Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad Tema 10: Receptores implicados en la respuesta adaptativa: el receptor del linfocito B y del linfocito T. Generación de diversidad - El receptor del Linfocito B Receptor del Linfocito T Receptor α/β Receptor γ/δ Generación de la diversidad del Receptor BCR (Ac) Generación de la diversidad del TCR El receptor del Linfocito B El linfocito B posee muchos receptores idénticos en su membrana, mas de 100.000, que son los encargados de reconocer específicamente al antígeno. Cada linfocito B tiene una especificidad diferente, es decir sus receptores son diferentes a los existentes en el resto de las células B. Estos receptores son inmunoglobulinas que tras su síntesis, quedan ancladas a la membrana, con una región transmembrana y un tallo citoplasmático corto. Tras su activación, las células B ase activan, proliferan y se convierten en plasmocitos o células productoras de anticuerpos. Estos anticuerpos son copias exactas del receptor pero sin la región transmembrana ni citoplasmatica, por lo que tras su síntesis, no pueden anclarse a la membrana y se secretan al exterior como moléculas solubles. Debido a la cortedad de la región intracitoplasmática, no se produce el estímulo necesario (Transducción) para que lleguen las señales al núcleo aún cuando un antígeno entra en contacto con el receptor (inmunoglobulina) de superficie1. Por ello es necesario la cooperación de otras dos moléculas, que son las que verdaderamente transducen la señal al núcleo, al tener la región intracitoplasmática mas larga. Estas moléculas, pertenecientes a la familia de las inmunoglobulinas se denominan Igα e Igβ, y están asociadas, no covalentemente a las Ig de superficie en los linfocitos B maduros. De esta forma ambas junto al receptor del antígeno forman el denominado Complejo receptor para el antígeno del linfocito B. Así pues resumiendo, el receptor del Linfocito B, consta de una inmunoglobulina del tipo IgM e IgD unidas a su superficie, que son las encargadas de reconocer al antígeno, y unas moléculas accesorias Igα e Igβ, 1 Es necesario que se unan dos o más moléculas para que se produzca el entrecruzamiento de las Inmunoglobulinas. 430945431.doc 14/11/2015 Página 1 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad encargadas de trasmitir la correspondiente señal al interior celular. Receptor del Linfocito T Tal y como sucede con los linfocitos B, en el caso de los linfocitos T, también existen unos receptores específicos que les permiten el reconocimiento y reacción con las moléculas antigénicas. De este modo la función que cumplen los receptores, BCR y TCR respectivamente, de ambas células es la misma, diferenciándose tan sólo en el modo con que lo hacen. El linfocito B efectúa un reconocimiento directo, es decir, reconoce a los antígenos nativos sin modificar. Por el contrario el linfocito T necesita de un procesamiento previo del antígeno, así como que se asocie con otra molécula (CMH) para que pueda ser reconocido, es decir efectúa un reconocimiento indirecto. Receptor αβ Cada célula T presenta del orden de 50.000 receptores idénticos. El receptor, es un heterodimero, formado por dos péptidos denominados α y β de distinto peso molecular, unidos por puentes disulfuro, que conjuntamente configuran el sitio de fijación para el antígeno. Presentan, como las inmunoglobulinas, a cuya superfamilia pertenecen, dos dominios, uno variable, con sus zonas hipervariables (3 CDR en cada cadena) y otro constante (el más próximo a la superficie celular), que lo hacen similar a las cadenas ligeras de las Ig. De hecho, la porción extracelular de dicho heterodimero puede considerarse estructuralmente similar a la porción Fab de una molécula de Ig, y presentando los dominios variables unas estructuras terciarias similares a los dominios V de las Ig. La diferencia mas acusada se presenta a nivel del dominio constante de la cadena α, que no es típica de una dominio de Ig clásica. Asimismo y al igual que ocurre con las Ig, las cadenas α y β presentan una región bisagra. La principal diferencia que presenta con el