en “Visible and Near Infrared Absorption
Spectra of Human and Animal Haemoglobin, VSP, Ultrecht, 2000, hicieron algo similar.
En la siguiente tabla la primera columna indica la longitud de onda expresada en
nanómetros (nm). En las otras columnas, entre paréntesis, se menciona el autor del espectro.
Asimismo se indica si la hemoglobina es de Adulto (HbA) o Fetal (HbF), o si se encuentra
oxigenada (02) o no.
Utilice un papel milimetrado y elabore un espectro de absorción para cada una de las
columnas. Utilice diferentes colores o punteado para cada una de ella. Elabore este ejercicio
en no más de 30 minutos.
Tabla 1
4
Espectro de absorción de la hemoglobina
5
Espectro de absorción de la hemoglobina
6
Espectro de absorción de la hemoglobina
7
Espectro de absorción de la hemoglobina
8
Espectro de absorción de la hemoglobina
Preguntas:
1. ¿Qué concluye de las mediciones de Scott Prahl y W.G. Zijlstra?
2. ¿Qué diferencias hay entre la Hb oxigenada y la desoxigenada?
3. ¿Qué diferencias funcionales hay entre la Hb adulta y la fetal? ¿Qué implicancias
fisiológicas deduce del comportamiento diferencial?
4. ¿Cuál es la razón estructural que origina los espectros de absorción de la
hemoglobina?
9