Enzimas II y III

ENZIMAS II y III
Proyecciones de la clase teórica
CURSO DE B.M.C.
2014
Dr. Marcelo Rodríguez Piñón (DMTV-MSc)
Prof. Adj. de Bioquímica
Area Bioquímica
Departamento de Biología Molecular y Celular
Facultad de Veterinaria
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Reacciones químicas:
Molecularidad
1)A → P + Q
Monomolecular
2)A + B → O +P + Q
Dimolecular
3)A + B + C → P
Trimolecular
Reacciones químicas:
Cinética: Velocidad de reacción
d[A]
d[P]
v = - ──── = ────
dt
dt
v = k [A]n
Orden de reacción = n
Concepto experimental que representa la relación entre v y
concentración de los reactivos:
Orden 0, n=0
v = k [A]0 = k
v
k
Primer orden, n=1
v = k [A]
v
Segundo orden, n=2
v = k [A]2
v
cte
k
[A]
[A]
[A]
Reacciones enzimáticas:
Cinética: Velocidad de reacción
S+E
ES
 La E no se gasta (se reutiliza).
 El complejo E-S es transitorio.
P+ E
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Influencia del tiempo sobre la v de reacción
≠ tiempos
[S] cte.
[E] cte.
Ta cte.
pH cte.
iones cte.
S E S E S E S ES E
Baño a 36oC
2
[P]
(Abs)
4
8
16
32
min.
Vo cte
2 4
8
16
32 min.
Influencia del tiempo sobre la v de reacción
Vo = velocidad inicial
“condiciones experimentales
(tiempos cortos) en las que
la v permanece constante en
el tiempo”.
S+E
ES
[P]
(Color)
Abs
v0 cte
2 4
8
16
P+ E
Condiciones de Vo (cinética en “tiempos cortos”):
•
•
•
la unión del P a la E es despreciable.
la disminución de la S es despreciable.
la E no se desnaturaliza o degrada.
32 min.
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Influencia de la concentración de sustrato
sobre la v de reacción
≠ [S]
tiempo cte.
[E] cte.
Ta cte.
pH cte.
iones cte.
S5 E S10 E S20 E S40 E S80 E
Baño a 36oC, Tiempo: 5 min
5
10
20
40
80 [S]mM
Vo
[P]/min
5 10
20
40
80 [S]mM
mM
μM, nM, pM
S
E
S = sustrato
E = enzima
P = producto
E-S
P
E
Cinética enzimática
S+E
k1
k-1
ES
k2
P+ E
k
-2
v = k [A]n
1) Si estamos en Vo, k-2 puede ser despreciable.
Vo = velocidad inicial
“condiciones experimentales (tiempos cortos) en las que
la v permanece constante en el tiempo”.
En los primeros minutos de la reacción:
•
•
•
la unión del P a la E es despreciable.
la disminución de la S es despreciable.
la E no se desnaturaliza o degrada.
Cinética enzimática
S+E
k1
k-1
ES
k2
v = k [A]n
P+ E
1) Si estamos en Vo, k-2 puede ser despreciable.
2) k2 es la mas lenta, por lo tanto limitante:
?
Vo = k2 [ES]
(ec. 1)
Cinética enzimática
S+E
k1
k-1
ES
k2
v = k [A]n
P+ E
1) Si estamos en Vo, k-2 puede ser despreciable.
2) k2 es la mas lenta, por lo tanto limitante:
?
Vo = k2 [ES]
(ec. 1)
3) La reacción enzimática alcanza un estado estacionario donde:
[ES] es constante
Condiciones de Vo (cinética en “tiempos cortos”):
•
•
•
la unión del P a la E es despreciable.
la disminución de la S es despreciable.
la E no se desnaturaliza o degrada.
Estado estacionario: símil hidráulico
flujo de entrada
volumen = cte. si:
flujo de entrada = flujo de salida
flujo de salida
Cinética enzimática
S+E
k1
k-1
E-S
k2
v = k [A]n
P+ E
1) Si estamos en Vo, k-2 puede ser despreciable.
