Electroforesis

ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS
Definición: Método de análisis basado en la migración
diferencial de sustancias en solución cargadas
eléctricamente, por efecto de la aplicación de un campo
eléctrico.
Aplicación a:
•
•
•
•
•
•
Proteínas en general
ADN y ARN
Nucleótidos
Aminoácidos
Polisacáridos
Fosfolípidos.
CLASIFICACION:
a) Según el soporte:
•
•
•
•
•
Geles de poliacrilamida
Geles de agarosa
Tiras de acetato de celulosa
Geles de almidón
Papel de filtro
b) Según las características de la moléculas a separar:
* Carga
* Peso molecular (P.M.)
* Punto isoeléctrico (p.I)
* Combinaciones de las anteriores
TEORIA
Una partícula cargada eléctricamente con la carga q
colocada en un medio determinado y bajo la acción de un
campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas:
A) la fuerza de atracción o fuerza propulsora, llamada
fuerza eléctrica (Fe)
B) la fuerza resistente, llamada resistencia viscosa (Fs).
A) Fuerza eléctrica: (1) Fe = E . q
Fe
V
E = ---- = -----q
I
E : campo elé
eléctrico
V : diferencia de potencial aplicada
q : carga de la partí
partícula
sobre la longitud ( l )
B) Resistencia viscosa: ( 2 ) Fs = 6π η r v
η = viscosidad del medio
r = radio de la partícula
v = velocidad de la partícula
La partícula es empujada por la Fe y su velocidad (v)
aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se
equilibran:
E . q = 6π η r v
Fe = Fs
Despejando la velocidad tenemos: (3)
q
v = E . ----6π η r
q
En cambio, el factor ----- depende del medio ( η ) y de la partícula
6π η r
q
---r
q
Esta relación: ---- , se llama Movilidad Electroforética
6π η r
y se representa por la letra µ.
q
µ = −−−−
Según (3) la velocidad será: v = E . µ ,
6π η r
v = V/l . µ
La velocidad de la partícula (v) en una electroforesis es
proporcional al campo aplicado (E) y a su Movilidad Electroforética
(µ).
Electroforesis en tiras de
acetato de celulosa
Siembra
Cátodo
-
Anodo
+
Siembra
Anodo
Cátodo
+++
-
+
Fuente de
Poder (V)
+
Siembra
Anodo
Cátodo
+++
-
+
+
Fuente de
Poder (V)
Siembra
Anodo
Cátodo
+++
-
+
+
Fuente de
Poder (V)
Siembra
Anodo
Cátodo
+++
-
Fuente de
Poder (V)
+
-
+
Siembra
Anodo
Cátodo
+++
-
Fuente de
Poder (V)
+
-
+
Siembra
Anodo
Cátodo
+++
-
Fuente de
Poder (V)
+
-
+
Carga de aminoácidos en función del
pH
Glicina
COOH
H3N+
C
H
H
Carga de aminoácidos en función del
pH
Glicina
COOH
C
H3N+
H
H
H3N+ C
H
+
+pK1: 2.34
NaOH
COO-
pH
H
Carga de aminoácidos en función del
pH
Glicina
COOH
C
H3N+
H
H
+
H3N+ C
H
H2N
C
H
H
+-
-
pK1: 2.34
NaOH
COO-
COO-
pK2: 9.6
pI: 5.97
H
pH
Ejercicio:
Para separar una mezcla de proteínas se realizó una electroforesis con
un buffer pH= 4.5. De acuerdo a la siguiente tabla de datos, conteste:
Proteína
pI
a....................2.3
b....................4.5
c..................10.5
d....................9.2
e.....................3.8
A.
B.
C.
D.
La proteína e migró al cátodo.
Las proteínas a y d migraron al cátodo.
La proteína a está más alejada que la e del lugar de siembra.
La proteína e está más alejada que la a del lugar de siembra.
