XVI FORUM de Ciencia y Técnica segunda Etapa. Título: EVALUACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE DIIIE2J COMO LIGANDO PARA EL AISLAMIENTO DE RECEPTORES CELULARES DEL VIRUS DEL DENGUE. Autor: Roberto Rodríguez Labrada*. Coautores: Vivian Huerta Galindo.# Alejandro M. Martín Dunn #. *Centro para la Investigación y Rehabilitación de las Ataxias Hereditarias CIRAH-, Holguín, Cuba. MINSAP, # Laboratorio de Antivirales contra el virus Dengue. Unidad de Química Física. Dirección de Investigaciones biomédicas del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología-CIGB-, La Habana, Cuba. Holguin 2006 1 RESUMEN: La fiebre por dengue y el dengue hemorragico constituyen un gran problema de salud en Cuba el resto de los países tropicales y subtropicales. El desarrollo de estrategias antivirales basadas en el bloqueo de la interacción virus-célula hospedera se ve imposibiltado por el desconocimiento de la identidad molecular de los receptores celulares de estos patógenos. El aislamiento, identificación y caracterización de sus receptores se puede realizar mediante cromatografía de afinidad, para lo cual resulta imprescindible la selección de los ligandos más apropiados. Objetivos: Evaluar si la proteína recombinante DIIIE2J reproduce características estructurales y funcionales de este fragmento en la proteína E de manera que pueda ser empleada como ligando en estudios de aislamiento y caracterización del receptor celular del virus Dng2. Materiales y métodos: Preparaciones purificadas de DIIIE2J fueron sometidas a un estudio fisico-químico mediante cromatografía líquida de alta resolución para comprobar su homogeneidad. Ademas se realizó un análisis estructural de la misma mediante espectrometría de masas y se comprobó su estado de agregación a través de cromatografía de exclusión molecular. La caracterización antigénica se realizó mediante Western Blott, Dot Blott y ELISA empleando anticuerpos de origen humano y murino. La funcionalidad de la proteína fue analizada mediante un ensayo de unión a células BHIK-21, seguido por citometría de flujo. Resultados: Las preparaciones utilizadas de la proteína DIIIE2J poseen una gran homogeneidad y pureza. Esta proteína tiene el único puente S-S correctamente formado y la Met N-terminal está procesada. En las soluciones en que se ensayó, la misma se encuentra formando monómeros. DIIIE2J es reconocida por anticuerpos de ratón y humanos en los 3 formatos inmunoenzimáticos empleados y se une especificamente a la superficie de la células BHK-21. Conclusiones: La proteína recombinante DIIIE2J presenta un plegamiento que reproduce características estructurales y funcionales del dominio III de la proteína E de Dng2 por lo que constituye un ligando atractivo para emplear en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores celulares del virus en la superficie de las células.Etapa de aplicación se encuentra el trabajo: La presente investigación se terminó y se generalizará para caracterizar las proteínas recombinantes homólogas de los restantes 3 serotipos. 2 DATOS DE AUTORES Y COAUTORES. Nombre y Apellidos: Roberto Rodríguez Labrada. edad: 81051417724, 25 años. Dirección particular y teléfono: B. Masso, # 180 Puerto Padre, Las Tunas, Cuba.. Centro de trabajo y teléfono: Laboratorio de Neurofisiología Molecular de la Centro para la Investigación y Rehabilitación de las Ataxias Hereditarias, Holguín, 424090 Profesión o cargo: • Licenciado en Microbiología, especialista en Inmunología y Virología. • Jefe de Ciencia y Técnica del Centro para la Investigación y la Rehabilitación de la Ataxia Hereditaria, Holguín, 424090 • Jefe de Departamento de Neurofisiología Clínica del Centro para la Investigación y la Rehabilitación de la Ataxia Hereditaria, Holguín, 424090 Organizaciones a las que pertenece: UJC, ANIR, BTJ, CDR, MTT. Nivel de escolaridad: Universitario Sindicato: MINSAP y CITMA Nombre y Apellidos: Vivian Huerta Galindo. Carné de Identidad y edad: 71020615472 , 35 años. Dirección particular y teléfono: Edificio 3115 Cubanacan Playa Centro de trabajo y teléfono: Laboratorio de Antivirales contra el virus Dengue. Unidad de Química Física. Dirección de Investigaciones biomédicas del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. La Habana, Cuba. 2716022 Ext 3150 Profesión o cargo: • Licenciada en Bioquímica. • Especialista en Química de proteínas, inmunología y virología. • Jefa del Laboratorio de Antivirales contra el Dengue en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. Organizaciones a las que pertenece: PCC, FMC, CTC, ANIR, CDR. Nivel de escolaridad. Universitario Sindicato: CITMA. 3 Nombre y Apellidos: Alejandro M. Martín Dunn Carné de Identidad y edad: 670501010885, 39 años. Dirección particular y teléfono: Edificio 3115 Cubanacan Playa Centro de trabajo y teléfono: Laboratorio de Antivirales contra el virus Dengue. Unidad de Química Física. Dirección de Investigaciones biomédicas del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología. La Habana, Cuba. 2716022 Ext 3150 Profesión o cargo: • Licenciado en Biología. • Especialista en Biología Molecular y Bioinformática. Organizaciones a las que pertenece: PCC, CTC, ANIR, CDR. Nivel de escolaridad. Universitario Sindicato: CITMA. 4 1. INTRODUCCIÓN El dengue es una enfermedad febril aguda, causada por el virus del mismo nombre y trasmitida a los humanos por la picadura de un mosquito infectado, principalmente el Stegomyia aegyti. La Organización Mundial de la Salud reporta estimados de 50 millones o más casos de infección y alrededor de 24 000 muertes cada año. Actualmente no se dispone de una vacuna efectiva contra el virus ni de un tratamiento específico para esta enfermedad. Teniendo en cuenta que estudios recientes han demostrado una alta correlación entre los niveles de viremia y la severidad de la enfermedad, el diseño de una droga antiviral efectiva representa una estrategia muy atractiva para el control de las formas severas de la misma. Unas de las estrategias más efectivas para bloquear la infección viral es inhibir la entrada de los viriones a las células hospederas. Sin embargo, el desarrollo de antivirales específicos basados en esta estrategia se ve limitado por el desconocimiento de la identidad de los receptores celulares del virus Dengue (Dng), así como de los determinantes estructurales de la interacción de las proteínas virales con los mismos. Numerosas evidencias confirman que el dominio III de la proteína de la envoltura (E) del virus Dng forma parte de la región de interacción de esta proteína con los receptores de la superficie de las células. Es por esta razón que el aislamiento de proteínas de la membrana celular que interactúan de forma específica con el dominio III puede conducir a la identificación de los receptores virales En nuestro grupo se ha evaluado el empleo de las proteínas recombinantes PD5 y PD2, las que incluyen los residuos correspondientes al dominio III del virus Dng2 (cepa Jamaica 1409), fusionados a distintos fragmentos de la lipoamida deshidrogenasa de Neisseria meningitidis (P64K), como ligandos para el aislamiento de los receptores celulares del virus en experimentos de cromatografía de afinidad. Los resultados experimentales obtenidos evidenciaron la alta reactividad de la región correspondiente a la P64K con las preparaciones celulares empleadas. Con el objetivo de disponer de una variante recombinante del dominio III de Dng2 sin proteína portadora, se clonó y expresó en E.coli la proteína DIIIE2J, que contiene el dominio III de la proteína E del virus Dng2 (cepa Jamaica 1409), fusionado a una cola de 6 His. En las condiciones de expresión establecidas la proteína representa aproximadamente el 20% del 5 contenido de proteína total en la bacteria y se alcanza un rendimiento en su purificación de aproximadamente 60 mg por litro de cultivo. Para ser empleada como ligando es necesario determinar si DIIIE2J reproduce las principales características estructurales y funcionales del dominio III en el contexto de la proteína E presente en el virión maduro. 