2) k2 es la mas lenta, por lo tanto limitante:
?
Vo = k2 [ES]
(ec. 1)
3) La reacción enzimática puede alcanzar un estado estacionario donde:
[ES] es constante
vf = k1 [S][E]
vf [ES] = vd [ES]
vd = k-1 [ES] + k2 [ES]
k1 [S][E] = k-1 [ES] + k2 [ES]
k1 [S][E] = k-1 [ES] + k2 [ES]
k1 [S][E] = (k-1 + k2 )[ES]
[S][E] = (k-1 + k2 )[ES]
k1
Si (k-1 + k2 ) = Km (ec. 2)
k1
[S][E] = Km [ES] dado que: [S]  [Si] y que: [E] = [ET] - [ES]
[S] = [Si] - [ES]  [Si]
1 0.001
k1 [S][E] = k-1 [ES] + k2 [ES]
k1 [S][E] = (k-1 + k2 )[ES]
[S][E] = (k-1 + k2 )[ES]
k1
Si (k-1 + k2 ) = Km (ec. 2)
k1
[S][E] = Km [ES] dado que: [S] [Si] y que: [E] = [ET] - [ES]
[S] ([ET]- [ES]) = Km [ES]
[S][ET]- [S][ES] = Km [ES]
[S][ET] = Km [ES] + [S][ES]
[S][ET] = (Km + [S]) [ES]
[ES] = [S][ET]
Km + [S]
(ec. 3)
[ES] = [S][ET]
Km + [S]
(ec. 3)
2) k2 es la mas lenta, por lo tanto limitante:
?
Vo = k2 [ES]
(ec. 1)
Vo = k2 [S][ET] considerando que Vm = k2 [ET]
(ec. 4)
k1
k2
Km + [S]
S + E k E-S
P+ E
-1
Vo = Vm [S]
Km + [S]
(Michaeles-Menten, 1913)
Ecuación de Michaelis - Menten
Influencia de la concentración de sustrato
sobre la v de reacción
≠ [S]
tiempo cte.
[E] cte.
Ta cte.
pH cte.
iones cte.
S5 E S10 E S20 E S40 E S80 E
Baño a 36oC
5
10
20
40
80
mM
Vo
Modelo de
[P]/min
Michaelis - Menten
“cinética michaeleana”
Vo = Vm [S]
Km + [S]
5 10
20
40
80 mM
Modelo de
Michaelis - Menten
Vm
Vo
Vo = Vm [S]
Km + [S]
[P]/min
Vm
2
•Vm 100%
•Km = [S] a 50%
de saturación
5 10 20
Km
Vm = cte
Km = cte
[S] << Km
[S] >> Km
40
80 mM
para un sistema E y S cuando la [E] cte.
para un sistema E y S, es específica para cada reacción E-S.
reacción de primer orden.
reacción de orden 0.
Km: [S] en la cual la E trabaja al 50% de la saturación
Vo = Vm [S]
Km + [S]
Vo = Vm
2
(el 50%)
Vm = Vm [S]
2
Km + [S]
1 =
[S]
2
Km + [S]
Ecuación de Michaelis - Menten
Km + [S] = 2 [S]
Km = 2 [S] - [S]
Km = [S] donde la Vo = Vm (el 50%
2
de sat.)
Vo = Vm [S]
Km + [S]
Vm = cte
Km = cte
para un sistema E y S cuando la [E] cte.
para un sistema E y S, es específica para cada reacción E-S.
S+E
k1
k-1
E-S
k2
P+ E
(ec. 2)
Km = k-1 + k2
k1
Ctes. Disociación
Ctes. Asociación
≈
1
Afinidad
Km de algunos sistemas enzima - sustrato
Enzima
Sustrato
Km (mM)
Hexoquinasa
(cerebro)
D-Glucosa
D-Manosa
D-Fructosa
D-Alosa
ATP
0.05
0.08
1.5
70.0
0.4
Glucoquinasa
(Hígado)
D-Glucosa
ATP
5.0
0.1
Isoenzimas: “Enzimas que catalizan una misma reacción,
pero tienen una estructura molecular y origen
distintos.”
