2. BIOFILM DE S. AUREUS. Dra. R. de los Santos 

Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Biofilms de S. aureus en la
industria
Rosario de los Santos, DMTV, MSc
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Introducción
• La contaminación de los alimentos puede
ocurrir en cualquier etapa del proceso
productivo (“farm to fork”) (WHO/OMS, 2007)
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Biofilms
• Los Centros de Control y Prevención de
Enfermedades (CDC) han reportado
anualmente 1000 brotes de Enfermedades
Transmitidas por Alimentos (ETAs). (Scanlan et al,
2011)
• Muchos de estos brotes relacionados a
patógenos, se hallan asociados a biofilms. (Srey,
2013)
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Celulas libres/Células sésiles
En la mayoría de los medioambientes naturales la
asociación con una superficie formando un biofilm
es el modo de vida prevalente entre las bacterias.
La forma de vida planctónica podría ser una fase de
traslación entre una superficie y otra.
La formación de un biofilm requiere de la existencia
de señales entre células que permitan una
transcripción de genes diferente a la de las células
planctónicas
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
En la naturaleza los biofilms son comunidades
multiespecies donde las bacterias comparten su
material genético y se acomoda en distintos
nichos dentro del biofilm, en suma forma una
comunidad ¨multicultural*, compleja y altamente
diferenciada¨.
*muchos cultivos
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S. aureus
• Staphylococcus aureus es una bacteria Gram
positiva que se encuentra habitualmente en la
piel y mucosas de los animales de sangre
caliente y tiene la habilidad de crecer y producir
enterotoxinas termorresistentes causantes de
ETAs.
• Para la industria alimentaria es importante
identificar las condiciones en las cuales S. aureus
puede sobrevivir y multiplicarse a través de la
cadena de producción, elaboración, almacenaje y
distribución.
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• La mayoría de las bacterias se
organizan en biofilms que se
adhieren a superficies.
• Adherencia de las bacterias a las
superficies en contacto con
alimentos: implicancias higiénicas (
Salud Pública )y económicas
(deterioro de los alimentos).
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Definición
• Los biofilms son comunidades de bacterias
sésiles que se hallan embebidas en una matriz
extracelular polimérica autosecretada
(Yarwood et al., 2003)
• Las bacterias asociadas a un biofilm muestran
una resistencia innata a los antibióticos,
desinfectantes y también a los mecanismos de
defensa del huésped
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Características
• Los biofilms pueden desplegar morfologías
diversas.
• Su formación y desarrollo se halla afectado por
diversos factores:
– la cepa bacteriana
– las propiedades del material de la superficie en
cuestión
– variables medioambientales:
• pH
• disponibilidad de nutrientes
• temperatura
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• El proceso de formación de un biofilm es
dinámico.
• Las etapas de su formación y desarrollo se
pueden dividir en:
– Etapa de adhesión a la superficie mediada por
estructuras de la superficie bacteriana
– Etapa de multiplicación y formación de las
estructuras maduras del biofilm
– Una vez que el biofilm alcanza una masa crítica
comienza la generación de microorganismos
planctónicos capaces de desprenderse y colonizar
otra superficie dando lugar a la dispersión del
mismo
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• Los biofilms de S. aureus se pueden
desarrollar tanto en condiciones estáticas
como de flujo contínuo.
• Las distintas etapas de formación y
desarrollo del biofilm están reguladas por
la expresión y represión de diversos
genes y sus productos los que varían
según el microorganismo y las
condiciones ambientales del estudio.
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Las bacterias se comunican
• Quorum sensing es un proceso de comunicación célula
a célula que permite a la bacteria compartir información
sobre la densidad celular y ajustar, de acuerdo a ella, la
expresión de sus genes.
• Este proceso permite a las bacterias expresar procesos
costosos desde el punto de vista energético como un
proceso colectivo sólo cuando el impacto de los mismos
en el medio ambiente o en el huésped son máximos.
• QS controla, entre otros, la expresión de los factores de
virulencia de las bacterias patógenas.
