Estudio de la variabilidad molecular del virus de la rabia en M xico

CIENCIA VETERINARIA 8-1998
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ESTUDIO DE LA
VARIABILIDADMOLECULAR DEL VIRUS
DE LA RABIA EN MEXICO
ELIZABETH LOZA RUBIO
Centro Nacional de Investigaciones en Microbiología Veterinaria
INIFAP. Carretera México Toluca km 15.5
Col. Palo Alto. CP 05110. México D.F.
email: manban@data.net.mx
ALVARO AGUILAR SETIÉN
Unidad de Inmunología Medica Centro
Medico Nacional Siglo XXI
Cuauhtémoc 330, Col. Doctores.
México D.F. Apto. Postal 70-23 email:
aguilas@data.net.mx
I.
Introducción ..................................................... 52
II.
Taxonomía ........................................................ 55
III.
Propiedades fisicoquímicas ................................ 57
1.La glicoproteína (proteína G) ............................ 57
2.Proteína matriz (M2) ......................................... 58
3.La nucleocápside .............................................. 58
4.La fosfoproteína (Ml) ....................................... 58
5.La proteínaL (transcriptasa) .............................. 59
IV. Variación antigénica y molecular ............................... 60
V.
Tipificación de virus rábico mediante el análisis del
polimorfismo del largo de los fragmentos de
restricción (RFLP), y secuenciación ................... 67
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VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
1. Colección de las muestras ................................ 67
2. Extracción de RN A ......................................... 67
3. Síntesis de DNA complementario
y amplificación por PCR ................................. 68
4. Detección de amplicones .................................. 68
5. Método para el análisis de los amplicones
mediante RFLP ............................................... 68
6. Secuenciación .................................................. 68
VI.
Caracterización antigénica y molecular del virus
de la rabia en México ........................................ 69
VII
Conclusiones ..................................................... 71
Referencias ........................................................ 77
Algunos resultados que se presentan en este capítulo fueron acreedores
al premio a la investigación biomédica "Jorge Rosenkranz" 1997, en el
área de Epidemiología otorgado por el grupo Roche-Syntex.
I. Introducción
Si bien la rabia no ha sido de las mayores epidemias que ha sufrido
el género humano (1), si es una de las enfermedades mas antiguas
y recurrentes que se recuerdan, ya que su conocimiento se remonta
aproximadamente al siglo 23 A.C. (1,2,3,4).
Desde 1885, cuando Pasteur introdujo la vacunación contra la
rabia, se han seguido presentando infinidad de casos de este
padecimiento tanto en humanos como en otras especies domésticas
y silvestres (1). Se trata de una enfermedad infecciosa,
transmisible, de curso agudo y mortal, única por su capacidad para
afectar a todos los mamíferos, ampliamente distribuida en el
mundo, con una letalidad de 100%, clasificada como zoonosis y en
cuya transmisión interviene casi siempre la agresión de
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un animal enfermo (5). La enfermedad se inicia a partir del
momento en el que el vector del virus rábico inocula por mordida
al hospedero susceptible y los mecanismos de defensa
inespecíficos no son capaces de interceptar y anular al virus,
continuando de esta manera su evolución hasta producir la muerte.
Una vez infectado el tejido subyacente, el virus rábico sufre una
primera replicación en el sitio de la herida, durante las primeras
horas, posteriormente avanza por los nervios periféricos hasta
alcanzar el Sistema Nervioso Central y de ahí se disemina por vía
nerviosa a los demás órganos, llegando a las glándulas salivales
(6).
Desde el punto de vista epidemiológico hay dos formas de
presentación de rabia, la urbana que se propaga sobre todo entre los
perros, y la silvestre que se asienta en diferentes especies vectores
de la enfermedad dependiendo de la zona geográfica involucrada.
De esta manera encontramos a los zorros rojos como únicos
vectores en Europa Occidental; a los zorros plateados, zorrillos,
mapaches y coyotes en América del Norte; las mangostas en
algunas islas del Caribe; los chacales en África del Norte etc. (6, 7).
En los países industrializados la rabia de tipo urbano transmitida
al humano por perros está prácticamente eliminada, predominando
la rabia de tipo silvestre (7). Por otro lado, en las regiones
tropicales de América Latina el vector silvestre es el murciélago
hematófago que plantea problemas importantes. Los vampiros
mueren a consecuencia de la rabia aunque la pueden transmitir por
períodos largos de tiempo sin que se observen manifestaciones
clínicas (6). Como estos quirópteros se alimentan exclusivamente
de sangre se han multiplicado en las regiones tropicales donde hay
cría de ganado vacuno, en quienes encuentran su alimento con
facilidad, causando graves perdidas económicas (6, 8). En México
la plaga de este murciélago se extiende a lo largo de la Costa
Occidental desde Sonora hasta Chiapas, y en la Oriental desde el
Sur de Tamaulipas hasta Quintana Roo (9, 10).