6 OBJETIVOS Objetivo general o Evaluar si la proteína recombinante DIIIE2J reproduce características estructurales y funcionales de este fragmento en la proteína E de manera que pueda ser empleada como ligando en estudios de aislamiento y caracterización del receptor celular del virus Dng2. Objetivos específicos 1. Realizar una caracterización físico-química de la preparación purificada de DIIIE2J. 2. Determinar si DIIIE2J contiene epitopos de esta región de la proteína E, presentes en la partícula viral. 3. Demostrar la capacidad de DIIIE2J de interactuar con proteínas de superficie de células intacta 7 DESCRIPCIÓN DE LA TECNOLOGÍA Diseño experimental Células Se emplearon células de la línea procedente de riñón de hámster neonato (BHK-21), donadas por el Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí”, de La Habana, Cuba. Las células se cultivaron en medio MEM (Gibco, EEUU), suplementado con 5% (v/v) de suero fetal bovino (SFB) (HyClone, EEUU) a 37oC en atmósfera de 5% de CO2. Para la realización de los ensayos se sembraron placas de 60 mm (Corning, EEUU) con 1.5 x 106 células las que se incubaron hasta alcanzar la confluencia. Posteriormente las células se desprendieron mecánicamente, se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml y se centrifugaron a 800 g durante 5 min. Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las células en la solución tampón 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1% SFB en PBS pH 7.4 (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM K2HPO4), para ser lavadas por centrifugación con las mismas condiciones antes mencionadas. La viabilidad celular se examinó mediante el método de exclusión de azul de tripán. Preparaciones virales. Se utilizaron preparaciones de antígenos virales de los serotipos 1 y 2, obtenidos previamente por el método de sacarosa-acetona (Clarke y Casals 1958), a partir de homogenados de cerebros de ratones OF1 lactantes, inoculados intracranealmente con cepas neuroadaptadas de cada uno de los serotipos. Las preparaciones empleadas como control negativo se obtuvieron siguiendo el mismo procedimiento a partir de homogenados de cerebros de ratones no inoculados. Anticuerpos y proteínas. • Líquidos ascíticos hiperinmunes generados contra Dng1 (LAH α Dng1) y Dng2 (LAH α Dng2). Ambas preparaciones se obtuvieron por inmunización de ratones Balb/C con los antígenos del serotipo correspondiente, obtenidos de la forma expuesta en 3.2. Como control negativo se empleó una mezcla de sueros de ratones Balb/C no inmunizados. • Sueros de personas que fueron infectadas por el virus Dng y padecieron distintos grados de severidad de la enfermedad. Como control negativo de los ensayos se empleó el suero 8 de una persona sin antecedentes de haber presentado síntomas asociados a una infección por el virus Dng y que no presenta título antiviral detectable en diferentes ensayos inmunoenzimáticos establecidos con este fin en el laboratorio. • P64K, enzima lipoamida deshidrogenasa de Neisseria meningitidis, obtenida por vía recombinante en E. coli. Esta proteína fue suministrada por el Departamento de purificación de la División de Desarrollo Tecnológico del CIGB. • PD5, PD10 y PD18, proteínas recombinantes obtenidas por el grupo de Dengue de la división de Vacunas del CIGB. Estas proteínas contienen el dominio III (residuos 286426) de la proteína E de los virus Dng2 (cepa Jamaica 1409), Dng1 (cepa Jamaica 1636) y Dng3 (cepa Nicaragua 24), fusionadas a C-terminal de P64K. Las preparaciones utilizadas fueron suministradas por el Departamento de purificación de la División de Desarrollo Tecnológico del CIGB. • Preparaciones comerciales con más de un 85% de pureza de Albúmina del suero bovino (BSA), citocromo C, Lactalbúmina e Insulina bovina (Sigma, EEUU). • Preparación con más de un 90% de pureza de Estreptoquinasa recombinante, suministrada por el Departamento de purificación de la División de Desarrollo Tecnológico del CIGB. Cuantificación de proteínas. Se utilizó un estuche de reactivos para la determinación de concentración de proteínas por el método del ácido bicinconínico (Pierce, EEUU) y se siguieron las instrucciones del fabricante para los ensayos en placas de 96 pozos. Para obtener la curva de calibración se emplearon distintas diluciones (0.015–2 mg/mL) de BSA. Los coeficientes de correlación obtenidos para el ajuste de las ecuaciones lineales oscilaron entre 0.994 y 0.998. Reducción y carboximetilación de proteínas Dos partes de una solución de DIIIE2J con una concentración de 0.5 mg/mL, se mezclaron con una parte de la solución tampón 0.3 M Tris, 6M GnHCl, 1 mM EDTA, pH 8.5. A esta mezcla se le añadió el volumen necesario de una solución 0.1 M ditiotreitol (DTT) (Sigma, EEUU) para alcanzar una concentración final en la reacción de 10 mM. La mezcla se incubó en la oscuridad 9 durante 2 h a 37oC en baño termostatado. Luego se añadió iodoacetamida (IAA) (Sigma, EEUU), a partir de una solución 0.2 M de este agente alquilante, para una concentración final de 20 mM y se mantuvo durante 30 minutos en la oscuridad a 25oC. La proteína reducida y carboximetilada (RCM) se dializó contra la solución tampón 20 mM de acetato de sodio, pH 4. Reacción de biotinilación de proteínas A las alícuotas de la proteína DIIIE2J sin modificar y RCM se les ajustó el pH empleando una solución 0.2 M NaOH hasta alcanzar un valor entre 8-8.2. El reactivo de la biotina activada (Nhydroxysuccinimido-biotin) (Sigma, EEUU) se disolvió en dimetilsulfóxido a una concentración de 10 mg/mL y se añadió el volumen necesario a la solución de proteínas, para alcanzar una proporción de 20 moles de biotina por mol de proteína. La reacción se incubó en la oscuridad toda la noche a 4oC, con agitación suave. Para detener la biotinilación se adicionó solución tampón 1 M Tris-HCl, pH 8 en una proporción de 20 µL por mg de proteína. Las preparaciones de proteínas biotiniladas se dializaron contra la solución tampón PBS. El mismo procedimiento se empleó en la biotinilación de una alícuota de la proteína BSA, para ser empleada como control negativo en los ensayos. Análisis en cromatografía líquida de alta resolución-fase reversa (RP-HPLC). Alícuotas de aproximadamente 45 µg de la preparación de DIIIE2J en estado nativo y 80 µg de DIIIE2J RCM se aplicaron a una columna de fase reversa C4 4.6x250 mm (J.T.Baker, EEUU). La corrida cromatográfica se realizó a 37oC empleando un sistema cromatográfico de alta presión equipado con dos bombas y un controlador. Para la elución de la proteína se aplicó un gradiente de 10 a 60 % (v/v) de acetonitrilo en 0.1% (v/v) de ácido trifluoroacético a un flujo de 0.8 mL/min. La detección se realizó a 226 nm utilizando un detector de longitud de onda variable. 1.1 Análisis por espectrometría de masas. Los espectros de masas se adquirieron en un espectrómetro de masas híbrido con geometría octogonal QTOF-2TM (Micromass, UK) equipado con fuente de ionización por 10 electronebulización Z-spray. El capilar de entrada se sometió a 3000 V y el voltaje del cono fue de 35 V. El analizador se calibró usando yoduro de sodio como referencia, en el rango de masa/carga de 50 a 2000. El software de procesamiento de los espectros de masas empleado fue el MassLynx versión 3.5 (Micromass, UK). Análisis en cromatografía de exclusión molecular. Alícuotas de 100 µL de DIIIE2J y de las proteínas patrones (BSA, citocromo C, Lactalbúmina, Insulina bovina y Estreptoquinasa recombinante) disueltas a una concentración de 1mg/ml se aplicaron a una columna Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con tampón PBS pH 7.4. Todas las corridas se realizaron a 25oC y un flujo de 0.5 mL/min empleando un sistema cromatográfico de alta presión (Merck-Hitachi, Alemania). La detección se realizó a 226 nm y los cromatogramas se registraron empleando el programa EZChrom Elite (Merck-Hitachi, Alemania). Electroforesis de proteínas (SDS-PAGE) Se utilizaron geles de poliacrilamida al 15%, según las condiciones estándar de Laemmli (Laemmli 1970). Las muestras de la proteína DIIIE2J se diluyeron 1:1 (v/v) en tampón muestra: 1% SDS, 0.3 M Tris-HCl, pH 6.8 y se calentaron durante 2 min a 95oC. Para el análisis en condiciones reductoras se