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QS
Se trata de un proceso de comunicación entre
bacterias que involucra la producción, detección
y respuesta a señales moleculares llamados
autoinductores (Als).
• Los Als se acumulan en el medio a medida que
la densidad de población aumenta. La bacteria
monitorea esta información para incorporar
cambios en el número de células y alterar
colectivamente la expresión de sus genes.
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QS controla genes que dirigen actividades
que son benéficas al ser ejecutadas por
una serie de bacterias actuando en
sincronía
• Dentro de los procesos que controla el QS
se hallan la bioluminiscencia, la
esporulación, la producción de
antibióticos, la formación de biofilm y la
secreción de factores de virulencia
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Funcionamiento de los QS
Los sistemas QS dependen de 3 principios básicos:
1.- Los miembros de la comunidad producen AIs que son señales
moleculares. Cuando la densidad poblacional es baja los AIs difunden
hacia el exterior pero su concentración no alcanza a ser detectada.
Cuando la densidad celular es alta, la producción de AIs se acumula y
alcanza una concentración local alta detectable y que genera una
respuesta.
2.- Los AIs son detectados por receptores que se hallan en el
citoplasma o en la membrana.
3.- Para activar la expresión de genes necesarios para las
comportamientos cooperativos la detección de AIs resulta en la
inactivación de la producción de AIs.
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S. aureus y agr
Uno de los principales componentes del programa
de virulencia de S. aureus es el desarrollo de la
formación de biofilm
• En S. aureus el sistema agr inhibe el desarrollo del
biofilm
• Establecer una comunidad de biofilm cuando son bajas
las concentraciones celulares permite a S. aureus
alcanzar altas concentraciones celulares y en ese
momento, cuando está óptimamente posicionado,
secretar factores de virulencia.**toxina
• Para facilitar su dispersión, S. aureus deja de producir
biofilm y disminuye las proteínas de superficie y la
capacidad de adherencia a altas concentraciones
celulares.
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Fase inicial: adherencia
Adherirse a las superficies es un mecanismo de
supervivencia.
– fenómeno crucial en el desarrollo de un biofilm. *
– La superficie puede ser biótica o abiótica
– La adhesión inicial puede ser activa o pasiva.
– En esta instancia:
las propiedades físicoquímicas de la superficie celular
bacteriana son determinantes
• sólo se deposita una pequeña cantidad de EPS
• la adhesión es reversible
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Fase inicial: adherencia
– Para explicar la adherencia a las superficies de
contacto con los alimentos.:
• las superficies están recubiertas por residuos de
alimentos y los microorganismos tienen acceso a
estas superficies.
• Entran en juego fuerzas de atracción y de
repulsión (van der Waals,fuerzas electrostáticas).
• A menor distancia tienen lugar las uniones iónicas
y las fuerzas hidrofóbicas.
• Cuando las fuerzas de atracción son mayores que
las de repulsión comienza a establecerse la
adherencia irreversible
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Factores que influyen en la
adhesión
• Las propiedades de la superficie (textura, carga
superficial o hidrofobicidad) las condiciones de pH,
temperatura y disponibilidad de nutrientes del medio.
• Restos de EPS preexistentes favorecen la adhesión.
• El cambio de adhesión reversible a irreversible se
debe a que la adhesión inicialmente débil de la bacteria
con la superficie cambia a una unión permanente que se
establece en presencia de EPS.
• Una vez establecido, las fuerzas tangenciales, enzimas,
detergentes, surfactantes y sanitizantes o calor intensos
serán necesarios para el desprendimiento del biofilm
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Producción de matriz extracelular
•
•
•
•
•
•
El desarrollo de la arquitectura de un biofilm se asocia
a la producción de EPS
EPS median en la adhesión célula a célula y de células
a superficies
Esto da estabilidad al biofilm, adherencia a las
superficies y forman la base de sustento para la
estructura tridimensional que conecta e inmoviliza las
células del biofilm.
No todas las especies o cepas dentro de la misma
especie usan los mismos polímeros.