Isoenzimas: Glucokinasa y Hexokinasa
Vo
mM/min
Vm
Vm
[Glc] sanguínea (monogástricos)
• ≈ 4 mM ayuno
• ≈ 10 mM post-ingesta
Glucokinasa
Hexokinasa
[S] mM
Km Km
0.05 5.0
ENZIMAS II y III
Proyecciones de la clase teórica
CURSO DE B.M.C.
2014
Dr. Marcelo Rodríguez Piñón (DMTV-MSc)
Prof. Adj. de Bioquímica
Area Bioquímica
Departamento de Biología Molecular y Celular
Facultad de Veterinaria
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Cinética enzimática
S+E
k1
k-1
E-S
k2
k-2

P+ E
1) Si estamos en Vo, k-2 puede ser despreciable.
2) k2 es la mas lenta, por lo tanto limitante:
Vo = k2 [ES]
(ec. 1)
3) La reacción enzimática puede alcanzar un estado estacionario donde:
vf [E-S] = vd [E-S]
4) Cte. de Michaelis-Menten
Km = k-1 + k2
k1
5) Velocidad máxima de reacción
Vm = k2 [ET]
6) Modelo de Michaelis-Menten
Vo = Vm [S]
Km + [S]
(ec. 2)
(ec. 4)
Estudio cinético de la Invertasa
Reacción catalizada:
Sacarosa + H2O → Glucosa + Fructosa
[S]
(Sacarosa, mM)
Vo de reacción
(∆ poder reductor/min)
0
0
5
0.165
10
0.300
20
0.610
40
0.930
80
1.100
160
1.150
[E] (Invertasa) = cte.
CH2OH
H
H
O
OH H
HO
O
O H
H
OH
CH2OH
OH
H
H
OH
OH
CH2 OH
Sacarosa
 (1-2)
+
H2O
Invertasa (Sacarasa)
CH2OH
H
H
HO OH
H
OH
CH2OH
C
+
H
O
OH
O H
CH2 OH
C
OH H
C
C
H
OH
OH
D-glucosa
D-fructosa
OH
Vo (poder
reductor/min)
Sacarosa - Invertasa
Método reductimétrico
Vm
1,4
1,2
1
0,8
Vm = 1.20 PR/min
Km = 20 mM
Vm/2
0,6
0,4
0,2
Km
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160
Sacarosa (mM)
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Vo (poder
reductor/min)
Sacarosa - Invertasa
Método reductimétrico
Vm
1,4
1,2
1
0,8
Vm = 1.20 PR/min
Km = 20 mM
Vm/2
0,6
0,4
0,2
Km
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160
Sacarosa (mM)
Para rectificar una hipérbola rectangular:
aplicar el inverso a ambas variables (1/y , 1/x).