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VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
La rabia canina es importante aún en muchos países en vías de
desarrollo del mundo, donde los perros infectados representan la
mayoría de los casos humanos que ocurren cada año (5). La
diseminación natural de la rabia canina depende en gran medida de
la tradición en la relación hombre-perro. Se sabe que el perro se
convierte fácilmente en vagabundo debido a factores
socioeconómicos y a la irresponsabilidad de sus dueños. Los perros
callejeros juegan un papel muy importante en la propagación de la
enfermedad ya que encuentran condiciones ideales en las áreas
urbanas, principalmente las marginales, debido a que su estructura
y densidad se ve favorecida por el correlativo incremento de los
asentamientos humanos (7,11,12).
Cabe aclarar que los verdaderos vectores de la rabia, son
aquellas especies mencionadas que la pueden transmitir de manera
activa por sus hábitos de morder, como los perros y otros
predadores (zorros, mangostas, murcié lagos hematófagos, etc). Sin
embargo, existen una gran variedad de especies susceptibles que
constituyen un fondo de saco epidemiológico, pues si bien estas
son víctimas de la rabia, es poco frecuente que la transmitan en
forma activa a su vez a otros animales de la misma o diferente
especie. Tal es el caso de los rumiantes, equinos domésticos y del
ser humano.
Como sucede en otros países en varias regiones de la República
Mexicana es difícil saber si un bovino o un ser humano ha sido
contagiado por un perro o por un murciélago hematófago, pues
estas regiones son compartidas por perros y vampiros con rabia y
en ocasiones, también por otros vectores como los mapaches,
zorrillos y coyotes. Las estrategias del control de la enfermedad en
esas regiones dependerán del vector involucrado.
Antes del advenimiento de los anticuerpos monoclonales en la
década de los ochentas, era difícil poder distinguir entre sí a
diferentes aislamientos del virus de la rabia. Los anticuerpos
monoclonales
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permitieron por su parte desmontar en forma categórica el antigûo
mito de la unidad antigénica del virus de la rabia, encontrándose
variaciones entre diferentes aislamientos y cepas vacunales. Sin
embargo, el análisis del genoma de estos virus ha sido hoy por hoy
la herramienta más poderosa para su clasificación taxonómica y
para la realización de una epidemiología molecular.
El análisis del genoma de diferentes aislados del virus de la rabia
ha permitido actualmente encontrar marcadores para identificar al
virus proveniente de distintos vectores y virus proveniente de
zonas geográficas divergentes. Estos avances han permitido en
varias partes del mundo un conocimiento mas detallado sobre la
epidemiología de la enfermedad y las cepas involucradas en los
diferentes brotes, mas aún, el análisis del genoma de estos agentes
nos permite saber por comparación, que tan adecuada es la
utilización de una vacuna determinada para proteger contra el virus
involucrado en un brote. En este trabajo se describen los nuevos
conocimientos generados en el estudio del genoma del virus de la
rabia para la identificación de diversos aislamientos y algunos
hallazgos de los primeros estudios hechos en México.
II. Taxonomía
La familia Rhabdoviridae (incluidos en el orden de los
Mononegavirales) al igual que las familias Paramixoviridae y
Flavoviridae son familias que agrupan a virus ARN no
segmentado, de cadena simple y polaridad negativa.
Los rhabdovirus de los mamíferos se dividen en base a sus
diferencias antigénicas y bioquímicas en tres géneros: 1)
Vesiculovirus, con el virus de la estomatitis vesicular como
prototipo, 2) Lyssavirus, con el virus de la rabia como prototipo, y
3) Ephemerovirus que tiene como prototipo al de la fiebre efímera
de los bovinos en Australia (13).
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VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
Con base en su reactividad a anticuerpos monoclonales, los
Lyssavirus se han subdividido en cuatro serotipos, que son:
Serotipo 1.
Rabia c1ásica. Inc1uye la mayor parte de los virus hallados en el
campo y de las cepas de laboratorio de los distintos países.
Serotipo2.
Lagos. Aislado por primera vez de una mezcla de encéfalos de
murciélagos de la República Centroafricana.
Serotipo3.
Mokola. Aislado por primera vez en musaraña de Nigeria,
posteriormente en el hombre, animales salvajes y domésticos de
países africanos.
Serotipo4.
Duvenhage. Aislada por primera vez en un hombre de Sudáfrica,
después en murciélagos de la misma región y Europa Central
(14, 15, 16, 17).
A esta clasificación se han agregado otros virus recientemente
reportados:
EBL 1, Lyssavirus de murciélago europeo tipo 1 que se han
aislado de humano y murciélagos insectívoros Epseticus y
Pipistrellus. EBL 2, Lyssavirus de murciélago europeo tipo 2
aislado de humano y murciélagos insectívoros Myotis (18).