siguió el mismo procedimiento pero adicionando 2 mM βmercaptoetanol al tampón de muestra. Se utilizó una cámara Mini-PROTEAN II (BioRad, EUA), se fijó la corriente a 30 mA por gel, controlado por una fuente de corriente EPS 600 (Pharmacia Biotech, Suecia). La solución tampón empleada para la corrida electroforética fue 0.25 M Tris-HCl, 1.92 M glicina, pH 8.3 y 1% SDS. Detección de proteínas en geles de poliacrilamida por tinción con azul de coomasie. La tinción se llevó a cabo sumergiendo los geles durante 30 min en una solución 0.25% (p/v) de azul de coomasie (Sigma, EUA) en etanol: ácido acético: agua (5:1:5), a 25oC con agitación. Para la destinción se realizaron tres incubaciones de 1 h en etanol: ácido acético: agua (5:1:5), preparado antes de usar. 11 Western blotting Las proteínas separadas electroforéticamente como se describe en 3.9 se transfirieron del gel a membranas de nitrocelulosa Hybond-ECL de 0.45 µm (Amersham, Reino Unido) en un equipo de transferencia sumergida Mini Trans-Blot Cell (BioRad, EEUU), según Towbin y cols (Towbin y cols 1979). Posterior a la transferencia, las membranas se bloquearon con leche descremada (Oxoid, Inglaterra) al 5% (p/v) en PBS conteniendo Tween-20 (Riedel-de Haden, Alemania) al 0.1% (v/v) (PBST) por incubación durante 1 h a 25°C, con agitación. Luego se lavaron las membranas 3 veces, durante 10 minutos, agitando con abundante PBST. Seguidamente se incubaron toda la noche en agitación a 4°C con el anticuerpo correspondiente diluido en PBST, 5% de leche descremada. Luego se repitieron los lavados de la misma forma antes descrita y se incubó 1 h a 25°C, con el conjugado correspondiente; anti-IgG murinoperoxidasa (Amersham, Reino Unido) en el caso en que se emplearon anticuerpos de ratón y anti-IgG humano-peroxidasa (Sigma, EEUU), en el caso de los anticuerpos de origen humano. Seguidamente se volvieron a lavar las membranas y se incubaron en 3,3 diaminobenzidina (Sigma, EEUU) y H2O2, ambos al 0,1 % en PBS hasta la aparición del color que indica la reactividad. Finalmente las membranas se lavaron con un exceso de PBST. Dot blotting El ensayo con señales en forma de cuadrados se realizó en una cámara del tipo MINIPROTEAN II MULTI SCREEN (BioRad, EEUU). Las proteínas DIIIE2J nativa, RCM y BSA como control negativo se aplicaron sobre una membrana de nitrocelulosa del tipo expuesto en 3.11 durante 1h a 25oC. Además se transfirieron a la membrana cantidades fijas de PD5 como control positivo y preparaciones negativas y positivas del antígeno viral de Dng2 referido en 3.2. La membrana se bloqueó durante toda la noche, con agitación a 4oC en PBST, conteniendo leche descremada al 5%. Luego se lavó mediante el mismo procedimiento descrito en 3.11. Para la incubación con las diferentes preparaciones de anticuerpos diluidas en PBST, leche descremada al 5% durante 2h a 25oC se empleó nuevamente la cámara referida pero colocando la membrana con una rotación de 90oC respecto a la orientación de recubrimiento. Posteriormente se repitieron los lavados de la misma forma y se incubó con un conjugado antiIgG murino-peroxidasa (Amersham, Reino Unido) para el sistema murino y anti-IgG humanoperoxidasa (Sigma, EEUU), para el sistema humano, durante 1h a 25oC. Luego de lavar 12 nuevamente la membrana, se realizó la detección con el sistema ECL Western Blotting Analysis System (Amersham, Reino Unido), sensibilizando un filme CP-G PLUS (AGFA, Bélgica) en un casete de autorradiografía FBXC 810 (FisherBiotech, EEUU). Finalmente se reveló el filme en un procesador automático de filmes autorradiográficos del tipo Hyperprocessor (Amersham, Reino Unido). Para el ensayo con señales en forma de círculos se empleó una cámara del tipo BIO-DOTTM APPARATUS (BioRad, EEUU), en la que se sensibilizó una membrana de nitrocelulosa del tipo antes mencionado con diluciones seriadas de las proteínas DIIIE2J en estado nativo y RCM, así como cantidades equimolares de PD5, PD10 y P64K. Además se aplicaron a la membrana cantidades fijas de los controles virales empleados en el otro formato de Dot-blotting. Después de bloquear la membrana durante 1h a 25oC y lavarla 3 veces como se explicó en 3.11, se incubó durante toda la noche con agitación a 4oC con los LAH α Dng1 y α Dng2, ambos disueltos 1/100 en PBST, conteniendo leche descremada al 5%. Posteriormente se lavó la membrana y se incubó en agitación con un conjugado proteína A-peroxidasa (Sigma, EEUU) a una dilución 1/2000, a 25oC por 1h. Después de lavar la membrana por última vez se realizó la detección siguiendo el mismo procedimiento expuesto en 3.11. Ensayos inmunoenzimáticos en fase sólida (ELISA) 1.1.1 ELISA indirecto Se utilizaron placas de 96 pozos (Costar, catálogo 3590 High Binding, EEUU), que se recubrieron con las proteínas DIIIE2J, PD5, PD10, PD18, P64K y BSA a una concentración de 10 µg/mL en un volumen de 0.05 mL/pozo en tampón 0.015 M Na2CO3, 0.028 M NaHCO3, pH 9.6, por 1 h a 37oC. Luego se bloquearon durante 1 h a 37°C utilizando 0.1 mL/pozo de una solución de BSA al 1% en el mismo tampón del recubrimiento. Después del bloqueo, las placas se lavaron tres veces con una solución de PBST. Posteriormente, se incubaron durante toda la noche a 4oC con las diluciones de los diferentes sueros humanos y los LAH α Dng 2 y α Dng1, todos diluidos en PBST, conteniendo 1% (p/v) de BSA. Luego de lavar nuevamente, se procedió a la detección de los anticuerpos unidos al antígeno de recubrimiento, utilizando un conjugado anti IgG de humano-fosfatasa (Sigma, EEUU) para el sistema humano y anti IgG de ratón-peroxidasa (Amersham, Reino unido) para el sistema 13 murino. Ambos conjugados se emplearon en una dilución 1/8000, 50 µL/pozo y se incubaron 1 h a 25oC. Seguidamente se realizaron los últimos lavados y se reveló con 50 µL/pozo del sustrato 4nitrofenilfosfato (Boehringer Mannheim, Gmbh) en solución tampón 0.05 M de bicarbonato de sodio y 0.01 M de cloruro de magnesio, pH 9.6 para los sueros humanos y con el reactivo cromógeno o-fenildiamina (Sigma, EUA) en solución tampón 0.1 M citrato de sodio, pH 5.0 con H2O2 al 0.1% para los LAH. A los 30 min se detuvo la reacción con 0.02 mL de 1 M NaOH por pozo en el caso de los sueros humanos y 2.5 M H2SO4 en el de los LAH. Finalmente se determinó la densidad óptica (D.O) a 405 nm y 495 nm respectivamente en un lector de placas Sensident (Merck, Alemania). ELISA de captura de virus. Las placas de 96 pozos antes mencionadas se recubrieron con 50 µL/pozo de la fracción γglobulina de un suero humano de alto título antiviral a una concentración de 5 µg/ml, en tampón carbonato-bicarbonato durante 1 h a 37oC. Los sitios libres se bloquearon con leche descremada al 5% en PBST por 1 h a 37oC. Luego se lavaron las placas y se incubaron con las preparaciones virales de Dng1, Dng2 y el control negativo en una dilución 1/100 en PBST durante toda la noche a 4°C. Las placas se lavaron nuevamente y se incubaron con los LAH durante 2 h a 37oC. Las diluciones empleadas de cada LAH fueron 1/2000 para los pozos con el virus homólogo y 1/1000 para el virus heterólogo. Los pasos posteriores se llevaron a cabo siguiendo el mismo procedimiento descrito para los LAH en 3.13.1. Ensayo de unión a células. Las células BHK-21 se incubaron durante 1h a 4°C con diferentes diluciones de las proteínas DIIIE2J biotinilada y BSA biotinilada como control negativo, en la solución tampón 10 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1% SFB en PBS pH 7. Posteriormente se lavaron las células en la misma solución tampón por centrifugación a 800 g durante 5 min. Luego se incubaron con un conjugado estreptavidina-fluoresceína (Amersham, EEUU) a una dilución 1/500 durante 1 h a 4°C. Seguidamente se lavaron las células de la misma forma antes descrita y se resuspendieron en 2 mL de PBS para ser analizadas en un citómetro de flujo (Partec Pas-III, Gmbh) a una longitud de onda de exitación y emisión de 532 y 520 nm respectivamente. El 14 análisis de los resultados se realizó empleando el programa computacional WinMDI2.8 (J. Trotter 1993-1998; trotter@scripps.edu). 