Modelo rectilíneo de
Lineweaver – Burk (1934)
Vo = Vm [S]
Km + [S]
1
= Km + [S]
Vo
Vm [S]
1 = Km
+ [S]
Vo Vm [S] Vm [S]
1 = Km + 1
Vo Vm [S] Vm
1 = Km
Vo Vm
y
= b
1 + 1
[S] Vm
. x + a
Modelo rectilíneo de
Lineweaver – Burk
(gráfico de los dobles recíprocos)
1 = Km
1 + 1
Vo Vm [S] Vm
y = b . x + a
1/Vo
(min/mM)
Km
Vm
1/Vm
-1/Km
-1.0
-0.05
.05
.10
.15 .20
.25
1/[S] (1/mM)
.30
.35
Modelo de Lineweaver - Burk
1 = Km
1 + 1
Vo Vm [S] Vm
y = b . x + a
cuando y = 0, x = -1/Km
cuando x = 0, y = 1/Vm
1 1/Vo
= 1 + Km . 0
(min/mM)
Vo
Vm Vm
1 = 1
Vo Vm
1/Vm
-0.05
= 1 + Km
Vm Vm
- 1 = Km 1
Km
Vm Vm [S]
Vm
Vm . - 1 = Km
Vm
-1/Km
-1.0
0
.05
.10
1
[S]
1 = .30Km.35 1
.15 .20 - .25
1/[S] (1/mM)
[S]
- 1 = 1
Km [S]
1
[S]
Modelo rectilíneo de
Lineweaver – Burk
(gráfico de los dobles recíprocos)
1 = Km
1 + 1
Vo Vm [S] Vm
y = b . x + a
1/Vo
(min/mM)
Km
Vm
1/Vm
-1/Km
-1.0
-0.05
.05
.10
.15 .20
.25
1/[S] (1/mM)
.30
.35
Vo
3,5
Vm=3.0
3
Vm=2.5
2,5
Enzima A
2
Enzima B
1,5
Enzima C
Vm =1.3
1
0,5
0
Km Km Km
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Sustrato (mM)
3
1/Vo
2,5
2
1,5
1
1/Vm=0,77
0,5
1/Vm=0,4
1/Vm=0,33
0
-0,5
-1/Km
-1/Km
0
-1/Km
0,5
1
1,5
2
1/Sustrato
(1/mM)
Estudio cinético de la Invertasa
Reacción catalizada:
Sacarosa + H2O → Glucosa + Fructosa
[S]
(Sacarosa,
mM)
Vo de reacción
(∆ poder
reductor/min)
1/[S]
(Sacarosa,
1/mM)
1/vo de
reacción
(min/∆ poder
reductor)
0
0
-
-
5
0.165
0.2
6.061
10
0.300
0.1
3.333
20
0.610
0.05
1.639
40
0.930
0.025
1.075
80
1.100
0.0125
0.909
160
1.150
0.00625
0.870
[E] (Invertasa) = cte.
S a c a rosa - Inve rta sa
Mé todo re duc tim é tric o
7
1/V o
(m in/pode r
re duc tor)
6
5
4
Vm = 1.54 PR/min
3
1/Vm = 0.65 min/PR
2
-1/Km = -0.025 1/mM
1
+ 0,5002
Kmy ==27,647x
40 mM
R 2 = 0,9943
0
-0,05
0
0,05
0,1
0,15
0,2
1/S a c a rosa (1/m M)
V o (pode r
re duc tor/m in)
S a c a rosa - Inve rta sa
Mé todo re duc tim é tric o
Vm
1,4
1,2
1
0,8
Vm = 1.20 PR/min
Km = 20 mM
Vm/2
0,6
0,4
0,2
Km
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160
S a c a rosa (m M)
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Influencia de la concentración de enzima
sobre la v de reacción
≠ [E]
tiempo cte.
[S] cte.
Ta cte.
pH cte.
iones cte.
S E1 S E2 S E4 S E8 S
E16
Baño a 36oC
1
2
4
8
16
3
Vo
Vm 4
4 nM [E]
2,5
Vm 2
2
Vm 4/2
Vm 2/2
2 nM [E]
1,5
Vm 1
1 nM [E]
1
Vm 1/2
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Km
Sustrato (mM)
nM
Efecto de la [E] sobre la velocidad de reacción
3
Vo
Vm 4
4 nM [E]
2,5
Vm 2
2
2 nM [E]
Vm 4/2
1,5
Vm 1
1 nM [E]
Vm 2/2
1
Vm 1/2
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Km
Sustrato (mM)
2
1/Vo
1,8
1 nM [E]
1,6
1,4
1,2
2 nM [E]
1
0,8
4 nM [E]
0,6
1/Vm1
0,4
0,2
-1/Km
-0,02
1/Vm2
1/Vm4
0
0,0 3
1/Sustrato (1/mM)
Efecto de la [E] sobre la velocidad de reacción
Vm
10
(P/t)
Vm = k2 [ET]
k2
0
0
1
2
3
4
ET (nM)
Cinética enzimática
S+E
k1
k-1
E-S
k2
k-2

P+ E
1) Si estamos en Vo, k-2 puede ser despreciable.