Estos polisacáridos son responsables de la adhesión
intercelular. (Estan cargados positivamente y la
superficie bacteriana está cargada negativamente)
PIA actuaría como un adheresivo para el mantenimiento
del biofilm
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• Otros factores ambientales podrían
modular la expresión de PIA: glucosa,
NaCl y etanol.
• Concentraciones subinhibitorias de ciertos
antibióticos, alta temperatura, y
osmolaridad aumentarían la actividad del
promotor de ica.
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Maduración
• Luego de la producción de la matriz extracelular
y la división celular ocurre la maduración del
biofilm
• Adquiere la estructura tridimensional
característica.
• Estructuras tipo "hongos" con canales de flujo
que permiten la llegada de nutrientes a las
partes más internas de la estructura
• Algunos trabajos postulan que la muerte celular
programada (apoptosis) en los estafilococos
contribuiría con el desarrollo del biofilm. El
incremento en la lisis bacteriana influenciaría la
formación del biofilm
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Biofilm de 24 hs de evolución
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• Diferentes reguladores que controlan la
autolisis afectan el biofilm ( operones cid y
lrg )
• La liberación de ADN extracelular ( lisis
celular), contribuye al desarrollo del biofilm
.
• La molécula de ADN posee la capacidad
de unir otras moléculas en la matriz del
biofilm (el empleo de DNAsas reducen la
adhesión del biofilm)
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• Estudios recientes sugieren que los
estafilococos usan el mecanismos
regulador del “quorum sensing” para
estructurar el biofilm
• Los factores capaces de interrumpir las
interacciones célula-célula y por lo tanto
de producir el desprendimiento de las
mismas controlan el espesor del biofilm y
su expansión.
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Dispersión
• Es crucial para la diseminación de las bacterias y la
colonización de otros sitios.
• Pueden desprenderse bacterias aisladas o en
agrupamientos.
• Factores que contribuyen a la dispersión:
– fuerzas mecánicas (flujo)
– cesación en la producción de matriz extracelular (
exopolisacáridos)
– factores de dispersión : enzimas que destruyen la matriz o
surfactantes.
• En los estafilococos estos mecanismos están
controlados por el sistema de quorum sensing agr
(accessory gene regulator) y sarA.
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Aspectos particulares asociados a
biofilm de S. aureus
• La habilidad de los microorganismos
para formar biofilms varía entre
especies y también dentro de una
misma especie entre diferentes cepas y
serovares.
• En nuestros estudios todas las cepas
establecieron un biofilm en placas de
microtitulación en un lapso de 24 horas,
aunque en forma variable.
• Se pudieron establecer distintas
categorías de cepas productoras en
función del espesor del mismo. Todas
las cepas que produjeron biofilm
también produjeron limo (material
extracelular), atributos no siempre
asociados pero sí relacionados a la
adhesión celular
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Formación de biofilms en el tiempo
• La importancia de establecer el o los momentos que
marcan la mayor adherencia y máximo desprendimiento
de células, radica en evaluar el riesgo potencial de
contaminación cruzada.
• Permite optimizar los resultados de un protocolo de
limpieza y desinfección adecuado, en lo referente al
período entre tratamientos para que el número de
células adheridas en el momento de efectuar la limpieza
y desinfección sea el menor posible.
• En los sistemas más estables las células que
permanecen adheridas durante más tiempo a las
superficies se constituyen en un reservorio permanente
de microorganismos viables.
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de los Santos, R.; Scavone, P.; Gil, A.; Zunino, P.
• Diferentes patrones cinéticos durante 48 h
• Uno o más ciclos de adherencia y desprendimiento.
–
–
–
–
Perfiles de adherencia y desprendimiento fueron no lineales
De acuerdo a la literatura existente - Hödl, 2013)
Diferentes entre sí según los aislamientos
Patrón más frecuente - modelo polinómico de tercer orden (+ax3).
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Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Importancia en la industria
alimentaria y la industria láctea
Los microorganismos se pueden agregar
más fácilmente y formar biofilms en
ambientes húmedos como los que se
encuentran en las plantas procesadoras
de lácteos. (Chmielewski y Frank, 2003)
La leche es un producto muy perecedero y
sumamente vulnerable a la contaminación
por varios microorganismos que
sobreviven a los procedimientos de
limpieza y desinfección ineficientes.