receptor del linfocito B, es la ya mencionada, en cuanto al reconocimiento indirecto, y la menor afinidad de unión del TCR a los complejos péptido-MHC, en comparación con la Unión del BCR al antígeno. Esto es debido posiblemente a la mayor rigidez del TCR y al propio mecanismo de selección tímica en la que se seleccionan las células T con TCR de baja afinidad. Esta estructura esta anidada a la superficie celular por una región transmembrana formada por aminoacidos hidrofóbicos, cargados positivamente, que se continua por una región citoplasmática muy corta (3 aminoácidos). Al igual que sucedía con el receptor del linfocito B, esta cortedad de la región citoplasmática hace que la señal provocada por la unión del antígeno no pueda llegar al interior celular (transduccion de la señal). Por 430945431.doc 14/11/2015 Página 2 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad ello es necesario, al igual que en los B, la asociación del receptor anterior, a otras moléculas para formar un complejo receptor. En este caso dicho complejo está constituido por cinco proteínas. Por un lado a tres proteínas del grupo de las inmunoglobulinas denominadas γ, δ y ε2, que presentan un solo dominio constante, y por otro a otra proteína, estructuralmente no emparentada con las Ig, denominada ζ zeta, y que constituyen el grupo CD3. Una de las funciones del grupo CD3 es facilitar la expresión en superficie del TCR. Todas estas proteínas accesorias, al contrario del receptor presentan la porción transmembrana cargada negativamente, lo que facilita la interacción con la región citoplasmática del TCR. Esta región cargada negativamente de las proteínas del tipo inmunoglobulina del CD3, permiten la neutralización de cargas con las porciones de las cadenas α y β del receptor, estabilizándose así la estructura. Estos polipeptidos cuentan con regiones ITAM (un solo motivo), por lo que podrían fosforilarse y contribuir a transducir la señal al núcleo. Las otras cadenas no inmunoglobulinicas (ζ zeta y η eta), presentan tres motivas ITAM y son las máximas responsables de transducir la señal al núcleo a través de la tirosin Kinasa. Estas proteínas se encuentran, realmente, rodeando al receptor del linfocito formando un complejo receptor. Así al unirse el antígeno al receptor, este sufre una deformación, que es captada por el complejo proteico circundante, cambiando la estructura del mismo generándose una señal que es transmitida hacia el interior celular produciéndose así la interiorización de la misma. La asociación del receptor TCR con las proteínas que los rodean para formar el complejo receptor se produce, ya, en el retículo endoplasmático, pasando el conjunto al aparato de Golgi, donde se glicosila, siendo posteriormente, el complejo entero transportado a la membrana, transporte que no tiene lugar si el complejo esta incompleto. Parece ser que en ello participa una fosfoproteína “calnexina”, cuya función sería retener al TCR en el retículo endoplásmico hasta el ensamblamiento de todas las moléculas. Receptor γδ Otro tipo de TCR, menos habitual, que se encuentra en una pequeña población de linfocitos T( entre el 5% en sangre y el 15% en los epitelios). Esta compuesto por las cadenas γ y δ, distintas a las que se presentan en el receptor αβ. Son similares estructuralmente a las cadenas α y β, pero mas parecidas a las Ig que estas últimas. Como el anterior esta asociado al CD3. Se encuentran principalmente en el epitelio gastrointestinal, piel y vagina. A diferencia de los αβ, los γδ no recirculan entre 2 Las tres cadenas son entre sí muy homologas, y sus genes están adyacentes en el cromosoma 11 430945431.doc 14/11/2015 Página 3 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad la sangre y los tejidos. Esto es debido a que el reconocimiento del antígeno y por tanto su activación, no se efectúa en los ganglios ni son necesarias CPAs. Su mayor similitud con la estructura de los anticuerpos hace que sean capaces de De esta manera, se ha comprobado que los antígenos que reconocen, no son necesariamente péptidos y que no requieren el procesamiento clásico a través del CMH, siendo capaces de reconocer proteínas intactas del mismo modo que hace el linfocito B. Asimismo, por lo menos, algunas células T reconocen antígenos relacionados con las CMH de clase I (MICA y MICB) que se expresan en la superficie de células estresadas. Asi, las células γδ son capaces de reconocer dos tipos de ligandos: 1.