15 RESULTADOS La proteína DIIIE2J se obtuvo mediante la clonación en E.coli del fragmento del gen que codifica para los residuos Met289 a Gly400 de la proteína E del virus Dng2 (Cepa Jamaica 1409, AC M15075). En el anexo 4 se resume de forma esquemática el proceso de expresión y purificación desarrollado anteriormente en el laboratorio para la obtención de preparaciones purificadas de esta proteína. En las condiciones de expresión establecidas, DIIIE2J se obtiene en la fracción insoluble del lisado celular. Después de su solubilización empleando 4 M de GnHCl, la proteína se somete a un proceso de renaturalización por dilución para propiciar la correcta formación del puente disulfuro entre sus dos residuos de Cys. La purificación se realiza en columna de afinidad con iones metálicos inmovilizados (Ni-NTA, Qiagen, Alemania) equilibrada en tampón PBS pH 7.4, 20 mM Imidazol, 0.3 M NaCl. La fracción de proteína que eluye al aplicar a la columna un tampón similar pero conteniendo 100 mM Imidazol constituye la preparación purificada que empleamos en nuestro trabajo. 1.2 Caracterización físico-química de DIIIE2J Las preparaciones de DIIIE2J utilizadas en los ensayos muestran una banda mayoritaria en SDS-PAGE que migra con una masa aparente correspondiente con la masa esperada para la proteína, siendo evidente el alto grado de pureza alcanzado con el proceso de purificación establecido (Figura 1). En esta misma figura se aprecia que las bandas correspondientes a DIIIE2J aplicada en condiciones reductoras (carril 2) y la proteína RCM (carril electroforética 3) muestran ligeramente una menor migración que en condiciones no reductoras (Carril 1). Este fenómeno se observa con bastante frecuencia al realizar la comparación de especies reducidas y 16 no reducidas de proteínas que incluyen entre sus principales elementos estructurales puentes disulfuro. Esto puede estar dado por el hecho de que la presencia del puente disulfuro confiere a estas proteínas una estructura más compacta que la variante reducida y por consiguiente experimentan una mayor migración en el gel. El análisis de la pureza de las preparaciones de DIIIE2J mediante SDS-PAGE excluye la presencia de contaminantes de peso molecular diferente a DIIIE2J, pero no discrimina entre esta proteína y otros contaminantes de peso molecular similar. Con este fin se realizó un análisis en RP-HPLC. Esta técnica cromatográfica permite la separación de las proteínas basándose en sus diferencias en hidrofobicidad. Para proteínas de masa molecular similar a DIIIE2J esta técnica permite obtener una alta resolución que puede llegar a la separación de especies de la propia proteína que presentan diferentes modificaciones como por ejemplo la pérdida de un aminoácido en uno de sus extremos o la oxidación de un residuo de Met (Moya y cols. 2002). Alícuotas de DIIIE2J sin modificar y RCM se analizaron en una columna de fase reversa C4. En ambos cromatogramas se obtuvo un único pico confirmando el elevado grado de homogeneidad de estas preparaciones (Figura 2). Los picos de DIIIE2J nativa y RCM colectados por RP-HPLC se analizaron por espectrometría de masas con el objetivo de obtener la masa molecular de la proteína con una mayor exactitud y verificar la formación del puente disulfuro. En la figura 3A se muestra la secuencia aminoacídica de DIIIE2J, obtenida a partir de la secuencia del gen clonado y se señalan los 2 17 residuos de Cys que deben estar formando entre sí el único puente disulfuro de la proteína. Además, se representa la cola de 6 His que presenta la misma fusionada al C-terminal. B A MAMDKLQLKG MSYSMCTGKF KIVKEIAETQ HGTIVIRVQY EGDGSPCKIP Masa promedio 1 Met : 13644.87 Da FEIMDLEKRH VLGRLITVNP IVTEKDSPVN IEAEPPFGDS YIIIGVEPGQ Masa promedio Ala 2: 13513.68 Da LKLNWFKKGS SIGLEHHHHH H Masa promedio RCM: 13629.8 Da C DIIIE2J nativo 13515.00 13515.00 Intensidad relativa (%) DIIIE2J +DTT +IAA DIIIE2J + IAA 13555.00 13631.00 13571.00 13671.00 13514.00 12586.00 12000 12000 13000 13000 14000 14000 12000 12000 13000 1300014000 14000 12000 13000 13687.00 14000 masa (Da) Figura 10 3 . Determinación de la masa molecular y la formación del puente disulfuro de DIIIE2J por espectrometría de masas. A) Secuencia aminoacídica obtenida a partir de la secuencia del segmento de ADN clonado. B) Masa promedio esperada a partir de la secuencia aminoacídica de la proteína con la Met N-terminal no procesada (Met1) y procesada (Ala2). RCM: masa promedio 2 esperada de la proteína comenzando en Ala .y con incorporación de IAA en cada residuo de Cys. C) Espectros de masa deconvolucionados de DIIIE2J. Nativo: proteína no modificada colectada por RPHPLC. +IAA: proteína incubada 30 min a 25°C con IAA +DTT +IAA: proteína incubada 2h a 37°C con DTT y posteriormente con IAA a 25°C por 30 min. Como se puede apreciar en la figura 10C la especie mayoritaria de la preparación de DIIIE2J posee una masa molecular de 13515.00 Da, este valor se diferencia en 1.32 Da de la masa promedio esperada para la proteína comenzando en la Ala 2 (Figura 3B), lo que indica que DIIIE2J posee la Met N-terminal homogéneamente procesada. Este resultado concuerda con las evidencias obtenidas por Hirel y cols. en 1989, que indican que en E. coli la presencia de Ala en la segunda posición permite el procesamiento enzimático de la Met N-terminal con gran eficiencia. Para evidenciar la presencia del puente disulfuro, una alícuota de la proteína purificada por RPHPLC se separó en 2 fracciones de igual volumen, y se sometió a la alquilación con IAA posterior a su reducción empleando DTT y sin haber recibido el tratamiento con este agente reductor. La IAA es un agente alquilante que reacciona con gran eficiencia con los grupos sulfihidrilos libres de los residuos de Cys de las proteínas, en condiciones de pH básico. En nuestro experimento, si el puente disulfuro de la proteína no está formado la incubación con 18 IAA sin previo tratamiento con DTT debe dar lugar a una masa correspondiente a la proteína RCM (13629.8 Da), por la incorporación de 2 moléculas de IAA por molécula de DIIIE2J. Al analizar ambas preparaciones por espectrometría de masas, se observó que solo en el caso de la alícuota que había sido sometida a las reacciones con DTT y IAA ocurrió la incorporación del agente alquilante, lo que se evidencia por el valor de masa obtenido de 13629.8 Da que se diferencia solo en 1.2 Da del esperado para la proteína RCM. Esto indica entonces que la fracción sometida solo a la reacción de alquilación no posee grupos sulfihidrilos libres evidenciando que las dos Cys presentes se encuentran enlazadas formando el puente disulfuro característico del dominio III Resultados de nuestro laboratorio obtenidos durante el establecimiento de las condiciones de renaturalización y purificación evidencian cierta tendencia de DIIIE2J a formar agregados que se eliminan durante la cromatografía de afinidad con metales inmovilizados (anexo 1). Como se discutió anteriormente, en el contexto de la envoltura viral el dominio III expone solo una parte de su superficie y el resto se encuentra involucrado en interacciones con los dominios restantes. Por esta razón, su expresión como una proteína recombinante conlleva la exposición de regiones que pudieran estar involucradas en la formación de estas especies agregadas. Para comprobar si DIIIE2J se encuentra en forma de monómero, se realizó un análisis por cromatografía de exclusión molecular, empleando las mismas condiciones de pH y fuerza iónica que la solución tampón en que se almacenan y se emplean las preparaciones de la proteína. A 80 19.47 B 5.0 BSA (64 kDa) 4.8 Masa molecular calculada: 13.2 KDa 40 20 log PM Abs 226 nm (mV) 60 SK (47 kDa) 4.5 4.3 Lact (14.4 kDa) CitC (12.5 kDa) 4.0 Ins (6 kDa) 3.8 3.5 10 0 15 20 25 Tiempo de retencion (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 Tiempo de retención (min) Figura 11. 4 Análisis de DIIIE2J mediante cromatografía de exclusión molecular. (A) Cromatograma obtenido por la aplicación de una alícuota de 100 µg de DIIIE2J en una columna Superdex 75 HR 10/30 equilibrada con tampón PBS pH 7.4 a un flujo de 0.5 mL/min. La columna fue previamente calibrada con varias proteínas de peso molecular conocido y se obtuvo la curva patrón que se muestra en (B). Ins: insulina bovina, CitC: citocromo C, lact: Lactalbúmina., SK: esteptoquinasa recombinante, BSA: albúmina de suero bovino. 