2) k2 es la mas lenta, por lo tanto limitante:
Vo = k2 [E-S]
(ec. 1)
3) La reacción enzimática puede alcanzar un estado estacionario donde:
vf [E-S] = vd [E-S]
4) Cte. de Michaelis-Menten
Km = k-1 + k2
k1
5) Velocidad máxima de reacción
Vm = k2 [ET]
6) Modelo de Michaelis-Menten
Vo = Vm [S]
Km + [S]
(ec. 2)
(ec. 4)
Efecto de la [E] sobre la velocidad de reacción
S+E
k1
k-1
E-S
k2
Vm = k2 [ET]
P+ E
(ec. 4)
k2 = Vm
[ET]
Rel= Concentración S que se transforma/min
Concentración de E
R= 1 mM/min
1 nM
=
10-3 M/min = 1.000.000
10-9 M
R = Número de recambio o poder catalítico
Nº de recambio o actividad molecular: (nº
mol S /s) /molec. E. Número de recambio
Katales / mol E
Catalasa 40.000.000
Anhidrasa carbónica 600.000
β– amilasa 16.000
LactatoDH 1.000
β– galactosidasa 200
Fosfoglucomutasa 20
Lisoenzima 0,5
- Catal o Katal: mol S /s- Actividad
específica (AE): nº mol E /g. prot (o)
Katales/g prot
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción
100
Activ.
Enzim.
90
80
70
60
50
Temp.
óptima
37oC
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Temperatura (oC)
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Efecto del pH sobre la velocidad de reacción
120
Activ.
Enzim.
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH óptimo= 7.4
9
10
11
pH
12
Efecto del pH sobre la velocidad de reacción
120
Activ.
Enzim.
G6Pasa
100
Pepsina
Quimotripsina
Lisozima
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH óptimo= 7.4
9
10
11
pH
12
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Cofactores y Coenzimas
“Sustancias no proteicas necesarias para la
acción de muchas enzimas”
2 grandes grupos:
Cofactores: Iones inorgánicos
Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+/ Fe3+,
Cu+/ Cu2+, Zn2+, Se2+, Co2+/ Co3+
Coenzimas: Compuestos orgánicos (la mayoría
derivados de las vitaminas hidrosolub.)
NAD+/ NADH
NADP+/ NADPH
FAD / FADH2 (ejemplo de grupo prostético)
Coenzima A
Coenzima Q
Cofactores y Coenzimas
 Estabilizan la conformación nativa o activa de
algunas enzimas.
Participan en el reconocimiento de algunos sustratos
y en la acción catalítica.
Actúan en la transferencia de electrones (e-) y
protones (H+).
 Actúan en la transferencia de radicales y grupos
químicos.
Enzimas II y III – Cinética enzimática
•Cinética enzimática: conceptos generales
•Factores que afectan la velocidad de reacción:
Tiempo de reacción:
Concepto de velocidad inicial (Vo).
Concentración de Sustrato:
Modelo de Michaelis-Menten (definición de los parámetros cinéticos Vm y
Km).
Modelo rectilíneo de Lineweaver – Burk.
Concentración de la Enzima
Temperatura, pH, medio iónico
Cofactores y Coenzimas
Inhibidores, Moduladores
Bibliografía:
 A. Lehninger. Principios de Bioquímica. Ed.
Omega de 2009.
 Voet D. and Voet J.G. Bioquímica. Tercera Edición.
Ed. Médica Panamericana, Buenos Aires, 2006.
 Guía de Bioquímica. Ediciones de la Facultad de
Veterinaria 2011.