XII Exposición Forjadores del Futuro TITULO AUTORES

XII Exposición Forjadores del Futuro
TITULO
6 AÑOS DE EXPERIENCIAS EN LA EVALUACIÓN GENOTÓXICA DE
CONTROLADORES DE PLAGAS Y FERTILIZANTES.
AUTORES
Ailemys Curbelo Valiente
Antonia Remigio Montero, Gladys Pérez Arnáez, Nidia Fernández Esperón, Taimy Ruíz Rodríguez,
Yesenia Rivero Salgado, Ana M. Bada Barro, Axel Mancebo Rodríguez, Yana González Torres, Nelvis
Subirós Martínez, María E. Arteaga Pérez, Asnyel García Díaz, Niurka Somoza Pérez, Odalys Valdés
Faure, Rodolfo Ocaña Arzuaga, Magdalena Legró Soto, Yaribel Torres Mena, Consuelo González
Triana, Jacqueline García Somines, Miriam R. Lemus Mojena
Centro de Toxicología Experimental, CETEX
Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio, CENPALAB
Finca Tirabeque, Carretera El Cacahual Km 2½, Bejucal, AP 3, La Habana, Cuba
Correo electrónico: mail@cenpalab.inf.cu
RESUMEN
La sustitución o reducción de los plaguicidas y fertilizantes químicos, mediante el uso de agentes
biológicos u orgánicos, constituye una necesidad actual. No obstante el reconocimiento a su menor
toxicidad, el desarrollo de estos productos tiene necesariamente que llevar en paralelo un sistema
evaluativo que permita conocer, con certeza, el impacto que sobre el medio ambiente y los seres
humanos puedan ocasionar. Por ello resulta imprescindible realizar una evaluación biológica de los
mismos, que comprende estudios sobre la actividad tóxica y genotóxica.
En el Centro de Toxicología Experimental del Centro Nacional para la Producción de Animales de
Laboratorio, en Cuba, se ha desarrollado esta evaluación genotóxica mediante el uso de una batería de
ensayos in vivo en roedores, que incluye los ensayos de Micronúcleos y Citogenética en Médula Ósea,
y de Morfología de la Cabeza del Espermatozoide. Con el empleo de este grupo de ensayos, se han
evaluado 8 controladores de plagas y 4 fertilizantes, obteniendo resultados que han permitido una
utilización más segura de estas sustancias, así como su registro y comercialización.
INTRODUCCION
La sustitución o reducción de los plaguicidas y fertilizantes químicos, mediante el uso de agentes
biológicos u orgánicos, constituye una necesidad actual. No obstante el reconocimiento a su menor
toxicidad, el desarrollo de estos productos tiene que llevar en paralelo un sistema evaluativo que
permita conocer con certeza, el impacto que sobre el medio ambiente y los seres vivos puedan
ocasionar. Dicha evaluación comprende estudios sobre la actividad genotóxica, la cual ha sido
desarrollada en el Centro de Toxicología Experimental del CENPALAB, mediante el uso de una
batería de ensayos in vivo en roedores.
ó
Entre los ensayos in vivo incluidos con carácter permanente en las baterías de evaluación genotóxica, se
encuentra la prueba de Micronúcleos en Medula Ósea de ratón1 y el ensayo de Aberraciones
Cromosómicas en Médula Ósea de rata. Otra de las pruebas de genotoxicidad empleada con este fin es
el ensayo de Morfología de la Cabeza de los Espermatozoides en ratón.
Estos son ensayos cortos de genotoxicidad ampliamente utilizados para detectar daños celulares
inducidos por sustancias químicas a cromosomas o al aparato mitótico2, que están claramente
involucrados en el origen del cáncer1, lo que proporciona las mejores bases para la estimación del
riesgo en humanos3.
Durante 6 años consecutivos nuestro laboratorio se ha visto enfrascado en la realización de estos
ensayos de genotoxicidad, con el principal objetivo de evaluar el potencial genotóxico de un grupo de
fertilizantes y controladores de plagas destinados fundamentalmente al sector agrícola y otros a la salud
pública de nuestro país y otros países del mundo.
Los principales objetivos trazados en este trabajo son:
•
Describir los procedimientos establecidos para el desarrollo de cada uno de los ensayos de
genotoxicidad in vivo empleados en la evaluación genotóxica de fertilizantes y controladores de
plagas.
•
Explicar los principales resultados obtenidos en la ejecución de estos estudios.
•
Valorar el aporte económico y social de los resultados expuestos.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Las pruebas se ejecutaron siguiendo las líneas directrices de la OECD 19974; FDA 19965 y de la
Comunidad Económica Europea 1993 para los Ensayos de Genotoxicidad (Sección 4. Health effects)6 y
cumpliendo con lo orientado en los Principios de la Buenas Prácticas de Laboratorio no Clínico de
Seguridad Sanitaria y Medioambiental Regulación 39/2004 7 y en los Procedimientos Operacionales de
Trabajo del CETEX8.