Ejercicio
Cuál es el mejor buffer para separar estas cuatro proteínas:
Proteína
pI
a..............5.2
b..............7.4
c..............8.5
d..............3.4
Buffer
pH
1.............9.2
2.............8.5
3.............5.2
4.............3.0
Electroforesis de Proteínas
1) SDS-PAGE
2) Enfoque iso-eléctrico
(Iso-electric focusing)
3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)
SDS - PAGE
Geles de poliacrilamida
2β
β-Mercaptoetanol ?
El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente
aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el
esqueleto polipeptídico y les confiere carga negativa.
PROCEDIMIENTO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Armado del soporte
Formación del gel
Siembra de la muestra
Corrida
Fijación y Coloración
Desteñido
Secado
Análisis
Siembra
-
+
Determinación de Pesos Moleculares por SDS-PAGE
Movilidad relativa de una
Proteína (Rf).
St. (PM)
Muestra
66000
También llamado relación al frente.
45000
34700
Distancia Recorrida por Proteína.
Banda 1
Banda 2
Rf= Distancia Recorrida por Colorante.
19000
10000
Azul de Bromofenol
PM
Curva de Calibración de proteínas por SDSPAGE al 12 %
y = -73873x + 67578
R2 = 0,9569
70000
60000
50000
40000
30000
20000
10000
0
B1=5.43 cm
B2=5.55 cm
D.R.Col = 9.4 cm.
Calcular el Rf y el PM
para cada muestra.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Rf (cm)
Electroforesis de Proteínas
1) SDS-PAGE
2) Enfoque iso-eléctrico
(Iso-electric focusing)
3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)
Enfoque iso-eléctrico
(Iso-electric focusing)
Dos corridas:
1) Enfoque de anfolitos, gradiente de pH.
2) Enfoque de proteínas.
NaOH
pH
10
3
H3PO4
Electroforesis de Proteínas
1) SDS-PAGE
2) Enfoque iso-eléctrico
(Iso-electric focusing)
3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)
2-D PAGE
(PAGE Bidimensional)
Electroenfoque
(Separación por pI)
SDS-PAGE
(Separación por Peso Molecular)
ELECTROFORESIS
Uso en la profesión veterinaria, fundamentalmente en
la separación e identificación de sustancias de
componentes biológicos, especialmente líquidos
como: suero, orina, líquido cefaloraquídeo, líquido
de punciones, leche, etc.
Análisis de proteínas lácteas por
electroforesis
Las proteínas de la leche se dividen en dos grupos:
A) Caseínas son las que precipitan a pH 4.6 a 20ºC. Están compuestas por
las fracciones αs1, αs2, β y κ; corresponden al 80 % del total de
proteínas lácteas.
B) Proteínas del suero: α-lactalbúmina y β-lactoglobulina.
Las caseínas son muy importantes por su valor nutritivo y también por
su influencia sobre los derivados lácteos. Hay alta correlación entre
contenido de caseínas y rendimiento quesero; también influyen sobre
características tales como el sabor, textura, etc.
Objetivo 1:
Separar e identificar las fracciones de caseínas
bovinas y caprinas por SDS-PAGE.
Resultados
SDS-PAGE
Caseínas Bovinas
M
M
St. St.
Caseínas Caprinas
St. St.
M
α s2
α s2
α s1
β
κ
α s1 y β
κ
C.B. C.B. C.B.S. β-Cn
C.B.: Muestras individuales bovinas
C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma)
β-Cn.: St. de beta-caseína (Sigma).
C.B.S. C.S. C.T.
C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma)
C.S.: St. de Caseína Caprina (Sigma).
C.T.: Muestra de Caseína Caprina de la
raza Toggenburg.
Objetivo 2:
Estudiar la actividad proteolítica de la
enzima Pepsina porcina sobre la
B.S.A. (Albúmina Sérica Bovina)
Resultado
Tiempo en minutos en degradación de BSA por Pepsina porcina.
BSA
0
St.
0
10
20
10
20
30
30
45
45
60
60 (min)
St.