- Moléculas que señalan el estrés celular 2.- Moléculas orgánicas pequeñas que sirven de marcadores de la infección. Estas moléculas pueden ser tanto peptídicas como no peptídicas, secretadas por ciertos microorganismos. Así se ha comprobado que reconocen pirofosfatos, y el monoetilfosfato secretado por micobacterias y algunos eucariotas. Todas estas características, hace que este grupo de células, pertenecientes a la respuesta adaptativa, al menos, compartan algunas de las características de la Respuesta innata. De este modo las características principales de este grupo de linfocitos podría resumirse en los siguientes puntos: 1.- Parecen ser mas primitivos: 2.- Su maduración, se puede producir fuera del timo. 3.- El mecanismo de reconocimiento antigénico es distinto del que tienen los Tαβ. En este aspecto reconocen, aparentemente, estructuras distintas del complejo péptido-CMH. Incluso existen ciertas evidencias de que reconocen al antígeno directamente, sin necesidad de procesamiento previo. 4.- Carecen de unas moléculas de superficie, imprescindibles en los Tαβ. (CD4 y CD8).3 5.- Presentan una diversidad mucho más limitada, por lo que podrían iniciar respuestas inmunitarias frente a un pequeño número de microorganismos comunes. 6.- se encuentran mayoritariamente en piel y mucosas y su número aumenta con las infecciones parasitarias 7.- Son activados por proteínas de choque térmico (Hp60) 4 3 Una línea T específica para la glucoproteína del virus del herpes simple se puede estimular por la proteína intacta, no solo en solución sino adherida a plástico, lo que indica que las células se estimulan por el antígeno nativo al igual que hace el receptor del linfocito B. 4 La proteína de choque térmico hsp-60 de los queratinocitos estresados autólogos y las 430945431.doc 14/11/2015 Página 4 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad 8.- Reconocen una variedad mas amplia de antígenos no peptidicos5 La función de estas células T gamma / delta, no está claramente dilucidada, pero por su ubicación entre el medio externo y el medio interno es posible que representen la primera línea de defensa contra los agentes invasores, lo que también está en correspondencia con la mayor rapidez que tienen para actuar. La mayoría de los antígenos con los cuales interactúan los linfocitos gamma / delta corresponden a agentes invasores pero también lo hacen contra células huéspedes que se encuentren atacadas por patógenos o lesionadas. Las cepas de ratones que no producen células T gamma / delta tienen respuestas más lentas en la reparación de las lesiones de piel, además de ser mucho más propensos al cáncer de piel que los ratones normales por lo que se piensa que una de las funciones que tendrían estos linfocitos sería la vigilancia inmunitaria. Hemos estado hablando de los receptores presentes en los dos tipos de linfocitos y de la gran variabilidad o diversidad que presentan para unirse, potencialmente a cualquier antígeno. Ahora bien la pregunta que se plantea sería la siguiente. ¿Cómo se genera tal diversidad.? Generación de la diversidad de las Inmunoglobulinas La evidencia de la existencia del repertorio linfocitario supone la existencia de mecanismos que permitan a cada linfocito, durante su desarrollo, especializarse para producir un tipo concreto de Ac. Dicha especialización se consigue a través de la organización génica de las Ig. En efecto, en este sentido, si cada cadena ligera y pesada de las inmunoglobulinas fuese codificada por un solo gen, estaría claro que se podría solucionar el problema, ya que cada uno de ellos sería distinto a los demás. Sin embargo, dada la gran cantidad de diversidad existente 1015, si esto fuese así se necesitaría más de la tercera parte del genoma para codificar estas