Descripción de los ensayos empleados
Ensayo de Aberraciones Cromosómicas en Médula Ósea de ratas Cenp:SPRD.
Estos ensayos fueron ejecutados siguiendo el procedimiento descrito por Legator y col. en 19698 que
propusieron un esquema de tratamiento consistente en una simple aplicación de las sustancias de ensayos y
a las 24 horas post-tratamiento, se procede al sacrificio mediante dislocación cervical. Dos horas antes del
sacrificio, a los animales se les administra por vía intraperitoneal Colchicina (inhibidor del ciclo celular) en
una dosis de 4 mg/kg. p.c.
Se extraen ambos fémures y se colecta la médula ósea de los mismos.
De esta forma obtenemos células detenidas en etapa de metafase
facilitándose la observación del cariotipo de la célula.
Las aberraciones cromosómicas son evaluadas en las primeras mitosis
post-tratamiento. La mayoría de los mutágenos inducen aberraciones de
tipo cromatídico, aunque también ocurren aberraciones cromosómicas.
Se determina el Indice de Genotoxicidad, al cuantificar las aberraciones
cromosómicas numéricas y estructurales presentes en 50 metafases por
animal.
Fig. 1: Cariotipo normal de rata (42 cromosomas)
Ensayo de Micronúcleos en Médula Ósea de ratones Cenp:NMRI.
El procedimiento empleado para la obtención de las preparaciones de la médula ósea, fue realizado de
acuerdo a la metodología propuesta por Schmid en 19769. Para este ensayo se aplicó el esquema de
tratamiento subagudo, consistente en 2 administraciones separadas entre sí por 24 horas y sacrificio de
un solo tiempo, a las 24 horas de la segunda aplicación).
El procedimiento empleado para la obtención de las preparaciones de la médula ósea permite obtener
una tinción diferencial entre los PCE y los NCE.
A partir de dicha tinción se cuantifica el número de
PCE portadores de micronúcleos (MN) y se expresa
en % de PCE/MN con respecto al total de PCE
observados, (1000 por animal), (Indice de
Genotoxicidad). Se valora además la proporción
PCE/NCE como estimador de toxicidad sobre la
hematopoyesis, para ello se cuantificaron los NCE
presentes hasta el conteo de 250 PCE en cada lamina
(Indice de Toxicidad).
Fig. 2: Observación microscópica de médula ósea de ratón (PCE, NCE y MN)
Ensayo de Morfología de la Cabeza de los Espermatozoides en ratones Cenp:NMRI.
Todas las sustancias evaluadas se administraron 5 días consecutivos y a los 35 días de la primera
administración se procedió al sacrificio mediante dislocación cervical, procediéndose a la extracción de la
cola del epidídimo, siguiéndose el procedimiento descrito por Wyrobek y Bruce en 197810 que permite
determinar el Indice de Genotoxicidad, al analizar 500 espermatozoides por lámina (1000 x animal),
siguiendo el criterio de clasificación planteado por Wyrobek y Bruce en 197810 basado en la morfología de
la cabeza del espermatozoide, identificando 4 categorías morfológicas: normales, amorfos, bananas y sin
gancho. Para ello se determinó el porcentaje de cabezas anormales con respecto al porciento de cabezas
normales comparándose el control negativo y el grupo tratado.
Los restantes 0.5 mL se utilizaron para
determinar la concentración espermática.,
mediante el empleo de la Cámara de Neubauer,
determinándose el Indice de Citotoxicidad.
Todas las lecturas se realizaron en un
microscopio Opton con objetivo de 100 x.
Fig. 3: Espermatozoides de ratón (Normales, Sin gancho, Banana y Amorfos)
Sustancias evaluadas con la batería de ensayos de genotoxicidad in vivo
Con el empleo de esta batería de ensayos, se han evaluado en nuestro centro 12 productos (8 controladores
de plagas y 4 fertilizantes), realizándose en total 30 ensayos de genotoxicidad in vivo.
Controladores de plagas
1. Gluticid
2. NeoNim 60
3. OleoNim 80
4. BACTIVEC
5. GRISELESF
6. BIORAT
7. Metarhizium anisopliae cepa M-11
8. Beauveria bassiana cepa LBb-1 (32)
Fertilizantes
1. Acido Indolacético
2. Acido Jasmónico
3. FitoMas-E
4. FitoMas-H
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ninguno de los productos evaluados afectó desde el punto de vista clínico a los animales de
experimentación.
Ensayos de Aberraciones Cromosómicas en rata Cenp:SPRD
•
Ninguno de los 30 productos mostraron afectación genotóxica ni citotóxica sobre los eritrocitos de
la médula ósea de los animales tratados.