Con base en estudios de secuenciación de los genes de la
nucleocápside (19), actualmente se puede emplear la terminología
de genotipos, o bien sero-genotipos para clasificar a los diferentes
Lyssavirus.
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Cabe mencionar que a la fecha, en el continente Americano, solo
se ha encontrado el sero-genotipo 1 o sea la rabia clásica.
III. Propiedades fisicoquímicas
Como se ha mencionado, el genoma del virus de la rabia es un
ARN con polaridad negativa, de cadena simple, no segmentado,
que contiene aproximadamente 12,000 ribonuc1eótidos (4.6 X 10
Daltons). El genoma se transcribe de la extremidad 3' ala
extremidad 5' en un ARN corto <líder> y en 5 ARN mensajeros
que codifican sucesivamente para las proteínas N, Ml, M2, G y L
(2, 20), las cuales se describen a continuación siguiendo un criterio
estructural:
1. La glicoproteína (proteína G)
Se encuentra localizada en la envoltura viral, es la única que
sobresale de la membrana viral, es el mas importante antígeno
responsable de la inducción de anticuerpos virus neutralizantes que
confieren inmunidad contra una infección letal del virus de la rabia
(21), asimismo de la estimulación de las células T, y se cree que la
neuropatogenicidad del virus rábico se basa en que esta
glicoproteína se liga al receptor celular de acetilcolina (22).
La proteína G tiene cinco sitios antigénicos en la superficie
expuesta, y se acomoda en forma de trímeros en el virión maduro.
La secuencia que codifica para esta proteína ha sido el primer gene
del virus de la rabia que ha sido codificado, la secuencia de
nucleótidos ha sido determinada para tres diferentes cepas: la cepa
ERA, CVS Y PV (21, 23); se determinó un polipéptido de 505
aminoácidos de largo, que contiene dos segmentos típicos
hidrofóbicos, el primero, una secuencia de 19 aminoácidos en su
parte inicial y un segundo segmento de 22 aminoácidos de largo
que se localiza en la parte carboxiterminal. Posee de 65 a 80 Kd en
cantidad de 1600 moléculas por virión (22, 23).
58
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
2. Proteína matriz (M2)
La proteína M2 originalmente descrita como de membrana, en
realidad se encuentra por la cara interna de la membrana, y actúa
como puente de unión entre la parte de las espículas de la
glicoproteína que pasa la membrana, y la nuc1eocápside
constituida por las otras proteínas virales y el ácido nuc1eico. Tiene
un peso molecular de 22 a 25 Kd Y en cantidad de 1650 unidades
por virión (23, 24).
3. La nucleocápside (N)
Es un polipéptido de 450 aminoácidos de largo, helicoidal y
constituida por una serie de tetrámeros con dos moléculas de
proteína M1 y dos de proteína N que se ensartan en el ácido
nucleico como perlas de un collar.
Los sitios combinatorios para monoclonales presentes en el virus
en su nuc1eocápside, se reparten en tres para la proteína N, y uno
para cada proteína M1 Y M2. Posee de 40 a 45 Kd y en cantidad de
1750 moléculas por virión y la M1 de 35 a 40 Kd con 900
moléculas por virión (15).
4.La fosfoproteína (M1)
La proteína M1 en rabia corresponde a la proteína asociada a la
nucleoproteína del virus de la estomatitis vesicular. La
nomenclatura M corresponde a la matriz o posición membranal, se
ha sugerido como alternativa el término NS que implica no
estructural, pero esto es poco preciso; quizá P por fosfoproteína
(phosphoprotein) podría ser un nombre más aceptable, aunque la
nucleoproteína también es fosforilada. Aún no es clara la relación
entre el estado de fosforilación de la proteína M1 y su papel en la
transcripción o replicación (23). Tiene de 35 a 45 Kd con 900
moléculas por virión (21, 24).
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5. La proteína L (transcriptasa)
La pequeña cantidad de proteína L que contiene el virión, se
encuentra combinada con unas moléculas de M1 para formar la
polimerasa viral y no contribuye a la antigenicidad viral de manera
significativa, sin embargo, la cantidad de proteína L que contiene el
virión, se relaciona con la patogenicidad; mientras mayor número
de copias contiene, mas patógeno es el virus (15, 25). Asimismo es
la responsable de muchas propiedades enzimáticas, implicadas en
la transcripción y replicación de los virus, tales como la
poliadenilación y la captura del RNA mensajero (23). Tiene un
peso molecular de 190 Kd constituye la proteína menor en el virión
con 17 a 150 moléculas por virión. Contiene de 15 a 25% de
lípidos como parte constitutiva del virión, pero dado que los lípidos
son derivados de la célula huésped sin modificación, es la célula la
que dicta la composición de los mismos. Contiene además 3% de
carbohidratos, los cuales se encuentran tanto en las glicoproteínas,
como en el ácido nucleico.
