1 Ejercicios de TP anexos Ejercicio 1 Usted dispone de 3 muestras de tejido de hígado de ratas, siendo 2 de ellos aparentemente tumorales. Una de las características de este tipo de tumor, entre otras cosas es que aparentemente sobreexpresan la proteína AYUDINA. No se sabe si se trata de amplificación génica (varias copias del mismo gen en distintas posiciones de un cromosoma) o simplemente un descontrol en la transcripción del mismo, existiendo una copia única (con sus dos alelos, uno en cada cromosoma homólogo). Para resolver este interrogante, usted realiza una serie de experimentos: 1-Northern blot Se analizan tejidos de las 3 ratas. Se utiliza como sonda un fragmento de DNA doble cadena, marcado y desnaturalizado correspondiente a la secuencia del segundo exón de la ayudina. Se observa lo siguiente: Hígado 1 riñón 1 Hígado 2 riñón 2 Hígado 3 riñón 3 1,5 kb 0,9 kb Responda: 1-A qué corresponden las bandas observadas en la figura anterior? Qué es un Northern blot? Para qué sirve? 2-Por qué no se observan bandas en las muestras de riñón? 3-Aqué se debe que se observen 2 bandas en un experimento de Northern blot en condiciones de baja sal con una sonda altamente específica? 4-Aqué se debe la diferencia de intensidad de bandas en las distintas calles? 5-Qué otro cambio importante ocurrió en la rata 3? 6-Cuál es la rata de expressión normal? 2-Southern blot 1 2 Se utilizó la misma sonda que para los ensayos de Northern blot y se observó lo siguiente: Hígado 1 riñón 1 Hígado 2 riñón 2 Hígado 3 riñón 3 Responda: 1-Brevemente, como se hizo el Southern blot y para qué sirve. 2-A qué corresponden las bandas observadas en este experimento? 3-Existirán sitios de restricción para la enzima utilizada en estos experimentos dentro del exón 2? Utilice esquemas para facilitar su interpretación y su respuesta. 4-A qué podrían deberse las diferencias observadas en cuanto al patrón de bandas en la rata 2? Vuelva a leer el enunciado del problema. 5-Tomando en cuenta los resultados de todos los experimentos (Northern y Southern blot) responda si es possible y según su criterio Y JUSTIFIQUE: a-Qué rata sería la normal y cuales las portadoras de tumor. b-Cuál presentaría amplificación génica y cuál un descontrol de expressión? 6-Aqué podría deberse un descontrol de expressión? 7-Cómo podría determinar la participación de un factor de transcripción en el control de la expression de este gen? Para que sirven los vectores con genes reporteros? 2 3 Ejercicio 2 El esquema de la figura 1 corresponde al gen que codifica para el factor de transcripción FT, el cual controla la expresión de una enzima, exclusiva de hígado y responsable de la degradación de una droga quimioterapéutica: la tumorina. Se sospecha que la resistencia de ciertos tumores a tumorina es la sobreexpresión de FT. 1 ATG TAA E1 E2 EcoRI EcoRI E3 EcoRI 2500 pb 3000 pb DATOS E1=300 pb E2=800 pb E3=500 pb PM de un aa=110 Da ATG= a 65 pb del 5' de E1. TAA= a 35 pb del 3' de E3 1-Esquematice el mRNA maduro correspondiente a FT. En los esquemas que corresponda (mRNA y/o la figura 1) marque el +1, ubicación del promotor, secuencias conservadas dentro del mismo, etiqueta de poliadenilación y clivaje. 2-Represente en un par de esquemas las bandas y sus correspondientes tamaños que se observarían en un Southern blot y en un Northern blot con muestras obtenidas de hígado, riñón y cerebro de rata, utilizando como sonda un oligonucleótido con la secuencia completa correspondiente al exón 2. 3-Determine el peso molecular del FT sabiendo que es un homodímero. 4-Indique los pasos necesarios para la amplificación y chequeo del plásmido que se muestra en la figura 2. 3 4 5a-Indique cuál de los siguientes cultivos de tejidos sobrevive al tratamiento con tumorina y justifique su respuesta: cerebro - hígado normal – riñón - tumor de hígado b-En los mismos cultivos, explique qué resultados espera obtener sin son transfectados con una construcción como la de la figura 2 y luego los exctractos citoplasmáticos enfrentados a luciferina. 2 Promotor que respondea FT Luciferasa 4 kb 1.5 kb 4