Fernando Poester 1
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Inmunología Veterinaria Aplicada a Salud Animal Facultad de Veterinaria-UdelaR 20 a 31 de julio 2015 Respuesta inmune contra la Brucelosis Bovina Vacunas Fernando Padilla Poester Med. Vet. Brucelosis Enfermedad causada por bactérias del Género Brucella. En los animales producen abortos espontáneos en el tercio final de la preñez, nacimiento de crias débiles, descargas uterinas y en el hombre causan enfermedad debilitante. de Jong &Tsolis 2012 Brucelosis Humana “The disease rarely kills anybody, but it often makes a patient wish he were dead” “La enfermedad raramente mata a álguien, pero con frecuencia hace el paciente desear estar muerto” (Time magazine,1943) Población de alto riesgo (ejemplos que no se deben seguir) Porque combatir la Brucelosis Disminuición de nacimientos – 15% Disminuición producción de leche – 25% Disminuición producción de carne – 10% Pérdida de mercados internacionales Zoonosis (500.000 casos nuevos/año) Brucelosis Animal Libres de B.abortus y B. melitensis Fuente: OIE Brucelosis Humana Síria Mongólia Mas de 500.000 casos nuevos por año Pappas et al 2006 Ragan, 2002 Pérdidas Económicas Estimada en Brasil R$ 892 millones ~ U$ 370 millones (Santos et al, 2013) Incidencia Anual 500.000 casos nuevos (Williams, 1988) Evolución de la Pesquisa en Brucelosis • Importantes adelantos – décadas de 30 a 60 • Controlada en la mayoria de los países desarrollados • Erradicada en algunos países (muy pocos) • Recrudescimiento en algumas áreas • Reactivación de la pesquisa - nuevas técnicas (biomoleculares) - descripción del genoma bacteriano - bioterrorismo - nuevas vacunas para el hombre Brucella abortus Brucella suis Brucella melitensis Espécies Clásicas Brucella ovis Brucella neotomae Brucella canis Espécies Nuevas Brucella ceti Brucella pinnipedialis Brucella microti Biologia Molecular Brucella papionis Brucella Inopinata (BO1) African bullfrog White´s tree frog (Pyxicephalus edulis) Big-eyed tree frog (Litoria caerulea) (Leptopelis vermiculatus) strain UK 8/14 B.inopinata-like 09RB8471 10RB9251 Australian rodents (Melomys spp) Strain 83-13 Atipicas Brucella like Nile catfish (Clarias gariepinus) humano B. melitensis Strain BO2 Moreno 2014 Dosis infectante relativa para el hombre de las cuatro espécies zoonóticas de Brucella Virulencia para humanos Más virulenta Menos virulenta Espécies Dosis relativa B.melitensis ~ 1-10 organismos B.suis ~ 1000 B.abortus ~ 100.000 B.canis ~ 1.000.000 (Young 1995) Reservórios silvestres Hogzilla (USA) Suídeos selvagenes (Feral Swine) Cateto Javaporc Javali Brucelosis Equina Abcesso na região da cernelha (bursite supra espinhosa) The greatest Brucella abortus Reservoir in the USA Greater Yellowstone Area Bison Elk Brucelosis Animal Vías de Entrada MUCOSAS - la vía oral es la principal - venérea en porcinos y caninos - en bovinos NO es venérea a pesar de que el toro elimina por el semen. • Introducción de reproductores • Contacto indirecto con otro rebaño • Uso de IA • Presencia de áreas alagadizas Transmisión PATOGENIA Puerta de Entrada Oral Respiratória Conjuntivas Genital Piel Linfonodo regional Diseminación Hemátic a Linfática Macrófagos Neutrófilos Linfonodos Bazo Hígado Sist. Reproductivo Útero Úbere Articulaciones Tropismo Infección crónica Macrófagos Aborto Infección aguda Trofoblastos placentários Roop et al, 2004 Brucella intracelular facultativa facultativamente extracelular fagocitosis macrófago Epitélio trofoblástico Cotilédone + Carúncula = placentoma Úteros de vacas (sin brucelosis) (con brucelosis) Patogenesis Molecular Larga persistencia – hasta transmisión Factores de virulencia (poco endotóxicos) PAMPs – Pathogen Associated Molecular Patterns -------- PPRs – Pattern Recognition Receptors Sistema Secretorio de dos componentes (BvrR/BvrS) – penetración (lipid raft) Ciclic β-1,2-glucan – periplasm – fusión fagosoma/lisosoma Lipopolisacarido – LPS Sistema Secretório Tipo IV (T4SS) – vir B operon (intracellular trafficking) ) Lipopolisacarido - LPS (linear