proteínas. Obviamente esto no es así y los linfocitos B han desarrollado mecanismos genéticos más eficaces, capaces de generar el repertorio con un número de genes mucho más limitado. ¿Cuál es este mecanismo? Cada dominio variable esta codificado por más de un gen. Las regiones variables de las cadenas ligeras están codificadas por dos genes denominados V y J., que codifican aproximadamente 97 y 13 aminoácidos micobacterias son activadores potentes de las células T 5 En el caso de las micobacterias se ha identificado como estimulantes a un grupo de moléculas pequeñas, no protéicas y ricas en fosfatos, como el iso-pentenil-pirofosfato, que aparece en células microbianas y de mamíferos, lo que expande aún más la variedad de antígenos no peptídicos que pueden reconocerse por las células T 430945431.doc 14/11/2015 Página 5 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad respectivamente (en el ratón). Estos genes están ligados a cada una de los genes que codifican las cadenas ligeras y pesadas. En el hombre existen 40 copias del gen Vk y 30 del Vλ, y 5 y 4 respectivamente del gen J. De esta forma se pueden generar 320 cadenas ligeras diferentes. En la maduración del ARN, los genes transcritos de los dominios variables se pueden combinar con cualquiera de los dos genes que codifican el dominio constante de las cadenas ligeras para formar las cadenas kappa o lambda respectivamente. El proceso de formación de una cadena ligera λ sería el siguiente: En la línea germinal, es decir en la célula pluripotencial, los cinco genes J están cercanos entre sí y a su vez cerca de los genes que codifican las regiones constantes, y separados a su vez de los genes V. Durante el desarrollo de la célula B, el gen V que se va expresar (al azar), se desplaza para quedar junto al gen J elegido también al azar. El ADN intercalado entre ambos se elimina. En la maduración del ARN, los genes transcritos se combinan con el gen de la cadena λ. Cuando se selecciona, en este ejemplo, la cadena λ para su expresión, se bloquea, por exclusión alélica la expresión de la otra cadena κ. Solo en el caso de que el reordenamiento no sea productivo se produce la expresión de κ. En el caso de que ninguno de los ordenamientos sea productivo, la célula muere. En el caso de las cadenas pesadas, el proceso es básicamente el mismo, con la diferencia de que existe otro minigen denominado D, (del que existen más de 20 alelos), que también interviene en la codificación del dominio variable, con lo que este tendrá una mayor diversidad. Otra diferencia, se refiere a los dominios constantes, que están codificados por 9 genes diferentes que se corresponden con las diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas. De esta manera, como el lugar de fijación al antígeno se forma por la conjunción de las cadenas ligeras y pesadas, el número total de combinaciones posibles sería el producto de ambas: 320 para las cadenas ligeras y 10.530 para las pesadas (en las cadenas pesadas existen en el hombre 65 minigenes Vh, 27 segmentos Dh y 6 segmentos Jh). De esa forma el número total de combinaciones que se pueden formar es de 3,5 *106. Además de este proceso de generación de diversidad existen procesos adicionales que añaden diversidad al repertorio. Los mecanismos básicos son dos: 1.- Por la diversidad de unión Es probablemente el proceso que mas contribuye a la diversidad. Durante el proceso de recombinación se producen adición o eliminación de nucleótidos entre los segmentos V y D y J en las cadenas pesadas, en el momento del empalme. Este fenómeno que provoca variabilidad en las uniones y por tanto variaciones en la secuencia de aminoácidos es lo que se 430945431.doc 14/11/2015 Página 6 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad conoce como diversidad de unión. , el proceso comienza por el corte del ADN en el proceso de los minigenes que se van a combinar, durante el proceso de recombinación genética. Ese corte es reparado me diante la formación de un bucle final en la hebra. Posteriormente intervienen las enzimas RAG 1 y 2, para efectuar un nuevo corte, al azar, en los dos