Fascículo 8

Medios de cultivo para el aislamiento e identificación de
Pseudomonas solanacearum
E. R. French, L. Gutarra y P Aley
La bacteria P. solanacearum E.F. Smith se multiplica bien en sus hospedantes, pero es de crecimiento
más lento in vitro que algunas bacterias patógenas y que muchas saprofitas. Por lo tanto, es difícil
aislarla para quien carezca de experiencia. En cultivo, su tasa de mutación hacia un tipo avirulento
puede ser muy rápida, y solo es práctico mantenerla en agua. Se necesitan medios especializados
para clasificar a P. solanacearum en biovares (Bvs) y variantes fenotípicos del Bv 2
Aquí
se
presentan estos métodos acompañados de la información requerida para utilizar los resultados, más la
gama de hospedantes para establecer su clasificación.
Medio Tetrazolio ( Kelman, 1954): Util para distinguir Pseudomonas solanacearum de otras bacterias
durante su aislamiento, y colonias virulentas (silvestres) de las mutantes avirulentas durante su
purificación.
Solución preparada de CTT: Disolver 1 g de Cloruro de 2,3,5 trifeniltetrazolio (CTT) en 100 ml de agua
destilada, colocar en un frasco a prueba de luz y en autoclave solo por 8 minutos o esterilizar por
filtración. Guardar bajo refrigeración.
Medio basal.
Dextrosa
10 g (ó 2.5 g )`
Peptona
10 g
Casamino acidos (Difco)
1g
Agar
18 g
Agua destilada
1 000 ml
* Reduciendo la cantidad de dextrosa a 2.5 g se obtiene un mejor crecimiento, especialmente para
variantes de papa (biovar 2-A =raza 3). La sacarosa se puede usar como sustituto (E. R. French, no
publicado).
Este medio modificado sin el CTT, es útil para la multiplicación de inóculo libre del pigmento formazán
(el cual es ligeramente bacteriostático).
Preparación para plaqueo: El medio basal puede ser autoclavado y almacenado, luego disuelto cuando
sea necesario. A cada litro de medio disuelto añadir 5 ml de la solución CTT para una concentración
final de 0.005% (se recomienda usar alicuotas de 200 ml por la facilidad de manipuleo, agregando 1
ml de la solución CTT a cada frasco).
Plaqueado y almacenamiento: Vierta aproximadamente 20 ml por placa. Cuando el medio se haya
solidificado, almacene las placas en posición invertida. Guarde de 1 a 2 días antes de usar para
permitir el secado de la superficie (guardarlas más tiempo puede resultar en menor crecimiento de la
bacteria).
Medios con hidratos de carbono para la determinación de biovares (Bv) (Hayward, 1964,
1976): La determinación de Bvs de P. solanacearum está basada en la utilización de los disacáridos
celobiosa, lactosa y maltosa y la oxidación de los alcoholes hexosa dulcitol, manitol y sorbitol. Debido
a que la celobiosa y el dulcitol son los más costosos se puede prescindir de éstos en las pruebas
iniciales de clasificación porque no son esenciales para clasificar los variantes conocidos. Se podrían
usar para una confirmación posterior, especialmente antes de la publicación de los resultados.
•
Medio basal:
Fosfato monobásico de amonio (NH4H2PO4)
1.0 g
Cloruro de potasio (KCI)
0.2 g
Sulfato de magnesio (MgS)47H20)
0.2 g
Peptona
1.0 g
Azul de bromotimol (bromothymol blue)
0.03 g
Agar
3.0 g
Agua destilada
1 000 ml
Ajuste el pH del medio a 7.0 - 7.1 (un color verde oliváceo), agregando gota a gota una solución de
NaOH al 40% p/v. Disuelva el agar al vapor o en baño maría agitando constantemente (otra
posibilidad es pesar el agar para cada frasco y agregarlo antes de distribuir el resto del medio).