homopolymer of 1,2-linked 4,6-dideoxy-4-formamido-alpha-D-mannopyranosyl residues) (long fatty acid molecule – poor TLR4 agonist) - low toxicity Estructura del LPS Brucelas lisas (B.abortus, B.melitensis, B.suis, B19) Brucelas rugosas (B.ovis, B.canis, RB51) K: 2-ceto, 3-deoxioctulozônico Q: quinovosamina M: manose G: glicose O: perosamina Lisas x Rugosas 30-40 X Observación directa Cristal Violeta Sistema Secretório Tipo IV Sistema Secretório Tipo IV Vir B operon (12 orf ´s) Sistema Secretório tipo IV (T4SS) De Jong & Tsolis 2012 Figure 4 | Structure of a type iV secretion core complex. The core complex53 is composed of TraN (a VirB7 homologue), TraO (a VirB9 homologue) and TraF (a VirB10 homologue), which are encoded by the Escherichia coli conjugative plasmid pKM101. This structure was obtained using cryo-electron microscopy and is viewed from the side (upper left panel), tilted towards the outer membrane side (lower left panel) and tilted towards the inner membrane side (lower right panel). The cut-out view (upper right panel) details the proposed transmembrane regions and the localization of the VirB7, VirB9 and VirB10 homologues within the structure. C, carboxy-terminal domain; N, amino-terminal domain. Effectors involved in recruiting Rab2 GTPases to Brucella phagosome (inhibiting NFκB activation-trafficking) De Jong & Tsolis 2012 VirB-dependent biogenesis of the Brucella replicative organelle in MØ Celli and Gorvel, 2004 Invasión de las brucelas por el tracto digestivo MALT – mucosal associated lymphoid tissue Xavier et al 2010 Celli et al., 2003 Inmunidad Innata Subviertem: sinalización y mecanismos efectores Previenen el estallido respiratório: Síntese de ROIs y RNIs SOD, NADPH oxidasa iNOS + oxidasa = muerte bact. pH 4 Evitan: fusión fagosoma/lisosoma BCV macrófago Inmunidad Adaptativa (Inmunidad protectora) Golding et al 2001 Inmunidad Adaptativa (Inmunidad protectora) Golding et al 2001 Inmunidad Innata y Adaptativa (celular) Prevención de la Brucelosis Animal • Vacunas con bactérias vivas (virulentas) • Vacunas con bactérias muertas (inaticvadas) • Vacunas con bactérias vivas (atenuadas) • Vacunas de última generación Vacunas contra la brucelosis animal (Período pré-genómico) VIVAS Cepa 19 – B. abortus, atenuada (Buck 1930) Vacuna M – B. suis, mucóide (King et al 1954) Vacuna Rev 1 – B. melitensis, atenuada (Elberg e Faunce Cepa 82 – B.abortus SR, atenuada (Salmakov 1960) Vacuna 104 M – B. abortus, mucóide (Shumilov et al 1984) Cepa 2 – B. suis, atenuada (Xie 1986) Cepa 5 – B. melitensis, atenuada (Lu e Zhang 1989) Cepa RB51 – B. abortus, atenuada (Schurig 1991) 1957) Vacunas contra la brucelosis animal (Período pré-genómico) MUERTAS 45/20 – B. abortus, rugosa + adjuvante (McEwan 1940) H38 – B. melitensis + formol + adjuvante (Renoux et al 1964) PB19 – Cepa 19 + anticuerpos específicos (Pilet e Bonneau 1970) Uso descontinuado: alto costo de producción, protección pobre, problemas serológicos, reacciones locales intensas Vacuna viva atenuada - cepa 19 • Reduzida virulência e estable • Protege 65-75% de las hembras Dr John M. Buck • Grado y duración de la protección terneras igual a adultas • Vacunación sola no erradica la enfermedad • Persistencia de anticuerpos es evitada con vacunación 3-8 meses • Vacunação de infectados no altera curso de la enfermedad • Vacinação previene la brucelosis clínica (aborto) • Puede provocar aborto quando usada en hembras preñes PATOGÊNICA PARA EL HOMBRE Lady Mathilda Etapas de los Programas Sanitários Prevalencia de la enfermedad Control Erradicación Vacunación y medidas de adesión voluntária Reducción progressiva de focos y de nuevos focos Zona Libre Vigilancia Epidemiologica permanente Detección y eliminación de todos los focos 10-20 Tiempo (años) 20-30 Prevalencia de Brucelosis 35,2 4,5 21,2 35,2 12,6 4,2 41,2 2,8 17,5 3,1 Rebaños positivos 30,6 8,9 4,0 0,3 2,1 9,0 15,4 Prevalencia de Brucelosis 2,5 1,4 4,4 6,2 3,4 0,7 10,2 0,14 3 1,1 7 3,5 Animales positivos 2,3 1,7 0,06 1 4,1 Bezerras vacinadas - B19 18.000.000 15.620.851 11.134.684 7.643.042 