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Los microorganismos patógenos pueden
adherirse y crecer en superficies
alimentarias, equipos y ambientes donde
se procesan alimentos poniendo en riesgo
la inocuidad del producto elaborado.
La presencia de éstos en un biofilm,
incrementa el riesgo de contaminación.
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• La mayoría de los casos de
contaminación microbiana tienen su
origen en la instalación de un biofilm que
al crearse, constituye una fuente de
contaminación permanente ya que permite
la supervivencia del microorganismo,
incluso en medios hostiles, al representar
un patrón de crecimiento de
autoprotección
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
• Los biofilm asociados a la industria láctea
están formados por sustancias poliméricas
extracelulares bacterianas (EPS) y
residuos de la leche, fundamentalmente
proteínas y fosfato de calcio.
• Sharma y & Anand (2002) describieron el
aislamiento de Bacillus cereus,
Escherichia coli, Shigella spp. y S. aureus
en la microbiota de los biofilms originados
en las superficies plantas procesadoras de
leche y las líneas de pasteurización.
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• El desarrollo de biofilms en los equipos
puede ocasionar serios problemas de
higiene y pérdidas económicas debidas :
– al rápido deterioro de los alimentos
– a una mayor corrosión de los equipos
causada por los microorganismos en los
biofilms que catalizan reacciones químicas y
biológicas, causan corrosión en los metales
– eventualmente pueden reducir la eficacia en
los procesos de intercambio térmico
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• La adecuada limpieza y desinfección de
los equipos es de suma importancia y
para la eficiencia de estos procesos.
• Se debe tomar en cuenta tanto la
composición inorgánica como la
composición de la microbiota adaptada a
ellos.
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• El flujo turbulento facilita la adhesión de
las bacterias y la formación del biofilm( las
células planctónicas tienen más
probabilidad de chocar con la superficie) .
• Una vez que se han establecido los
biofilms es muy difícil destruirlos o
removerlos completamente de donde se
están elaborando alimentos y de los
sistemas de distribución de agua .
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Estrategias de control
• La limpieza y la desinfección regulares son las
herramientas empleadas para evitar la adherencia
reversible de las células a las superficies de contacto.
Se sugieren 3 distintas estrategias:
• desinfección “in time”, antes de que se desarrolle el
biofilm,
• desinfección de los biofilms con desinfectantes
• uso de distintos materiales que no promueven la
adherencia o tratando las superficies recubriéndolas con
antimicrobianos o modificando las propiedades físicoquímicas de las mismas
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• En la líneas de procesamiento de productos
lácteos, priman las operaciones de limpieza in
situ (CIP).
• Se combinan las diferentes fuerzas de limpieza
para optimizar el resultado del procedimiento.
• Es frecuente que los microorganismos resistan y
produzcan biofilms conformando una microbiota
residual persistente.
• Se espera un nivel mayor de contaminación en
las superficies cerradas de la industria lechera
que en las superficies de la industria cárnica,
que no lo son.
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
• La limpieza se lleva a cabo con el fin de
romper o disolver la matriz EPS asociada
a los biofilms de tal manera que los
desinfectantes tengan acceso a las
células así liberadas, que se estima en un
90% del total, para entonces poder
destruirlas.
• De no ocurrir esto último, las células
pueden volver a adherirse a la misma u
otras superficies una vez que se vuelvan a
dar las condiciones apropiadas
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Superficies
• Los factores medioambientales juegan un rol importante
en el grado de adherencia y la formación de biofilms.
• La adherencia depende de las interacciones entre las
fuerzas de van der Waals, las electrostáticas y los
equilibrios ácido base.
• Éstas interacciones están influidas por
– las propiedades fisicoquímicas del sustrato
– de la superficie bacteriana (hidrofobicidad)
– la carga superficial y sus propiedades como aceptor o dador
de electrones.
– La rugosidad del sustrato y las características
microbiológicas de la superficie celular pueden afectar el
proceso de adhesión
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Adherencia a superficies: efecto de las propiedades de la
superficie sobre la adherencia bacteriana
.