Las propiedades fisicoquímicas del virión son: peso molecular
1000 millones de daltones, velocidad de sedimentación 1000 S,
densidad en CsCl de 1.19 a 1.20 g/ml y en sacarosa de 1.17 a 1.19.
La infectividad viral es estable a pH entre 5 a 10 e inestable a pH 3.
Se inactiva rápidamente a 56° C, con la luz ultravioleta, rayos X,
éter, cloroformo, detergentes, así como con hipoclorito de sodio.
Las dimensiones del virus son de 80 nm de diámetro por 150 nm
de largo con las glicoproteínas G sobresaliendo de la envoltura. Las
partíc ulas defectuosas representan la delección derivada de virus
con genoma completo, poseen varios tamaños de RNA y son de
menor longitud que la normal, debido a que contienen menor
cantidad de ácido nucleico que los virus infecciosos. Son
comúnmente obtenidas por pases seriados y son propensas más a
interferencia homotípica que a heterotípica (15).
60
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
La nucleocápside viral se encuentra inmediatamente por debajo
de la membrana, es helicoidal, y deja un agujero axial en el centro
de la partícula, que la recorre más o menos hasta la mitad. Una
revisión más extensa acerca de la estructura del virus de la rabia se
encuentra en Montaño & Mata, 1996 (24).
IV. Variación antigénica y molecular
Durante la evolución, las secuencias genómicas del virus de la
rabia se han visto sometidas a diversas presiones de selección
relacionadas todas ellas, con la subsistencia de su papel respectivo
en el ciclo de replicación viral. De esta manera, el gene que
codifica para la nucleoproteína (N) (antígeno interno) es muy
estable, mientras que aquel que codifica para la glicoproteína «G»
(antígeno externo); que está en contacto directo con el medio
exterior y se ve sometido a las presiones del sistema inmune del
huésped, es muy variable. Por otro lado, el genoma de los
Lyssavirus tiene la característica de poseer una región de un
tamaño considerable (situada entre los genes G y L), que no
codifica ninguna proteína y que podría corresponder a un gene
remanente que durante la evolución de estos microorganismos, ha
perdido funcionalidad (región llamada del pseudogen Ψ, que
correspondería al gen HN de los paramixovirus que codifica para la
hemaglutinina). Esta región del genoma, que no se traduce, resulta
ser muy variable probablemente en razón a su inutilidad actual
(23).
A partir de los años noventa, se ha desarrollado una metodología
de transcripción inversa (ARN-ADN), reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) y secuenciación de la región amplificada, con la
finalidad de estudiar el grado de variación del genoma en diferentes
aislamientos virus de la rabia. De esta manera, se han seleccionado
varios pares de iniciadores (cebadores) específicos, que permiten
analizar las diferentes secciones del genoma viral. Es así que para
poder comparar aislamientos muy divergentes como
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los que corresponderían a sero-genotipos distintos (vg. Rabia
c1ásica, Mokola, Lagos etc.) es preferible utilizar los iniciadores
dirigidos contra las secciones que son muy conservadas en el
genoma (gene que codifica para la proteína N); mientras que al
contrario, si se trata de identificar aislamientos muy próximos entre
sí (vg. pertenecientes al Serotipo 1, rabia c1ásica en diferentes
vectores o zonas geográficas), es preferible utilizar los iniciadores
dirigidos contra las secciones del genoma que son muy variables
(región del pseudogen Ψ) .
De hecho, se han utilizado paneles de anticuerpos monoc1onales
dirigidos contra la nuc1eocápside (26), para diferenciar entre el
virus de la rabia propiamente dicho (sero-genotipo 1) y los otros
virus relacionados (Sero-genotipos 2,3,4,5 y 6), y paneles dirigidos
contra la glicoproteína para distinguir entre diferentes aislados del
sero-genotipo 1 (17, 27).
La noción de las diferencias antigénicas entre cepas de virus de
rabia puede ser de particular importancia en la profilaxis de la
rabia. La mayoría de las vacunas usadas en humanos para la
protección después de la exposición se deriva del virus
originalmente aislado y adaptado a cerebros de conejos por Pasteur
en 1882. Se asume que esta etapa ha tenido protección cruzada con
cepas de campo de rabia en diferentes áreas geográficas para
proteger individuos expuestos. Desafortunadamente, el tratamiento
antirrábico postexposición no es 100% efectivo. Diversas fallas se
han atribuido a baja potencia de la vacuna o tratamiento
inoportuno, ocasionalmente, sin embargo las fallas han ocurrido
aún cuando la vacuna tenga buena potencia y el tratamiento sea
oportuno (28).