Ensayos de Micronúcleos en Médula ósea de ratón Cenp:NMRI
•
No mostraron efecto genotóxico, excepto en el caso del Gluticid en hembras. Para el Indice de
Citotoxicidad encontramos resultados positivos para las hembras del Gluticid y en los machos de la
dosis alta del FitoMas-E.
Ensayo de Morfología de la Cabeza de los Espermatozoides en ratón Cenp:NMRI
•
Se pudo detectar que el Gluticid afectó genotóxica y citotóxicamente a los ratones tratados, los
restantes productos mostraron resultados negativos.
Publicaciones asociadas
1. Evaluación genotóxica in vivo de 2 insecticidas biológicos con el ensayo de micronúcleos. Revista
CENIC Ciencias Biológicas. ISBN 959-7145-11-1, p 30.
2. Evaluación genotóxica in vivo de un bioinsecticida mediante el ensayo de la morfología de la
cabeza del espermatozoide. Revista CENIC Ciencias Biológicas. ISBN 959-7145-11-1, p 32.
3. Evaluación mutagénica de un rodenticida, con el ensayo de micronúcleos. Revista CENIC
Ciencias Biológicas. ISBN 959-7145-11-1, p 33.
4. In vivo Micronucleus Test for the Genotoxic Evaluation of BACTIVEC and GRISELESF.
(Resúmenes del 41st Congreso de la Sociedad Europea de Toxicología EUROTOX 2003).
Toxicology Letters, Vol. 144 Suppl. 1, September 2003, ISSN: 0378-4274, p: s125.
Presentación en eventos
4 to Taller Nacional y 2do Internacional de MTC. Dic/01.
•
•
•
Evaluación genotóxica de 2 Bioinsecticidas con Ensayo de Micronúcleos in vivo.
Evaluación genotóxica in vivo de un Bioinsecticida, mediante el Ensayo de la Morfología de la
Cabeza del Espermatozoide.
Evaluación mutagénica de un Rodenticida, con el Ensayo de Micronúcleos.
X Exposición Forjadores del Futuro (nivel base - nacional). Feb/02.
•
Evaluación genotóxica: BACTIVEC y GRISELESF.
I Taller Internacional de Toxicología. Oct/02.
•
Evaluación mutagénica del Gluticid, utilizando ensayos in vivo.
•
Evaluación genotóxica del Acido Jasmónico.
•
Evaluación mutagénica del Acido Indolacético, mediante el ensayo de MN.
24 Edición del Concurso Científico–Técnico Juvenil (Provincial). Dic/02.
•
Evaluación Mutagénica in vivo de un bioproducto cubano.
EUROTOX 2003. Italia/Sept - Oct/03.
•
In vivo micronucleus test for the genotoxic evaluation of BACTIVEC and GRISELESF.
XI Exposición Forjadores del Futuro (Nivel de centro). Mar/04.
CubaZoo. Mar/04
•
Evaluación Mutagénica de Plaguicidas Microbianos destinados a la agricultura.
5 to Taller Nacional de MTC. Jun/04.
•
Evaluación Genotóxica de sustancias reguladoras del crecimiento, destinado al sector agrícola.
XII Exposición Forjadores del Futuro (Nivel municipal). Jun/06.
•
6 anos de experiencias en la evaluación genotóxica de controladores de plagas y fertilizantes.
(Premio).
Forum de Ciencia y Técnica
XIV Forum de Ciencia y Técnica. 1ra etapa. Nivel de base. Sept/01.
• Evaluación genotóxica de dos Bioinsecticidas con el Ensayo de Micronúcleos in vivo. (Relevante).
• Evaluación genotóxica in vivo de un Bioinsecticida con el Ensayo de Morfología de la Cabeza del
Espermatozoide. (Mención).
XIV Forum de Ciencia y Técnica. Nivel municipal. Oct/01
• Evaluación genotóxica de dos Bioinsecticidas con el Ensayo de Micronúcleos in vivo. (Mención).
XIV Forum de Ciencia y Técnica. Segunda etapa. Nivel de base. Jun/02
• Evaluación mutagénica del Acido Jasmónico: Ensayo de Citogenética en Médula Osea. (Mención).
• Evaluación toxicológica del BACTIVEC y GRISELESF. (Destacado).
XIV Forum de Ciencia y Técnica. Segunda etapa. Nivel municipal. Sept/02
• Evaluación toxicológica del BACTIVEC y GRISELESF. (Destacado).
XV Forum de Ciencia y Técnica. Primera etapa. Nivel de base. Jun/03.
• Evaluación genotóxica del Metarhizium anisopliae cepa M-11, mediante los ensayos de
Micronúcleos y Espermatozoides en ratón Cenp:NMRI. (Mención).
XV Forum de Ciencia y Técnica. Segunda etapa. Nivel de base. Jun/04
• Plaguicidas microbianos destinados a la agricultura evaluados genotóxicamente empleando
ensayos in vivo. (Destacado).