Correlación rugosidad de la superficie y adhesión
• Resultados contradictorios pueden deberse
– al grado de aspereza estudiado,
– a las especies bacterianas estudiadas
– las características fisicoquímicos de la superficie
– la técnica empleada.
• Las bacterias tienden a adherirse a las superficies rugosas debido
a:
– la rugosidad aumenta la superficie a la que se pueden adherir
las bacterias,
– están protegidas contra la fuerza de corte (de carácter
tangencial) y frente a los cambios causados por las
interacciones físicoquímicas
• Se ha logrado establecer que es mayor el número de bacterias
que logran adherirse al acero inoxidable que presenta
abrasiones con respecto al acero inoxidable sin pulir o el acero
pulido
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
Adhesión bacteriana
• Existe una tensión superficial crítica que promueve la
adhesión bacteriana.
• La máxima adherencia de las células bacterianas
depende de la energía libre de superficie y de la
humectabilidad de la misma.
• Superficies con alto grado de energía libre son usados
en la industria alimentaria ( acero inoxidable y vidrio),
que resultan más hidrofílicas.
• Estas superficies permiten una mayor adherencia
bacteriana y formación de biofilm que aquellas más
hidrofóbicas como teflón, BNR y polímeros fluorinados.
• La mayor adherencia bacteriana ocurre en la región de
interfase hidrofílica-hidrofóbica de la superficie del acero
inoxidable
Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
• Moretro et al. (2003) encontraron que el
acero inoxidable, permitía el desarrollo de
biofilm por Staphylococcus y postuló su
posible relevancia como fuente de
contaminación de los alimentos.
• Marques et al (2007) analizaron la
capacidad de adherencia del S. aureus en
superficie de acero inoxidable y de vidrio,
encontrando que en este último la
capacidad de adhesión era casi 10 veces
mayor.
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Sanitizantes
•
•
•
•
•
De los sanitizantes ensayados el que tuvo mayor performance fue
el ácido peracético, aunque no llegó a los niveles recomendados
por la OMS
Bayoumi et al. (2012) demostraron que el hipoclorito de sodio
utilizado en las concentraciones recomendadas para sanitizar
superficies, resultó ser ineficaz para eliminar microorganismos
adheridos de varias especies incluyendo S. aureus, a superficies de
acero inoxidable.
El cloro es un agente antimicrobiano de referencia que se utiliza
para controlar la contaminación de biofilm.
Se ha presentado recientemente la evidencia de que la penetración
del cloro en el biofilm puede ser retrasada Su escasa penetración
en el biofilm se debe a la neutralización del cloro activo en las
regiones periféricas de la matriz del mismo .
En otras palabras, el cloro se consume por la reacción con la
materia orgánica en las capas superficiales del biofilm más rápido
de lo que puede difundirse en el interior del mismo.
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Acero inoxidable
• Las condiciones de limpieza del acero inoxidable
cambian sus propiedades temporalmente.
• La limpieza con álcalis o ácidos fuertes como el nítrico
que son habituales en la industria láctea transforman la
superficie en hidrofílica y por el contrario, la limpieza con
ácidos débiles la hacen hidrofóbica.
• Una vez que el acero inoxidable tiene contacto con el
aire o el agua se vuelve pasiva por la formación de una
cubierta de óxido de cromo.
• La materia orgánica se adhiere a esta capa de óxido,
sustrato al cual las bacterias se adhieren
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Factores ambientales
• Vázquez-Sánchez et al. (2013) determinaron
que la mayoría de los aislamientos de S. aureus
con los que trabajaron exhibieron la máxima
producción de biofilm a 37°C, promovida
además por la presencia de glucosa.
• Los aislamientos mostraron una variación
considerable en su capacidad de adherencia y
formación de biofilm.
• De manera similar, de los Santos et al.
encontraron una gran variabilidad en estas
propiedades, estudiados a partir de aislamientos
de S. aureus obtenidos de leche de vacas con
mastitis subclínica.
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Biofilms de Staphylococcus aureus en la industria láctea
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