Dispense alicuotas de 90 ml en frascos y autoclávelos a 121 °C por 20 minutos.
Prepare soluciones de 10'% de los hidratos de carbono en cantidades de 10 ml. La disolución de los
azúcares puede requerir calentamiento. Los alcoholes hexosa son relativamente estables al calor y
pueden ser autoclavados a 110°C por 20 minutos. Los disacáridos son lábiles al calor y pueden ser
esterilizados por filtracion (0.22 micron Millipore o Seitz) en tubos de prueba o erlenmeyer pequeños
previamente esterilizados, o por Tindalización (calentamiento con vapor a 100°C por 20 minutos por 3
días consecutivos).
AI medio basal derretido y enfriado a alrededor de 60°C, añada la solución de hidrato de carbono.
Agregue 3-4 ml a tubos de prueba previamente esterilizados (150 mm x 10 mm o tamaño similar)
usando una pipeta estéril con tapón de algodón.
Prepare aproximadamente 4 ml de suspensión de inóculo (D.O.=± 0.1) proveniente de un cultivo de 2
días de edad. Con una pipeta estéril agregue 0.1 ml a cada tubo. Use dos repeticiones y un testigo sin
hidrato de carbono. Incube a 30°C y observe después de 3, 7 y 14 días para detectar acidez
(coloración amarilla, de arriba hacia abajo). Los alcoholes toman de 3 a 5 días y los disacáridos
pueden requerir unos días más.
La determinación de Bvs se basa en lo siguiente:
Bv 1 pruebas de utilización y oxidación negativas
Bv 2 utilización y oxidación ambos positivos
Bv 3 utiliza los disacáridos; no oxida los alcoholes
Bv 4 no utiliza los disacáridos; oxida los alcoholes hexosas
Bv 5 utiliza los disacáridos; oxida el manitol pero no el dulcitol o sorbitol (He et al., 1983.
Cuadro 1
Clasificación de Pseudomonas solanacearum en biovares segun utilizacion de r disacaridos y
alcoholes hexosa por acidez cuando es positivo (+).
Biovares
1
2
3
4
5
Celobiosa
+
+
-
+
Lactosa
+
+
-
+
Maltosa
+
+
-
+
Manitol
+
+
+
Sorbitol
+
+
-
Utilización de disacáridos
Oxidación de alcoholes
Dulcitol
Los Bv y razas se relacionan de la siguiente manera: Los Bv 1 , 3 y 4 aislados
de
huéspedes
no
musáceos son raza 1; el Bv 2 es raza 3 (solamente variantes del Bv 2-A de temperaturas frías); Los
aislamientos de huéspedes musáceos que causan la marchitez bacteriana o la "enfermedad del moko"
son raza 2, Bv 1 ó 3 (Buddenhagen y Kelman; 1964); el Bv 5 (aislado de mora) es raza 4 (He et al,
1983). (Tabla 2)
Cuadro 2
Definición de razas de Pseudomonas solanacearum por rango de hospedantes, y biovares
determinados en cada una.
Razas
1
Hospedantes naturales
Biovares
Muchas solanáceas, algunos plátanos diploides,
1, 3 ó 4
numerosos otros cultivos y malezas en muchas familias
2
Plátanos triploides, ciertas heliconias.
1ó3
3
Papa, tomate, y raramente otros hospedantes.
2
4
Mora
5
Medios para diferenciacion de P. solanacearum Bv 2 fenotipos 2-A y 2T (Hayward,1994, Hayward
et al., 1989, 1991). Utilizando el mismo medio basal (90 ml) para la determinación de Bvs, adicione
10 ml de una solución de 10% de D(-) ribosa o de D(+) trealosa para determinar si la oxidación
produce acidez, por lo cual el medio cambia de verde a amarillo. De la misma manera, agregue 10 ml
de una solución de 10% de L(-) triptofano o L(+) tartrato para determinar si son utilizados, en cuyo
caso hay un cambio de color de verde a azul (alcalinización).