19 La figura 4A muestra el cromatograma obtenido en este experimento. En la misma se puede apreciar que la especie mayoritaria de la preparación empleada eluyó con un tiempo de retención de 19.47 min, el que corresponde según la curva patrón empleada (Figura 4B) a una proteína de peso molecular de 13.2 kDa. Este valor concuerda con la masa de DIIIE2J medida por espectrometría de masas (13.5 kDa), lo que significa que la misma se encuentra como un monómero en la preparación empleada en nuestros experimentos. 1.3 Caracterización antigénica DIIIE2J Estudios realizados con anticuerpos monoclonales revelan que gran parte de los epitopos del dominio III de la proteína E son topográficos o sea, dependen del correcto plegamiento del mismo así como de la formación del puente disulfuro entre los dos residuos de Cys (Trirawatanapong y cols. 1992, Roehrig y cols. 1998, 2004). Esto hecho convierte el reconocimiento de DIIIE2J por anticuerpos generados contra el virus en una herramienta de particular importancia para evidenciar la presencia en el dominio III recombinante de elementos estructurales existentes en el contexto de las partículas virales completas. Con este objetivo se realizaron ensayos de Western blotting, Dot blotting y ELISA, empleando anticuerpos policlonales de origen murino y humano. Para el análisis en Western blotting, la proteína purificada se aplicó a un gel de SDS-PAGE al 15% en condiciones reductoras y no reductoras. Después de ser transferida a membrana de nitrocelulosa, se evaluó su reconocimiento por los LAH α Dng2 y α Dng1, así como por un suero humano de alto título, determinado en un ELISA anti-viral (SH0021). Como control negativo en el ensayo se empleó el suero SH0020 caracterizado anterioridad en también nuestro con laboratorio empleando un ELISA α-viral. 20 En todos los casos DIIIE2J mostró reactividad con los anticuerpos excepto con el suero SH0020 (Figura 5). En esta misma figura se aprecia que el LAH α Dng2 detecta una segunda banda con una movilidad consistente con la de un dímero de DIIIE2J (aproximadamente 26 kDa). Sin embargo, esta reactividad solo se evidencia cuando la corrida electroforética se realiza bajo condiciones no reductoras, lo que podría sugerir que en su formación están implicadas interacciones por puentes disulfuro entre dos monómeros de DIIIE2J. El hecho que esta especie dimérica no se haya observado en el análisis por SDS-PAGE sugiere que la misma se encuentra en cantidades muy bajas que no son detectables por el nivel de sensibilidad de la tinción con azul de coomasie. La presencia de la especie dimérica en preparaciones de dominio III recombinante de Dng y otros flavivirus ha sido informada con anterioridad en la literatura (Ludolfs y cols. 2002, Jaiswal y cols. 2004, Chu y cols. 2005) evidenciándose la obtención de esta fracción con distintos niveles de abundancia en los diferentes trabajos publicados. La baja representatividad de los dímeros en nuestra preparación evidencia que el proceso de renaturalización empleado logró favorecer con efectividad la formación de los puentes disulfuro intramoleculares. En el ensayo de Dot blotting las membranas de nitrocelulosa se sensibilizaron con cantidades equimolares de DIIIE2J y BSA. Se emplearon varias diluciones de ambas proteínas y cantidades fijas de los controles de virus y PD5. Luego se evaluó el reconocimiento de estos antígenos por los LAH generados contra el serotipo 2 y el serotipo 1 a una dilución previamente determinada (1/400). Se empleó como control negativo un suero de ratón no inmune a Dng en la misma dilución. Para el estudio con los anticuerpos de origen humano se usaron 5 sueros todos a una dilución predeterminada de 1/200, entre los que se incluyó el SH0020, empleado como control negativo. 21 La figura 6 muestra el reconocimiento de DIIIE2J por ambos LAH y por sueros humanos, observándose que la misma no presenta reactividad con las preparaciones de anticuerpos empleadas como control negativo. En el ensayo que dió lugar a los resultados presentados en la figura 6 se analizó paralelamente una membrana sensibilizada de la misma forma pero empleando una preparación de DIIIE2J RCM y se evaluó el reconocimiento por los mismos sueros. El resultado de este experimento reveló una ausencia de reactividad de DIIIE2J con los sueros (Resultados no mostrados). Este hallazgo constituye un dato de gran interés ya que aun cuando varias evidencias acumuladas en la literatura indican que el puente disulfuro que estabiliza al dominio III juega un papel muy importante en el mantenimiento de los epitopos de anticuerpos monoclonales neutralizantes al virus (Trirawatanapong y cols. 1992, Roehrig y cols. 1998, 2004), no existen datos publicados acerca del impacto del mismo en el reconocimiento de preparaciones policlonales. Resultados publicados por Simmons y cols. (a) en 1998 sugieren que el empleo de una proteína portadora podría resultar de importancia para la estabilidad del plegamiento de las moléculas de dominio III obtenidas por vía recombinante y como consecuencia mejorar su reconocimiento por los anticuerpos generados contra el virus. Sin embargo, estos resultados contrastan con datos obtenidos en estudios de la estabilidad de la estructura en solución empleando dominio III recombinante que indican que el mismo puede recuperar su plegamiento después de la incubación en 4M GnHCl (Yu y cols. 2004). Con el objetivo de obtener confirmación adicional acerca de los efectos de la eliminación del puente disulfuro en el reconocimiento de sueros policlonales al dominio III se realizó un ensayo de Dot blotting comparando el reconocimiento de DIIIE2J sin modificar con la RCM. Para nuestro estudio disponíamos además de la proteína PD5, una variante recombinante que incluye el dominio III del virus Dng 2 fusionado a la proteína P64K. Esta proteína ha sido evaluada como candidato vacunal y es capaz de generar respuesta inmune protectora al reto viral en modelos de infección de ratones y monos (Hermida y cols. 2004 a) lo que evidencia que esta proteína presenta epitopos claves de esta región del virus. En este experimento se sensibilizaron las membranas de nitrocelulosa con cantidades equimolares de las proteínas DIIIE2J nativa y RCM, así como de PD5. Las proteínas P64K y PD10 se emplearon como control negativo y como control de la reactividad del LAH α Dng1 respectivamente. 22 Como se observa en la figura 7 las proteínas DIIIE2J sin modificar y PD5 muestran una reactividad similar con cada uno de los LAH, lo que sugiere que aún sin estar en el contexto de una proteína portadora DIIIE2J se ensambla correctamente y presenta epitopos que son reconocidos por los anticuerpos generados contra partículas virales. Por otro lado, como se había determinado anteriormente, ocurre una pérdida muy significativa del reconocimiento por los sueros empleados a DIIIE2J RCM. Figura 714 Comparación del reconocimiento de las proteínas DIIIE2J y PD5 por los LAH α Dng2 y α Dng1. Las membranas fueron sensibilizadas con cantidades equimolares de los antígenos e incubadas primeramente con los LAH (1/100) y luego con un conjugado proteína A-peroxidasa (1/2000). C+: control positivo de virus, C-: control negativo de virus. Teniendo en cuenta la importancia del reconocimiento de los sueros humanos a la proteína recombinante se decidió ampliar el número de sueros evaluados. Con este fin se empleó un ensayo de ELISA que brinda mayores posibilidades para la comparación cuantitativa de la magnitud de la respuesta. 1.6 Tabla 2. 1 Titulación de los LAH por ELISA de captura de virus contra Dng2 y Dng1 1 LAH Dng 1 Dng 2 1.4 LAH ant i Dng1 1.2 LAH ant i Dng2 1 C- LAH anti Dng1 0.8 C- LAH anti Dng2 0.6 0.4 ∝Dng 1 64 000 8000 ∝Dng 2 2000 16 000 0.2 0 Dilució n del LA H -1 1 Inverso de la dilución del LAH para la que el valor del cociente de la D.O de la reactividad con los virus y la D.O de la reactividad con una preparación negativa de virus es 2 o más. Figura 18 5. Reconocimiento de la proteína DIIIE2J por LAH ∝Dng1 y ∝Dng2 en ELISA indirecto. Las placas recubiertas con la proteína DIIIE2J se bloquearon y luego se incubaron con diluciones seriadas de los LAH. Para la detccion de las Igs unidas se empleo un conjugado antiIgG murino-peroxidasa (1/8000) y se reveló con H2O2/OPD. C- LAH anti Dng 1 y C- LAH anti Dng 2 representan la reactividad de cada LAH con el control negativo (BSA). 