Pocillos:
1: St (PM): 14.3, 18.4, 24, 34.7, 45, 66 KD.
2: (BSA) a tiempo “0” con Pepsina.
3: Idem 2 pero a t: “10” minutos.
4: a “20” min.
5: a “30” min.
6: a “45” min
7: a “60” min.
8: St igual que en pocillo 1
P:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Hemoglobina
Hemoglobina (PM=64500): formada por cuatro cadenas
polipeptídicas, dos cadenas α (141 aa) y dos cadenas β (146
aa).Cada subunidad tiene un grupo Hemo con un átomo de Hierro
en estado ferroso (Fe2+) que son los que convierten a la Hb en una
proteína cromogénica.
Objetivo 3:
Evaluar
el comportamiento de la Hemoglobina
corrida por SDS-PAGE, bajo condiciones
desnaturalizantes.
Resultados
SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)
SDS-PAGE (12%)
Tinción con Azul de
Coomasie
PM aprox.
64.500
34.000
17.000
14.000
Hb (BSA) SUERO
SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)
SDS-PAGE (12%)
Tinción con Azul de
Coomasie
SDS-PAGE (15%)
Sin tinción
PM aprox.
PM aprox.
64.500
17.000
14.000
34.000
17.000
14.000
Hb en diferentes concentraciones
Hb (BSA) SUERO
Ejercicios
Se realiza una electroforesis en un buffer pH 7.6, de una mezcla de
tres proteínas (a, b y c) cuyos pI son:
•
pI (a) = 4.3
•
pI (b) = 5.6
•
pI (c) = 8.3
1)
De acuerdo con estos datos:
A)
B)
C)
D)
las proteínas (a) y (b) migrarán al ánodo.
las proteínas (b) y (c) migrarán al ánodo.
las proteínas (a) y (b) migrarán al cátodo.
la proteína (b) migrará al cátodo.
2)
Se desea separar por electroforesis una mezcla de tres proteínas
(I, II, y III) utilizando un buffer pH 5.2
Teniendo en cuenta los siguientes datos:
I
II
III
pI
P.M.
………...4.7……..110.000
………...4.0………60.000
………...6.9……..150.000
Puede predecirse que:
A) la proteína I se dirigirá al ánodo, y las proteínas II y III al cátodo.
B) II estará más alejada que I del lugar de siembra.
C) III estará más cerca del ánodo que I y II.
D) I estará más alejada que II del lugar de siembra.
3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal
canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas.
PROTEINAS
Albúmina
α1-globulina
α2-globulina
β-globulina
γ-globulina
PM
69000
195000
820000
143000
160000
pH 2
pI
4.9
2.7
5.4
5.6
7.3
pH 9
3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal
canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas.
PROTEINAS
Albúmina
α1-globulina
α2-globulina
β-globulina
γ-globulina
PM
69.000
195.000
820.000
143.000
160.000
pH 2
pI
4.9
2.7
5.4
5.6
7.3
pH 9
Electroenfoque
SDS-PAGE
4) La figura adjunta muestra un gel SDS-PAGE. Las proteínas han sido teñidas
con azul de coomassie. Se han aplicado 5 muestras distintas:
•1,2 y 3.) Proceso de Purificación.
•4.) Proteína Purificada
•5.) El material purificado (banda C) con tres marcadores de peso molecular A, B y D.
St.
Curva de calibración de estándares de P.M.
por SDS-PAGE.
P.M.
A......100.000
B........40.000
D.........4.000
y = -134904x + 118644
R2 = 0,9992
120000
A
100000
P.M.
80000
D
60000
B
40000
20000
D
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
Rf
¿Cuál es el peso molecular de la proteína pura?
5) La protein-kinasa dependiente de cAMP de mamíferos
muestra un peso molecular en condiciones nativas de 178.000.
En SDS-PAGE esta proteína da lugar a una banda de 39000 y
otra de 50000.
¿Cómo se explican estos resultados?