Al contrario de los estudios antigénicos, las técnicas de biología
molecular son poderosas herramientas para diversos estudios sobre
el virus rábico (29). El genoma de la cepa PV se ha c1onado y
secuenciado completamente (30) y el virus Mokola, que de acuerdo
a estudios con anticuerpos monoclonales representa el serogenotipo más
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VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
distinto antigénicamente a rabia, se ha clonado completamente y
secuenciado parcialmente (23). La comparación de ambas
secuencias ayuda a determinar la base de la antigenicidad
particular de estos dos virus y demuestran relaciones significativas
entre virus RNA negativos no segmentados (31,32).
Por lo que respecta a la nucleocápside, un gene que codifica para
ella fue insertada dentro del genoma de un baculovirus (Spodoptera
frugiperda). Este producto recombinante posee propiedades nativas
de la NC, ya que se ha probado como reactivo en pruebas de
inmunoprecipitación e inmunofluorescencia; la expresión en el
sistema baculovirus es un sistema seguro, conveniente y barato
(33).
Por razones ya mencionadas, la proteína G es una de las más
estudiadas con este tipo de técnicas moleculares, por ejemplo, se
han sintetizado liposomas a los que se les ha recubierto con
glicoproteínas purificadas, que han demostrado proteger ratones
contra una infección letal de rabia (34). Por otra parte, el gene que
codifica para la proteína G ha sido clonado e insertado en el
sistema baculovirus, y esto ha demostrado que este producto
conserva las cualidades nativas de la glicoproteína y su aplicación
confirió protección a animales de laboratorio induciendo altos
títulos de anticuerpos neutralizantes, esto podría permitir una
vacuna de subunidades a bajo costo (35). Asimismo se ha
determinado la secuencia de aminoácidos de la proteína G, para
construir un péptido sintético capaz de inducir anticuerpos
neutralizantes (36).
Algunas mutantes de cepas fijas de virus rábico (ERA y CVS),
ambas con una sustitución en el aminoácido 333 de la glicoproteína
resultan avirulentas para ratones adultos, esto es cuando la arginina
es reemplazada por glutamina, glicina, isoleucina, así como
metionina, cisteína o serina; por lo tanto la presencia de un
aminoácido cargado positivamente, ya sea arginina o lisina en la
posición 333 de la glicoproteína es necesario para la virulencia
(37).
CIENCIA VETERINARIA 8-1998
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Una comparación de todas las secuencias realizadas, revela que
las cepas fijas de rabia están altamente relacionadas, mostrando
entre 90 y 98% de aminoácidos idénticos. La proteína más variable
es la G, aún así la mayoría de los aminoácidos mutados están
localizados en la zona hidrofóbica, en los segmentos
transmembranales o en el dominio citoplásmico hidrofílico y los
cambios respecto a las características de cada región.
Es curiosos observar que la cepa CVS es claramente distinta de
las cepas PV y la ERA las cuales están muy cercanamente
relacionadas, este factor se hace evidente por la combinación de las
proteínas N, M1, M2 Y G, aunque la PV y el CVS se derivan del
aislamiento realizado por Pasteur, mientras que la cepa ERA se
aisló en los Estados Unidos, una posible explicación para esta
diferencia entre ambas cepas es que el CVS varía de las otras dos
por su particular adaptación a cerebro de ratón (22, 38).
Las regiones intergénicas se definen como las existentes entre la
secuencia de alto 3' de un mensajero y la de inicio 5'. Como ya se
mencionó, 108 genomas RNA negativos no segmentados pueden
dividirse en dos diferentes grupos: uno con intergenes constantes
tales como el virus de la estomatitis vesícula y el virus Sendai que
exhiben el dinucle ótido GA y el trinuc1eótido GAA
respectivamente; y otros como los paramixovirus o el virus de la
rabia, los cuales muestran regiones intergénicas variables (22, 32).
Los intergenes del virus rábico varían en extensión y
composición de nucleótidos. La separación entre la región G y L
tiene una extensión de 423 nucleótidos y es particularmente
considerable.
La existencia de dos secuencias de sus extremos incrementa la
posibilidad de un gene remanente. La presencia de un pseudogene
G-L sugiere que el virus de la rabia representa un estado intermedio
en la evolución de los Rhabdovirus, localizado entre el virus de la
64
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
estomatitis vesicular en el cual el intergene G-L esta próximo al
dinucleótido GA, y el virus de la necrosis hematopoyética el cual
tiene una proteína NV en esa posición. Por la extensión, es
interesante notar que la glicoproteína adicional (hemaglutinina)
producida por la mayoría de los paramixovirus esta codificada en
una región genómica equivalente al intergene G-L (23, 38).