23 Los ensayos de ELISA se realizaron recubriendo placas de 96 pozos con las proteínas recombinantes y BSA como control negativo. Las placas recubiertas se incubaron con diluciones seriadas de los distintos sueros y el título se obtuvo como la mayor dilución para la que el cociente de las densidades ópticas (D.O) de la reactividad de DIIIE2J y BSA fue mayor que 2. La figura 815 muestra el reconocimiento en ELISA de DIIIE2J por los LAH αDng2 y αDng1, cuyos títulos contra las preparaciones de cada serotipo viral se muestran en la tabla 2. En cada caso se observa una reactividad diferencial de los anticuerpos con la proteína en comparación con el control negativo, alcanzándose títulos de 1/6400 para el LAH α Dng2 y 1/3200 del LAH α Dng1. Los resultados del ensayo de ELISA indirecto con el panel de sueros humanos se resumen en la tabla 2. En la misma se muestra además el título antiviral de cada suero contra una mezcla de antígenos de los 4 serotipos. DIIIE2J es detectada por los anticuerpos presentes en el suero de 18 personas que fueron infectadas por el virus en diferentes momentos de circulación del mismo en nuestro país y padecieron distintos grados de severidad de la enfermedad, según los datos colectados en la encuesta realizada en el momento de la extracción de la sangre. Tabla 2. ELISA. Reactividad de un panel de sueros humanos con DIIIE2J en Título Suero Título Suero Título Título α-viral -1 α-DIIIE2J-1 α-viral -1 α-DIIIE2J-1 SH001 12800 800 SH0047 6400 400 SH012 6400 400 SH0060 1600 400 SH015 800 400 SH0062 6400 3200 SH0021 5120000 3200 SH0066 6400 800 SH0031 1000 400 SH0067 6400 400 SH0032 1000 400 SH0073 6400 800 SH0037 3200 400 SH0075 12800 400 SH0041 6400000 6400 SH0076 102400 3200 SH0045 6400 1600 SH0079 6400 400 Como se puede observar, no se aprecia una relación entre el título α-virus y la respuesta αdominio III en estos sueros. Tal es el caso del suero SH0021 que presenta un título α-viral en el 24 orden de 1/5120000 y un título α-DIIIE2J de 1/3200 mientras que los sueros SH0062 y SH0076 con títulos α-virus de 1/6400 y 1/102400 presentan el mismo título contra DIIIE2J. Esto pudiera explicarse a partir de los resultados publicados que indican que las moléculas recombinantes que incluyen el dominio III de la proteína E permiten una mayor especificidad en la detección de los anticuerpos generados contra los diferentes serotipos del virus a diferencia de las preparaciones virales empleadas comúnmente en los ensayos de ELISA para la determinación de respuesta αviral (Ludolfs y cols. 2002). También pudieran influir otros factores menos estudiados acerca de la respuesta inmune de las personas infectadas por el virus. Un ejemplo de esto es la prevalencia de los anticuerpos α-dominio III en el tiempo ya que otra diferencia en los sueros evaluados reside en el período transcurrido entre la infección y la toma de la muestra de suero. Estas consideraciones no afectan la respuesta que se buscaba en nuestros experimentos. La reactividad de esta proteína con los sueros de origen humano es de gran relevancia ya que estos anticuerpos son parte de la respuesta inmune del blanco natural del virus, la que participa tanto en el control de la infección en el organismo como en la patogénesis, en los casos que se propicia el fenómeno de ADA. Además, a diferencia de las preparaciones de virus obtenidas en cerebro de ratones neonatos, las partículas virales inoculadas por un mosquito poseen gran homogeneidad y las características antigénicas dadas por su hospedero natural. 9 25 SH001 1 0,9 6 5 0,8 DIIIE2J P D5 P D10 P D18 P 64K B SA 0,7 0,6 0,5 0,4 4 3 2 0,3 0,2 1 0 ,1 0 0 50 10 0 20 0 4 00 8 00 16 0 0 3 20 0 50 6 40 0 100 200 0,45 400 800 1600 3200 6400 Dilució n del suero -1 D ilució n del suero -1 SH002 0,4 3 2.5 0,35 2 0,3 0,25 1.5 0,2 1 0,15 0,1 0.5 0,05 0 0 50 10 0 2 00 4 00 8 00 D ilució n del 16 00 3 20 0 6 40 0 50 100 suero -1 200 400 800 1600 3200 6400 Dilució n del suero -1 SH0012 0,7 3.5 3 0,6 2.5 0,5 0,4 2 0,3 1.5 0,2 1 0,1 0.5 0 0 50 100 2 00 40 0 8 00 Dilució n del 16 00 32 00 6 40 0 50 100 suero -1 200 400 800 Dilució n del suero SH0015 1,6 1600 3200 6400 -1 4 3.5 1,4 1,2 3 1 2.5 0 ,8 2 0 ,6 1.5 0 ,4 1 0 ,2 0.5 0 0 50 100 2 00 4 00 8 00 16 00 32 00 64 00 50 100 D ilució n del suero -1 200 400 800 Dilució n del suero SH0021 1,2 1600 3200 6400 -1 6 5 1 0 ,8 4 0 ,6 3 0 ,4 2 0 ,2 1 0 0 50 100 200 40 0 80 0 Dilució n del suero -1 16 00 32 00 64 0 0 50 100 200 400 800 1600 3200 6400 Dilució n del suero -1 9 . Diferencias en la reactividad de DIIIE2J y las proteínas de fusión a P64K con sueros Figura 16 humanos en ELISA indirecto. La línea discontinua representa el valor de corte para la determinación del título anti DIIIE2J. Rel +/-: cociente de los valores de D.O cada proteína recombinante con su control negativo. Como control negativo para la proteína DIIIE2J se tomó BSA y para las proteínas PD5, PD10 y PD18 se tomó P64K. 26 El ensayo tipo ELISA también se empleó para comparar el reconocimiento por los sueros humanos a DIIIE2J en relación con la respuesta obtenida para las proteínas de fusión a P64K (PD5, PD10 y PD18). Los títulos contra las proteínas de fusión a P64K se obtuvieron tomando a la proteína P64K como control negativo y siguiendo el mismo procedimiento antes explicado. Al analizar los resultados que se muestran en la figura 16 de la variación de la D.O con la dilución se puede observar que la proteína P64K posee niveles considerables de reactividad con los sueros empleados en el ensayo. Este hecho se refleja en la ausencia de títulos contra las proteínas de fusión en la mayoría de estos, según el valor de corte empleado (D.O positivo/ D.O negativo>2) mientras que es posible detectar una reactividad diferencial de DIIIE2J con su control negativo. Este resultado puede considerarse con valor predictivo acerca de lo que puede ser el comportamiento de las proteínas de fusión al ser empleadas como ligandos en la búsqueda de interacciones específicas con el dominio III y evidencia la ventaja de emplear DIIIE2J en este tipo de estudios. 1.4 Caracterización funcional de DIIIE2J El ensayos de unión de DIIIE2J a células de la línea BHK-21 se realizó por incubación de DIIIE2J biotinilada con las células intactas a 4oC con el objetivo de minimizar la internalización. La proteína unida se detectó empleando un conjugado de estreptavidina-peroxidasa y cuantificando el incremento en la fluorescencia de las poblaciones celulares mediante la técnica de citometría de flujo. Para calcular la proporción de células marcadas en cada ensayo se determinaron valores de corte (se ilustra para el ensayo en células BHK-21 en los cuadrantes de la figura 10) que indicaban la posición de más del 99% de las células en las preparaciones empleadas como control en el experimento (control de células no tratadas, control del conjugado) y se determinó el porciento de células cuya intensidad de la fluorescencia superó el valor de corte por incubación con las proteínas biotiniladas. Las células BHK-21 son susceptibles a la infección productiva del virus Dng (Malewicz y Jenkin 1979, Kurane y cols. 1990, Mentor y Kurane 1997, Lin Y. W. 2002). Estas constituyen unos de los sistemas más empleados en los ensayos de neutralización viral por reducción del número de placas (Morens y cols. 1985. DIIIE2J mostró una unión diferencial a la superficie celular (Figuras 10 ), lo que se evidencia con el desplazamiento de las células hacia valores de mayor intensidad de la fluorescencia (FL1) 27 con el incremento de la concentración de proteína, alcanzándose un máximo de 33% del total de eventos registrados. Como no se pudieron ensayar concentraciones de la proteína superiores a 9.6x10-6 mol/L no fue posible determinar la concentración de saturación. 