• Evaluación genotóxica de sustancias reguladoras del crecimiento destinadas a la agricultura.
(Mención)
Valoración económica y social
Aporte económico:
La realización de estos ensayos constituye para el país un ahorro considerable al no tener que contratar su
ejecución en el exterior con un costo muy superior a lo establecido por nuestro centro, permitiendo a su
ves el desarrollo de nuestras tecnologías y nuestra capacidad científica.
Los ingresos correspondientes al CENPALAB por la ejecución de estos 30 estudios también tienen un
impacto significativo, siendo un valor de 207400 en moneda nacional y 420 CUC.
Estos ensayos forman parte del expediente de cada producto para el registro y posterior comercialización
de los mismos, lo que ha permitido que en la actualidad algunos de estos compuestos ya se estén
comercializando no solo nuestro país sino también en el exterior, obteniéndose ingresos por este concepto.
Aporte social:
El empleo mas seguro de compuestos que brindan beneficios a nuestra sociedad, también ha sido uno de
los aportes derivados de las evaluaciones genotóxicas realizadas por nuestro laboratorio a los 12
compuestos en cuestión.
•
Los bioplaguicidas Gluticid, NeoNim 60, OleoNim 80, Methasave y Basisave (cuyos principios
activos son los hongos Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana, respectivamente), se
emplean en el control de plagas que azotan cultivos de interés económico.
•
Bactivec y Griselesf, son dos bioinsecticidas obtenidos por LABIOFAM para el control de
vectores portadores de enfermedades que atacan a nuestra población. Los mismos son empleados
por nuestro Ministerio de Salud Publica en la Campana contra el Dengue.
•
Biorat se emplea satisfactoriamente en la desratización de nuestra comunidad,
•
Los diferentes fertilizantes estudiados (Ácido Jasmonico, Ácido Indolacetico, FitoMas – E y H),
constituyen una herramienta importante para el desarrollo vegetal de numerosos cultivos,
alcanzándose con su empleo resultados relevantes para la agricultura.
CONCLUSIONES
Se puede concluir que:
•
Los tres ensayos descritos han demostrado ser adecuados para caracterizar genotóxicamente a los
productos evaluados.
•
Los resultados obtenidos han permitido una utilización más segura de los productos evaluados y
han evidenciado rigor científico reconocido a diferentes niveles.
•
El impacto económico para nuestro centro y el país es notable y se evidencia la implicación social
de los mismos, en el registro, comercialización y empleo de estos productos
BIBLIOGRAFÍA.
1. Hoffmann, G. (1996). Genetic Toxicology. Toxicology: The basic science of poison. 5 th edition.
Cassarett and Doulls. 9: 269-300.
2. Castaño, A.; Sánchez, P.; Llorente, M. Inducción de micronúcleos en células de peces por
benzo(a)pireno: detección por citometría de flujo. En: de la Peña, E.; Burguete, I.; Guadaño, A.
(1999). Evaluación Mutagénica y Genotóxica. Ed: Sociedad Española de Mutagénesis Ambiental:
137-149.
3. Hayashi, M.; Norppa, H.; Sofuni, T.; Ishidate, M. (1992). Mouse bone marrow micronucleus test
using flow cytometry. Mutagenesis. 7 (4): 251-256.
4. OECD. (1997). Organizacón Económica de Cooperación y Desarrollo. Guidelines for Testing of
Chemical. Genetic Toxicology.
5. Food and Drugs Administration. (FDA). (1996). Code of federal regulations. 21. Part. 58. Good
Laboratory Practice for Nonclinical Laboratory Studies.
6. CEE (1991) 91/C 414/CEE relativa a la comercialización de Productos Fitosanitarios. Diario O. de
la CE. 19.8.91.
7. Principios de la Buenas Prácticas de Laboratorio no Clínico de Seguridad Sanitaria y
Medioambiental. Buró Regulatorio para la Protección de la Salud Pública, MINSAP. Regulación
39/2004.
8. . Procedimientos Operacionales de Trabajo. División de Toxicología Experimental. Edición 01/03.
9. Legator, M. S., Palmer, K. A., Green, S., and Peterson, K. W. Cytogenetic studies in rats of
cyclohexalamine, a metabolite of cyclamate. Science 165: 1139-1140, 1969.
10. Schmid, W. (1976). The micronucleus test for cytogenetic analysis. Chemical mutagens. Ed A.
Hollaender. Plenum, New York. 4: 31-53.
11. Wyrobek, A. J. Bruce, W. R. (1978). The induction of sperm-shape abnormalities in mice and
humans. Chemical mutagens: Principles and methods for their detection. Vol 5. Ed. A. Hollaender
& De Serres, Plenum Press, New York. F. J. 257-285.