La transcripción del ARN genómico produce secuencialmente,
de la extremidad 3' a la extremidad 5' el ARN patrón y ARN
mensajero monocistrónicos, cubiertos y poliadenilados que
codifican las proteínas N, M1, M2, G y L. Esta transcripción
disminuye de 3' a 5', de tal manera que el ARNm que codifica la
proteína N es el más abundante en el encéfalo y los cultivos
celulares infectados. Además la comparación de las secuencias
nucleotídicas de un virus de serotipo I (PV) con aquellas de un
serotipo 3 (Mokola) muestra claramente que la zona más
conservada del genoma también se sitúa en el gene que codifica la
proteína N. El ARNm N, debido a su gran cantidad y a su
conservación relativa en el seno de los Lyssavirus, es en
consecuencia uno de los principales objetivos de las técnicas de
detección de ácidos nuc1eicos aplicados al diagnóstico. La
c1onación y la secuenciación previas de varios miembros del
género Lyssavirus permiten ahora el desarrollo de estas técnicas.
Estos métodos de diagnóstico actualmente están en evaluación y
sin duda serán aplicados de manera rutinaria en un futuro próximo.
La detección de los ácidos nuc1eicos virales puede ser:
a) directa, por simple hibridación molecular con los ácidos
nuc1eicos complementarios a la zona investigada, o
b) indirecta después de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
Técnicamente se depositan en un filtro los ácidos nuc1eicos
amplificados o no extraídos de un tejido biológico sospechoso, y se
hibridan a la sonda complementaria.
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EI sistema de revelación puede ser por autorradiografía, si la
sonda se compone de nucleótidos radioactivos o de tipo enzimático
(sonda fría). La obtención de una señal durante la etapa de
revelación señala la presencia de ácidos nucleicos virales
compleme ntarios a la secuencia utilizada como sonda.
La calidad de la toma reviste de primordial importancia para la
ejecución de las técnicas de detección de ácidos nucleicos. En
efecto, algunas de estas técnicas y en particular PCR tienen una
sensibilidad tal que la menor contaminación puede ser revelada
(39). Por lo que se refiere a esta técnica el término reacción en
cadena de la polimerasa se aplica al proceso bioquímico in vitro,
mediante el cual las cadenas individuales de ADN blanco son
duplicadas por la ADN polimerasa en cada uno de los ciclos
(generalmente entre 20 y 30) que integran la reacción, al final de
cada uno de los cuales las nuevas cadenas vuelven a ser duplicadas
por la misma enzima, lográndose una producción exponencial de
millones de copias del gen o segmento de ADN específico
sometido al proceso.
En general, los componentes requeridos para el PCR son:
ADN, iniciadores (oligonucleótidos) específicos que flanquean el
gene o segmento que actúa como blanco para la amplificación,
mezcla de desoxinucleótidos (dNTP's), solución amortiguadora de
reacción, y ADN polimerasa (40, 41).
La PCR podría ser empleada como una herramienta fina para
confirmar otras técnicas de referencia, ya que actualmente esta
prueba requiere de al menos dos días, debido a que la hibridación
se lleva a cabo durante toda la noche, posteriormente se realiza el
revelado inmunoenzimático con sondas marcadas con
digoxigenina. Varias formas de reducir el tiempo de ejecución se
están investigando en diferentes laboratorios (41). Por 1o que
respecta a costo, la PCR se
66
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
encuentra en una posición competitiva, aunque esto mejoraría sí el
precio de la Taq polimerasa llegase a bajar.
Un aspecto de suma importancia para la PCR, es el diagnóstico
ante mortem durante ensayos clínicos, o bien durante la cuarentena
de animales que han mordido o han sido agredidos, ya que en estos
casos técnicas como fluorescencia o inhibición de focos
fluorescentes ofrecen resultados poco consistentes (29, 42).
Además, se han realizado ya algunos trabajos en los diferentes
continentes acerca de la variación molecular. En Sudáfrica se han
determinado las relaciones filogenéticas entre los virus de rabia
aislados de huéspedes canídeos (chacales, zorros y perros), factores
geográficos también se tomaron en cuenta, para ello se utilizaron
tres regiones del genoma, siendo éstos, el dominio citoplásmico del
gene G, el pseudogene intergénico G-L y el dominio antigénico II
del gene N. Se detectaron diferencias entre huéspedes vivérridos
(mangostas) y los canídeos (43,44).
Estudios similares se llevaron a cabo además de las especies
anteriores en zorros; el virus de las mangostas es filogenéticamente
lejano de las cepas de rabia que contienen las vacunas que usan en
Europa (45, 46, 47).
La rabia en Canadá persiste principalmente en dos especies: el
zorro rojo y el zorrillo. Estudios previos realizados con anticuerpos
monoclonales fallaron en identificar diferencias específicas entre
huéspedes, pero ciertas observaciones sugieren la existencia de
más de un tipo viral, por 1o que estas muestras se volvieron a
estudiar, y se confirmó que no hubo variación entre huéspedes en
la posición N del genoma viral, sin embargo existieron diferencias
consistentes del virus proveniente de diferentes regiones
geográficas (48). Más tarde, realizaron el
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estudio de un brote en la región de Ontario, y se demostró que dos
de cuatro variantes que habían sido previamente identificadas en
otra región, se presentaban ahora también en Ontario (49).