10 4 Control de conjugado 0 4095 10 0 10 0 10 3 BSA 9.6 x 10-6 mol/L FL1 10 2 10 1 10 1 10 1 FL1 10 2 FL1 10 2 10 3 10 3 Control de células 0 4095 10 0 10 4 10 4 A 0 4095 FSC 10 4 FSC DIIIE2J 9.6 x 10-6 mol/L FSC B BSA D IIIE 2 J 10 3 35 10 1 FL1 10 2 células marcadas (%) 30 25 20 15 10 5 D IIIE 2 J BSA 10 0 0 c o ntro l c é lula s 0 4095 c o ntro l c o njuga do 9 .6 x1 0 -6 mo l/L 4 .8 x1 0 -6 m o l/L 2 .4 x1 0 -6 m o l/L FSC 10 Unión de DIIIE2J a la superficie de las células BHK-21 determinada por citometría Figura 18. de flujo. Las células se incubaron 1h a 4˚C con diluciones seriadas de DIIIE2J biotinilada. Luego fueron incubadas con el conjugado estreptavidina-fluoresceína 1/500 durante 1h a 4˚C. Posteriormente se analizaron las muestras en un citómetro de flujo con una longitud de onda de excitación y de emisión de 532 y 520 nm respectivamente A) Intensidad de la fluorescencia de las células en 4 puntos del ensayo. FL1: Intensidad de la fluorescencia, FSC: Parámetro de dispersión directamente proporcional al tamaño de las células. Porciento de células marcadas en cada punto del ensayo. Se tomaron como positivo las células cuya intensidad de la fluorescencia fuese superior a 101. 28 DISCUSIÓN GENERAL El dominio III de la proteína E del virus Dng es un barril ß de aproximadamente 100 aminoácidos que contiene numerosos epitopos topográficos y serotipo-específicos, reconocidos por anticuerpos neutralizantes. Sus características estructurales unidas a numerosas evidencias experimentales indican que el mismo participa en la interacción de la proteína E con los receptores del virus en la superficie de las células. En los trabajos dirigidos a caracterizar la interacción de este dominio con moléculas de la superficie celular se han obtenido valores de Kd aparente de 30µM (Halstead y cols. 2005) mientras que la interacción del virus con sus receptores celulares tiene valores de Kd en el rango entre 98-171 pM (Thaisomboonsuk y cols. 2005). Las diferencias en afinidad sugieren que en esta interacción puede ser importante la disposición del dominio III en el virión maduro presentando múltiples copias alrededor de un eje de simetría lo cual favorece una unión multipuntual. Lo anterior no excluye la posibilidad de que en la interacción con los receptores celulares participen otras regiones de la proteína E que contribuyan a lograr una unión de mayor afinidad. Diferentes variantes recombinantes del dominio III han sido evaluadas como antígenos para emplear en sistemas de diagnóstico de la infección por dengue (Simmons y cols. 1998b, Ludolfs y cols. 2002, Beasley y cols. 2004, Holbrook y cols. 2004), como candidatos vacunales (Simmons y cols. 1998 a, Simmons y cols. 2001, Hermida y cols. 2004 a, b) y en estudios dirigidos a comprender las diferencias entre los flavivirus basados en las particularidades estructurales de sus proteínas(Bhardwaj y cols. 2001, Hung y cols. 2004, Jaiswal y cols. 2004, Chu y cols. 2005). En nuestro grupo se han evaluado con anterioridad las proteínas PD5 y PD2 que contienen el dominio III de la proteína de la envoltura fusionado a diferentes fragmentos de la P64K como ligandos para el aislamiento de los receptores celulares del virus. Como resultado, se aislaron diferentes proteínas como potenciales receptores para el virus. Sin embargo, estos trabajos también evidenciaron que el fragmento correspondiente a la P64K constituye una fuente de interacciones independientes al dominio III lo que contribuye a aumentar la complejidad de los trabajos dirigidos a caracterizar las interacciones del mismo con las proteínas aisladas. La proteína DIIIE2J incluye los residuos correspondientes al dominio III de la proteína E del virus Dng 2, cepa Jamaica 1409. Con anterioridad al presente trabajo se establecieron 29 condiciones para la obtención de una preparación purificada con rendimientos de 60 mg de proteína por litro de cultivo (anexo 1) Estos resultados hacen atractivo el empleo de esta proteína no solo en experimentos de caracterización de la interacción con las proteínas aisladas sino también como ligando en futuros ensayos de cromatografía de afinidad empleando nuevas preparaciones celulares. Para ser empleada con estos fines es necesario obtener la proteína con altos niveles de pureza y con un plegamiento que reproduzca los principales elementos estructurales de esa región en la partícula viral. Los análisis realizados por electroforesis en SDS-PAGE (Figura 1) y RP-HPLC (Figura 2) indican que las preparaciones obtenidas como resultado del proceso de purificación de DIIIE2J presentan un alto grado de pureza y homogeneidad. El análisis por espectrometría de masas nos permitió además confirmar la formación del puente disulfuro característico de este dominio de la proteína E (Figura 3). Los experimentos realizados con LAH y sueros humanos contribuyeron a obtener evidencias de que DIIIE2J contiene epitopos presentes en el virus maduro (Figuras 5-9 y tabla 3). Teniendo que la mayor parte de la respuesta generada contra el virus implica epitopos dependientes de conformación, este resultado además indica que DIIIE2J presenta un plegamiento correcto. Las evidencias obtenidas acerca del gran impacto que tiene la reducción del puente disulfuro para el reconocimiento de la respuesta policlonal generada contra el virus constituyen un elemento adicional a favor del plegamiento de la proteína recombinante (Figura 7). Un tercer requerimiento para la evaluación de proteínas recombinantes como ligandos de cromatografía de afinidad es que retengan la capacidad de interacción con moléculas de la superficie celular. DIIIE2J mostró interacción específica con la superficie de las células BHK-21 (Figuras 11). Este resultado concuerda con resultados publicados en la literatura (Hung y cols 2004). 30 CONCLUSIONES La proteína recombinante DIIIE2J presenta un plegamiento que reproduce características estructurales y funcionales del dominio III de la proteína E de Dng2 por lo que constituye un ligando atractivo para emplear en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores celulares del virus en la superficie de las células. El empleo de DIIIE2J en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores virales debe conducir a resultados de mayor especificidad que la proteína recombinante PD5 y, en el establecimiento de las interacciones del dominio III de la proteína E del virus Dng2. El dominio III de la proteína E forma parte de la región de interacción del virus Dng2 con los receptores celulares en la superficie de las células BHK-21. 31 RECOMENDACIONES Evaluar la capacidad de DIIIE2J de bloquear unión de virus Dng a la superficie de las células blanco así como la infección viral. Evaluar la capacidad neutralizante a los cuatro serotipos virales de los sueros humanos empleados en este trabajo con el objetivo de alcanzar una mayor comprensión de la relación existente entre los resultados de la determinación de los títulos α-virus y α-DIIIE2J obtenidos por ELISA. 32 IMPACTO CIENTÍFICO TÉCNICO En este trabajo se realiza la caracterización de la primera proteína recombinante obtenida en Cuba, que posee los aminoácidos correspondientes al Dominio III de la proteína de la Envoltura del complejo viral Dengue, sin necesidad de alguna proteína portadora. Los resultados de este estudio han arrojado que la proteína recombinante DIIIE2J reune las principales características fisico-químicas, antigénicas y funcionales para ser empleada como ligando en experimentos de cromatografía de afinidad, con el objetivo de aislar los posibles receptores celulares del complejo viral Dengue en las células susceptibles a su infección. Lo que facilitaría la identificación de estos receptores. La identificación de los receptores del complejo viral Dengue en las células hospederas posee una vital importancia en el diseño y obtención de drogas antivirales que impidan la unión y entrada de las partículas virales a las células. La proteína caracterizada puede ser empleada como control en experimentos inmunoenzimáticos, tales como ELISA, Western Blotting y Dot Blotting, debido a su elevada reactividad y especificidad con anticuepos generados contra el Dominio III de la proteína viral del serotipo 2. El empleo de DIIIE2J en ensayos de aislamiento y caracterización de los receptores virales, así como en estudios inmunoenzimáticos debe conducir a resultados de mayor especificidad que la proteína recombinante PD5. En este estudio se emplearon medios y técnicas sofisticadas, de un elevado poder de detección (Espectrometría de masas, Cromatografía de líquida de alta resolución, Citometría de Flujo), que garantizaron la seguridad de los resultados. Este estudio generó la salida de una tesis de grado, tiene una publicación en prensa y será parte de una patente. 