bucles en el proceso normal de volver a fusionar la doble hebra de DNA, partida en el proceso de recombinación genética. Los nucleótidos que quedan en soso puntos finales después del corte se denominan Nucleotidos P. Una vez efectuado el corte por las RAG, la enzima TdT (deoxirribonucleotidil transferasa terminal), adiciona nuevos nucleótidos (Nucleotidos N), hasta un máximo de 15. En la dirección 3’ 5’, en cada una de las hebras. Entre ellos habrá siempre algún nucleótido complementario que unira las dos hebras. Los nucleótidos adicionados que no sean complementarios de los existentes en la otra hebra, son eliminados por una exonucleasa. Finalmente el proceso se completa adicionándose nuevos nucleótidos complementarios en los huecos que quedan por una polimerasa. Tanto los nucleótidos P como los N, son nucleótidos no codificados en el genoma y que provocan un cambio en la lectura del codón que provoca la transcripción de aminoácidos no codificados que hacen cambiar la conformación inicial provocando una mayor diversidad. 2.- Por Hipermutación somática La gran diferencia, es que este mecanismo opera ya en Linfocitos B maduros y que han tenido contacto con el antígeno. Consiste en la introducción, al azar, de pequeñas mutaciones puntuales en las regiones V de los genes ya reordenados. Al ser al azar, algunas células unirán al antígeno con menor afinidad por lo que serán desplazadas por las existentes y morirán por apoptosis, pero en cambio otras se unirán al antígeno con mayor afinidad, siendo por tanto seleccionadas. Este fenómeno se conoce como maduración de la afinidad, y es muy importante para hacer más eficaz la respuesta Con ello y efectuando unos sencillos cálculos se puede comprobar, como este mecanismo es capaz de general la enorme diversidad existente. 1 factor: Diferentes posibilidades combinatorias de los genes Cadena Pesada: 65*27*6 = 11.000 combinaciones diferentes Cadena Ligera: (40*5)+ (30*4) = 320 combinaciones Total 320 *11.000 = 3,5 * 106 2.- factor: imprecisión de las uniones de las cadenas: se estima que esto contribuye con un factor de 107 3,5 * 106 * 107 = 3,5 * 1013 3.- Posibilidad de mutaciones somáticas puntuales. La posibilidad de que se produzcan aquí es 1000 veces mayor que en cualquier otro gen. Esto contribuye a su vez con otro factor de 10 3,5 * 1014* 10 = 3,5 * 1014 430945431.doc 14/11/2015 Página 7 de 8 Tema 8: El receptor del Linfocito B y T. Generación de la diversidad Generación de la diversidad del TCR La diversidad del TCR, se genera por mecanismos similares a los descritos anteriormente. La cadena α solo contiene segmentos V y J, mientras que la β presenta V, D y J. Las principales diferencias en relación con la diversidad presentada por las Inmunoglobulinas radican en los siguientes aspectos: Se calcula que el tamaño del repertorio para las células T es de 1015 a 1018. Existen menos genes V que en las Ig, pero esto es compensado ampliamente por la mayor diversidad de unión de los distintos genes que alcanza un orden de 1011. Esto es debido sobre todo a que la región V puede asociarse tanto con genes de la región D como de la J. Situación esta que no tiene lugar en las Ig en las que el gen V solo puede unirse a la región D. Como esa diversidad se concentra sobre todo en la región CDR3, Esto explicaría el porque el centro del receptor T es altamente variable y en cambio, la periferia presenta variaciones “relativamente pequeñas. Otra diferencia es que en este caso, una vez producido el gen funcional del TCR, no se producen más cambios que alteren la especificidad o la afinidad del receptor antigénico. Posiblemente esto es debido a la necesidad de reconocimiento de la molécula CMH. Con todo ello, en el hombre existen para la cadena α, 70 alelos V y 61 J y para la β 52 J, 2 D y 13 J. Con esto el número de combinaciones posibles sería de aproximadamente 1018. En el caso de los linfocitos γδ se pueden combinar con menos segmentos V que los αβ, aunque esto parcialmente se compensa por tener mayor diversidad de unión al poder incorporarse dos genes D a la cadena δ 430945431.doc 14/11/2015 Página 8 de 8