V. Tipificación de virus rábico, mediante el análisis
del polimorfismo del largo de los fragmentos
de restricción (RFLP), y secuenciación
El RFLP es un método muy moderno, en el que usando una batería
de cuatro enzimas de restricción, es posible discernir entre los dos
ciclos epidemiológicos de la rabia (50,51). Esta metodología se
combina con la PCR, la cual se revela también como una
herramienta muy fina, capaz de discriminar en el seno de las cepas
de Lyssavirus, contrariamente a la aplicación diagnóstica expuesta
anteriormente.
También
permiten
completar
estudios
epidemiológicos ya desarrollados con anticuerpos monoclona les.
Con este objeto se escoge amplificar la zona del pseudogen Ψ (29)
que es una zona no codificante del genoma rábico altamente
variable(31).
El protocolo general incluye a grandes rasgos, 1o siguiente:
1. Colección de las muestras
Se obtiene un fragmento de encéfalo en un tubo de plástico, los
cuales pueden almacenarse a –70° C. En muchos laboratorios, el
virus es pasado a cerebro de ratón o a cultivos celulares, los cuales
también pueden ser empleados. Se ha demostrado que los
resultados de las secuencias del fragmento amplificado no
cambian, a menos que se le den más de 20 pases (42).
2. Extracción de RNA
El RNA se extrae usando el método de fenol-cloroformo (52).
Después de precipitar y lavar, el RNA se suspende en agua
pirolizada.
68
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
3. Síntesis de DNA complementario y amplificación por PCR
El ADN complementario se produce mediante el empleo de la
enzima transcriptasa reversa, con el propósito de hacer una cadena
complementaria al ARN obtenido. Asimismo, la PCR se lleva a
cabo para obtener múltiples copias de la región del pseudogen Ψ,
que en este caso es el fragmento que se quiere amplificar (53).
4. Detección de amplicones
Los productos amplificados pueden ser visualizados directamente en
un gel de agarosa al l% en buffer TAE, que contenga bromuro de etidio,
empleando luz ultravioleta (312 nm) (42).
5. Método para el análisis de los amplicones, mediante RFLP
Para la tipificación de los virus, se toma cada uno de los
fragmentos amplificados y se digieren con un panel de enzimas de
restricción, dos que identifican la variante de murciélago
hematófago o vampiro (ciclo aéreo) que son BsaW I y BsrG I
(ambas enzimas señalan una sola mutación con respecto a la
variante de perro). Las endonucIeasas que identifican a esta última
(ciclo terrestre) son, la BamH I Y la Stu I (que muestran una doble
mutación con respecto a las variantes terrestres (54).
Posteriormente se observan en un gel de agarosa al l% en buffer
TAE; de este modo se discrimina entre ciclo aéreo y terrestres
respectivamente, dependiendo el corte de cada una de las enzimas.
6. Secuenciación
Se hacen reacciones cíclicas con taq polimerasa usando el
Omnigene (Hybaid). Los productos de PCR se purifican mediante
columnas de cromo, para posteriormente proceder a secuenciar por
el método enzimático (54).
CIENCIA VETERINARIA 8-1998
69
VI. Caracterización antigénica y
molecular del virus de la rabia en México
En el Centro Nacional de Investigaciones en Microbiología
Veterinaria del INIFAP se realizó un estudio de caracterización
antigénica con un panel reducido de anticuerpos monoclonales
antinucleocápside (que detecta diferencias entre sero/genotipos). Se
analizaron alrededor de 120 aislamientos positivos a rabia
mediante inmunofluorescencia directa determinándose que sólo
circula el serotipo 1, a pesar de haber detectado ligeras diferencias
en el patrón de reactividad de algunas de las muestras (55,56,57);
sin embargo, con el uso de este panel no puede saberse el origen de
la especie agresora.
Por otro lado, también se utiliza la tipificación del virus rábico
empleando RFLP, ya que su uso de rutina provee indicios
potenciales para el origen de las epizootias, puesto que la utilidad
de un análisis molecular en investigaciones epidemiológicas
depende de la capacidad y disponibilidad de un método efectivo
para diferenciar entre variantes del virus.
Usando RFLP se han analizado varias muestras positivas a rabia
por inmunofluorescencia directa, provenientes de diversas especies
y regiones geográficas (Figura 1). En estos 60 aislamientos, se
obtuvieron inesperadamente tres patrones de digestión (Cuadro 1).
El primer patrón 1o presentaron las muestras que corresponden a la
variante vampiro (virus de ciclo aéreo). El segundo patrón 1o
presentaron las muestras que pertenecieron ala variante perro (ciclo
terrestre), y en forma inesperada, se detectó un tercer patrón en
cinco muestras en donde ninguna enzima tuvo efecto y que
correspondían a cuatro zorrillos y un bovino del Noroeste y Centro
del país, a estas muestras se les denominó hipervariables (51).