Estas pruebas se presentan en el Tabla 3, donde también se muestra las características de
patogenicidad a papa (French et al., 1993; Marin, 1992) y la degradación de pectatos (pruebas
adicionales que pueden ser realizadas).
Cuadro 3
Diferenciación de aislamientos de Pseudomonas solanacearum Biovar 2 en los fenotipos Bv 2-A/raza
3 ("Andino") metabolicamente menos activo y el Bv 2-T (Tropical) metabolicamente mas activo.
Prueba
Bv 2-A
Bv 2-T
Acidez de D(-) ribosa
-
+
Acidez de D(+) trealosa
-
+
Utilizacion de L(-) triptofano
-
+
Utilizacion de L(+) tartrato
-
+
Degradacion de pectato
+
+++
Patogenicidad a papa(25°C)
Alto
Bajo
Agua para mantenimiento Kelman y Person, 1961: Los cultivos se mantienen mejor en su forma
silvestre en agua destilada o deionizada (o potable hervida para la eliminación de cloro) en tubos con
tapa de rosca. Se transfieren 2 ansadas de un compuesto de unas 6 colonias independientes de un
cultivo de 2 días de edad, a unos 5 ml de agua estéril. Las colonias deben provenir de medio basal.
Estas deben ser estriadas en medio tetrazolio cada seis meses y purificados si los mutantes son
numerosos.
Bibliografia
Buddenhagen , I., y A. Kelman. 1964. Biological and physiological aspects of bacterial wilt caused
by Pseudomonas solanacearum. Ann. Rev. Phytopathol. 2:203-230.
French, E.R., P. Aley, E. Torres and U. Nydegger. 1993. Diversity of Pseudomonas solanacearum in
Peru and Brazil. Pages 70-77
in Hartman, G.L. and A.C. Hayward (ed). Bacterial Wilt. Proceedings
of an International Conference Held at Kaohsiung, Taiwan, 28-31 October 1992. ACIAR
Proceedings No. 45 Canberra, Australia.
Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. J. Appl. Bacteriol. 27:265-277.
Hayward, A.C. 1976. Some techniques of importance in the identification of Pseudomonas
solanacearum. In Planning conference and workshop on the ecology and control of bacterial wilt
caused byPseudomonas solanacearum. North Carolina State Univ., Raleigh. p. 137-142.
Hayward, A.C. 1994. Systematics and phylogeny of Pseudomonas solanacearum and related
bacteria. Pages 123-135 in Hayward, A.C. and G.L. Hartman (eds.) Bacterial wilt. The disease
and its causative agent, Pseudomonas solanacearum.
CAB International, Wallingford, U. K.
Hayward, A.C., H.M. EI-Nashaar, L. de Lindo and U. Nydegger. 1989. The use of microtiter plates in
the phenotypic characterization of phytopathogenic Pseudomonas. Proc. 7th. Int. Conf. Plant
Pathog. Bact., Budapest, Hungary. p. 593-598.
Hayward, A.C., L. Sequeira, E.R. French, H. EI-Nashaar and U. Nydegger. 1991. Tropical variant of
Biovar 2 of Pseudomonas solanacearum. Phytopatholagy 82:608 (abstr. ).
He, L.Y., L. Sequeira & A. Kelman. 1983. Characteristics of strains of Pseudomona solanacearum
from China. Plant Disease 67 -.1357-1361.
Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity in Pseudomonas solanacearum to colony
appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 64:693-695.
Kelman, A. and L.H. Person. 1961. Strains of Pseudomonas solanacearum differing in pathogenicity
to tobacco and peanut. Phytopathology 51:158161.
Marin, J. E. 1992. Variación patogénica de Pseudomonas solanacearum E. F. Smith en el Perú.
Tesis Magister Scientiae, Universidad Nacional Agraria La Molina, Lima. 133 p.