7.326.845 3.807.612 0 2.692.914 2.000.000 2.998.825 4.000.000 6.376.965 6.000.000 11.825.432 8.000.000 12.027.208 10.000.000 15.576.681 12.000.000 15.024.232 14.000.000 16.329.466 16.000.000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Vacuna RB51 B. abortus 2308 lisa rifampicina X X RB51 rugosa WboA – codifica glicosiltransferasa – responsable por la síntesis del LPS Wzt - transporte de la cadena O para la superfície R = Rough (rugosa) B = Brucella 51 = nomenclatura interna del laboratório Schurig et al 1991 Cadena Cadena - OO C19 LISA Rev 1 B.abortus B melitensis B. suis LIPID A RB51 Cadena O CORE RUGOSA MUYMuy INMUNODOMINANTE imunodominante ANTICUERPOS ANTICUERPOS poesterf@terra.com.br Resultados Table 4 - Isolation of B. abortus from RB51 vaccinated and non vaccinated animals after B. abortus 2308 challenge Isolates from cows Isolates from fetuses or calves Group Positive (%) Negative (%) Total RB51 Control Positive (%) Negative (%) Total 7 (35) 13 (65) 20 6 (30) 14 (70) 20 11 (85) 2 (15) 13 10 (77) 3 (23) 13 Infection Infección intra cellular microorganisms intra-celular Tc helps Tc RB51 Th1 INF- activa activa Th0 B IgG2a No contra cadena No contra cadena O “O” Pantanal Prevalencia muy baja ESPANHA ILHAS DOS AÇORES CHILE Vacuna C19 Vacuna RB51 1. viva, B.abortus cepa 19, lisa 1. viva, B.abortus cepa RB51, rugosa 2. hembras jovenes (3-8 meses) 2. hembras c/más de 8 meses 3. dosis 6 x 1010 s/c 3. dosis 1-3,4 x 1010 s/c 4. desventajas - respuesta serológica persistente - provoca aborto (1,4%) - riezgo humano 4. no produce anticuerpos persistentes 5. desventajas - provoca aborto (0,1%) - riezgo humano - tiempo de protección no sabido En áreas de prevalencia mediana/alta, buscar coberturas vacunales >80% con C19. Utilizar la RB51 para imunizar las hembras adultas y alcanzar buenas coberturas vacunales más rapidamente. No utilizar C19 en áreas de baja prevalencia. (Ej. Uruguay) Desestimular introducción de reproductores e IA sin cuidados sanitários, además del contacto indirecto entre hatos; secar o cercar áreas alagadizas. Corregir programa de vacunación donde comprovadamente no hubo reducción de la prevalencia. VACUNAS DE ÚLTIMA GENERACIÓN VACUNAS RECONBINANTES VACUNAS DNA VACUNAS SUB-UNIDADES VACUNAS PARTICULADAS VACUNAS RECONBINANTES (GENES DELETADOS) S19 SOD – Superóxido dismutasa – 31 kD (similar C19) VTRM1/VTRS1 – delección gene WboA de 16M y B.suis bio 4 M1-luc (INTA 2) – delección de BP26 periplásmica (similar C19) Delta OMP 25 – B. melitensis (similar a Rev 1) VACUNAS DE DNA Imunogenic protein --------- plasmid DNA expression Cu-Zn superóxido dismutasa Glyceraldeyde-3-phosphate dehydrogenase Combined SOD, ribosomal L7/L12, BCSP31 Semliki Forest (RNA virus) modified to express Brucella Cu-Zn SOD gene SYNTHETIC PARTICULATE VACCINE Delivery systems Nanoparticles – 1nm-100 nm size – mimic Ag presentation Lactococcus lactis expressing L7/L12 gene (orally) PROBLEMAS ASOCIADOS A LAS VACUNAS VIVAS Posibilidad de producir infección en el hombre Capacidad de producir aborto en hembras preñadas Limitada capacidad de prevenir infección y seronversión seguida a la exposición Limitada eficácia en otros hospederos naturales de Brucella Características de una vacuna ideal (con respecto al producto) • No inducir anticuerpos que interfieren en el diagnóstico serológico mismo cuando aplicada repetidamente. • Ser altamente atenuada, administrable en animales de cualquer edad, no provocar abortos. • Una única dosis debe inducir una imunidad fuerte y duradera. • Ser estable. • Ser de costo relativamente bajo y fácil de preparar. Características de una vacuna ideal (con respecto al sistema inmune) Buena estimulación de la inmunidad imnata (PRRs) Activación y presentación del antígeno (APCs) Inducción de respuesta tipo TH1 por células T CD4+ Buena activación/recrutamiento de células TCL CD8+ Liberación de citocinas apropriadas Generación de células de memórias adecuadas Killed bacteria or subunits vaccines = disappointing results Cuidados al aplicar vacunas vivas GRACIAS... ...POR SU ATENCIÓN!