Después de haber secuenciado al menos 192 nucleótidos del
ectodominio de la proteína G, pudo obtenerse un árbol filogenético
70
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
mediante el programa TREETOOL (Figura 2) (58). En este árbol se
observa 1o siguiente: con respecto al ciclo terrestre (variante perro)
se aprecia que existen 2 subvariantes: México I que esta diseminada
en todo el territorio mexicano, en varias áreas como en los estados
de Durango, Chihuahua (muestras 36-39), y Puebla (muestra 51);
parece ser que se ha diseminado ocasionalmente a coyotes, 1o cual
puede representar localmente un vector para la transmisión de la
enfermedad para animales domésticos. La subvariante México II se
restringe al Centro del país y Estado de México, sobreponiéndose a
la México I. Además se ha demostrado la presencia de variantes en
la fauna silvestre mexicana, que son: México III representada por
zorros y linces de Chihuahua y Sonora. Estas variantes fueron
reconocidas por la RFLP como ciclo terrestre. Sin embargo la
variante IV encontrada en zorrillos y un bovino de Baja California
Sur (muestras 40-43, 52) respectivamente; y la variante México V
también presente en zorrillos del Centro del país (Aguascalientes)
(muestra 55) fueron reconocidas como diferentes a las variantes
tradicionales usando RFLP, obteniéndose el patrón llamado
hipervariable. Cabe mencionar que las variantes de zorrillo que se
presentan en México son genéticamente distintas a las que se
presentan en Estados Unidos en esta misma especie; además se ha
comprobado que presentan características antigénicas y biológicas
diferentes a los ciclos epidemiológicos ya descritos en el país
(terrestre y aéreo) (59).
Por 1o que concierne al ciclo aéreo (variante vampiro) presenta
una homogeneidad genética mucho más marcada que el ciclo
terrestre, a excepción de una muestra de murciélago insectívoro
Tadarida brasilensis mexicana (muestra 59), la cual forma una
rama aparte en el árbol filogenético, pero con RFLP no hubo
ninguna diferencia en el patrón de digestión. Estadísticamente hay
dos subvariantes una que está ampliamente diseminada, y otra que
esta confinada a la región de Tejupilco, Estado de México (58).
Asimismo
CIENCIA VETERINARIA 8-1998
71
es de hacerse notar que la especie más afectada por el ciclo aéreo es la
bovina, 1 o cual causa severas perdidas económicas en la ganadería
nacional (9), y la humana de la cual se ha convertido en la segunda
especie agresora después del perro (60).
VII. Conclusiones
Con los resultados obtenidos se hace patente que en México:
Además de los ciclos ya conocidos (terrestre y aéreo) se describen
por primera vez otros ciclos epidemiológicos que no habían sido
descritos previamente, como 1 o son:
En la variante perro (ciclo terrestre) existen dos subvariantes,
México I diseminada en todo el territorio mexicano y México II,
encontrada en el Centro del país y Estado de México. Así en este
mismo ciclo, pero en la fauna silvestre se encontraron un ciclo que
circula en los zorros y linces (México III), y dos ciclos en zorrillos,
México IV y V, los cuales están presentes en el Noroeste y Centro del
país respectivamente, y que se ha comprobado que afectan a animales
domésticos y humanos. Dado que la variante zorrillo difiere casi un
20% en su genoma de los ciclos ya conocidos, sería recomendable
realizar pruebas de protección cruzada con vacunas comerciales para
saber el nivel de protección que estas ofrecen, pues cabe la posibilidad
de fallas en la vacunación.
En la variante vampiro (ciclo aéreo) se presenta una homogeneidad
más compacta en el genoma del virus de la rabia, con excepción de un
murciélago insectívoro T. brasilensis.
Es de hacerse notar la utilidad de la RFLP, la cual provee de una
manera sencilla un método eficaz para diferenciar entre las variantes
de perro, vampiro y zorrillo, lo cual es importante para llevar a cabo
estudios de epidemiología molecular, sin demasiada, infraestructura.
72
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
Agradecimientos
Los autores agradecen a los Dres. Noel Tordo y Chokri Bahloul
del Instituto Pasteur, Pads Francia, por su generosidad al
brindarnos sin restricciones todos sus conocimientos y técnicas
sobre el estudio del genoma del virus de la rabia.
CIENCIA VETERINARIA 8-1998
75
W.
Fig.
1. Representación esquemática de la procedencia
geográfica y de especies de las diferentes muestras
positivas a rabia.
76
VARIABILIDAD MOLECULAR DEL VIRUS DE LA RABIA
X.
Fig.2. Árbol filogenético obtenido con el programa Treetool,
después de la secuenciación, representando los ciclos
epidemiológicos que existen en México.
CIENCIA VETERINARIA 8·1998
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