33 ANÁLISIS SOCIOECONOMICO • Con la realización de este estudio se obtiene un importante impacto para el tratamiento del dengue clásico o la fiebre hemorrágica del dengue, pues constituye un paso muy importante para el diseño y obtención de drogas antivirales efectivas contra este complejo viral que afecta a numerosos países tropicales, incluyendo a Cuba. • Como resultado de este trabajo se sentaron las bases para la obtención y caracterización en nuestro propio laboratorio de las proteínas homólogas a DIIIE2J en los serotipos 1, 3 y 4. • Con la caracterización de DIIIE2J se evita obtener procedentes del extranjero diferentes proteínas recombinantes para ser empleadas en la búsqueda de receptores celulares del virus dengue. 34 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS • Beasley D.W.C., Holbrook M.R., Travassos Da Rosa A.P., Coffey L., Carrara A.S, Phillippi-Falkenstein K., Bohm R.P.Jr, Ratterree M.S., Lillibridge K.M., Ludwig G.V., Estrada-Franco J., Weaver S.C., Tesh R.B., Shope R.E. and Barrett A.D.T. (2004). Use of a recombinant envelope protein subunit antigen for specific serological diagnosis of West Nile virus infection. J Clin Microbiol. 42: 2759-2765. • Bhardwaj S.,Holbrook M.R., Shope R.E., Barret A.D.T. and Watowich S.J. (2001). Biophysical characterization and vector-specific antagonist activity of domain III of tick-borne flavivirus envelope protein. J.Virol. 75: 4002-4007. • Bielefeldt-Ohmann H. (1998). Analysis of antibody-independent binding of dengue viruses and dengue virus envelope protein to human myelomonocytic cells and B lymphocytes. Virus Res. 57: 63-79. • Brinkworth R.I., Fairlie D.P., Leung D. and Young P.R. (1999). Homology model of the dengue 2 virus NS3 protease: putative interactions with both substrate and NS2B cofactor. J Gen Virol. 80: 1167-1177. • Brooks A.J., Johansson M., Jhon A.V., Xu Y., Jans D.A. and Vasudevan S.G. (2002). The interdomain region of dengue NS5 protein that binds to the viral helicase NS3 contains independently functional importin β1 and importin α/β-recognized nuclear localization signals. J. Biol Chem. 277: 36399-39407. • Chen Y., Maguire T., and Marks R.M. (1996). Demonstration of binding of dengue virus envelope protein to target cells. J. Virol. 70: 8765-8772. • Chu J.J., Rajamanonmani R., Li J., Bhuvanakantham R., Lescar J. and Ng M.L. (2005). Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domain III from the envelope glycoprotein. J. Gen. Virol. 86: 405-412. • Clarke D.H. and Casals J. (1958). Techniques for hemaglutination and hemaglutination inhibition with arthropod-borne viruses. Amer. J. Trop. Med. Hyg. 7: 561-573. • Halstead S.B., Heinz F.X., Barrett A.D. and Roehrig J.T. (2005). Dengue virus: molecular basis of cell entry and pathogenesis, 25-27 June 2003, Vienna, Austria. Vaccine. 23: 849-856. • Hermida L., Rodriguez R., Lazo L., Silva R., Zulueta A., Chinea G., Lopez C., Guzmán M.G. and Guillen G. (2004 a). A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice. J Virol Methods. 115: 41-49. • Hermida L., Rodriguez R., Lazo L., Bernardo L., Silva R., Zulueta A., Lopez C., Martin J., Valdes I., del Rosario D., Guillen G., Guzman M.G. (2004 b). A fragment of the envelope protein from dengue-1 virus, fused in two different sites of the meningococcal P64k protein carrier, induces a functional immune response in mice. Biotechnol Appl Biochem. 239: 107-114. • . 35 • Hirel P.H., Schmitter M.J., Dessen P., Fayat G. and Blanquet S. (1989). Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 86: 8247-8251. • Holbrook M.R., Shope R.E. and Barret A.D.T. (2004). Use of recombinant E protein domain III-based Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for differentiation of Tick-Borne Encephalitis Serocomplex Flaviviruses from Mosquito-Borne Flaviviruses. J.Clin Microbiol. 42: 4101-4110. • . • Hung J.J., Hsieh M.T., Young M.J., Kao C.L., King C.C. and Chang W. (2004). An external loop region of domain III of dengue virus type 2 envelope protein is involved in serotypespecific binding to mosquito but not mammalian cells. J. Virol. 78: 378-388. • Jaiswal S., Khanna N. and Swaminathan S. (2004). High-level expression and one-step purification of recombinant dengue virus type 2 envelope domain III protein in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 33: 80-91. • Kurane I., Kontny U., Janus J. Ennis FA. (1990). Dengue-2 virus infection of human mononuclear cell lines and establishment of persistent infections. Arch Virol. 110: 91-101. • Laemmli, U.K., (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685 • Lin Y.W., Wang K.J., Lei H.Y., Lin Y.S., Yeh T.M., Liu H.S., Liu C.C. and Chen SH. (2002). Virus replication and cytokine production in dengue virus-infected human B lymphocytes. J Virol. 76: 12242-12249. • Ludolfs D., Schilling S., Altenschmidt J. and Schmitz H. (2002). Serological differentiation of infections with dengue virus serotypes 1 to 4 by using recombinant antigens. J Clin Microbiol. 40: 4317-4320. • Malewicz B. and Jenkin H.M. 1979. Cultivation of dengue virus type 2 in baby hamster kidney cells in serum-free medium. Am J Trop Med Hyg. 28: 918-920. • Morens D.M., Halstead S.B., Repik P.M., Putvatana R. and Raybourne N. (1985). Simplified plaque reduction neutralization assay for dengue viruses by semimicro methods in BHK-21 cells: comparison of the BHK suspension test with standard plaque reduction neutralization.J Clin Microbiol. 22: 250-254. • Roehrig J.T., Bolin R.A. and Kelly R.G. (1998). Monoclonal antibody mapping of the envelope glycoprotein of the dengue 2 virus, Jamaica. Virology. 246: 317-328. • Roehrig J.T., Volpe K.E., Squires J., Hunt A.R., Davis B.S. and Chang G.J. (2004). Contribution of disulfide bridging to epitope expression of the dengue type 2 virus envelope glycoprotein. J Virol. 78: 2648-2652. • Simmons M., Nelson W.M., Wu S.J. and Hayes C.G. (1998 a) . Evaluation of the protective efficacy of a recombinant dengue envelope B domain fusion protein against dengue 2 virus infection in mice. Am J Trop Med Hyg. 58: 655-662. • Simmons M., Porter K.R., Escamilla J., Graham R., Watts D.M., Eckels K.H., Hayes C.G. (1998 b). Evaluation of recombinant dengue viral envelope B domain protein antigens for the detection of dengue complex-specific antibodies. Am J Trop Med Hyg. 58: 144-151. • Virol J. 2: 25. 36 • Towbin H., Staehelin T. and Golden J. (1979). Electroforetic transfer of protein from polyacrilamide gel to nitrocellulose sheets procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 4350-4354. • Trirawatanapong T., Chandran B., Putnak R. and Padmanabhan R. (1992). Mapping of a region of dengue virus type-2 glycoprotein required for binding by a neutralizing monoclonal antibody. Gene. 116: 139-150. • Yu S., Wuu A., Basu R., Holbrook M.R., Barret A.D.T. and Lee J.C. (2004). Solution structure and structural dynamics of envelope protein domain III of mosquito- and tick-borne flaviviruses. Biochemistry. 43: 9168-9176. 37 1.5 Anexo # 1. Resumen del proceso de purificación de la proteína DIIIE2J. CULTIVO 3 h 37˚C INDUCCIÓN 0.4M IPTG1 2.5 h 37˚C OBTENCIÓN DE LA BIOMASA Ruptura en prensa francesa SOLUBILIZACIÓN DE LOS CUERPOS DE INCLUSIÓN 4M GnHCl RENATURALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA Dilución de la proteína hasta 0.05 mg/mL 18 h 4˚C CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD EN COLUMNA DE Ni-NTA ELUCIÓN 0.1 M Imidazol. LOTES DE TRABAJO 1- Isopropiltiogalactósido. 38