Clase 8 - Tolerancia a herbicidas.doc

Agrobiotecnología. Curso 2010
Tolerancia a herbicidas por ingeniería genética
Control de malezas
Transparencias 3-7
El concepto de maleza es evidentemente antrópico. Así, cualquier especie vegetal,
silvestre o cultivada, puede ser considerada como maleza en un contexto particular.
Sin embargo, hay características biológicas asociadas a las especies que son
consideradas malezas problemáticas (transparencia 4). Estas características están
relacionadas con la competitividad (rápido crecimiento inicial, resistencia a factores
detrimentales del ambiente, etc.) y a la persistencia (poblaciones grandes, dormición
de las semillas, etc.). A diferencia de otros factores que causan estrés biótico
(enfermedades y plagas), las malezas están siempre presentes y compiten con el
cultivo por recursos del ambiente. Además, pueden producir sustancias químicas que
inhiben el crecimiento de los cultivos (fenómeno conocido como alelopatía) y muchas
veces son hospedantes secundarios de insectos plaga y enfermedades. Por otra parte,
su presencia dificulta las cosechas. El impacto en el rendimiento físico de los cultivos
depende del elenco de malezas (es decir que malezas están presentes) y la densidad
de las mismas. El efecto sobre el rendimiento físico es causado principalmente por la
presencia de malezas en las primeras etapas del cultivo. Su presencia en el producto
cosechado puede afectar el precio del mismo pudiendo incluso llegar a impedir su
comercialización. La correcta identificación de las malezas presentes en un cultivo es
fundamental para encarar un control eficiente de las mismas.
Desde la domesticación de las plantas se reconoció al control de malezas como una
práctica cultural fundamental y se lo realizó en forma manual (transparencia 6). El
desarrollo de máquinas, primero traccionadas por animales y luego por tractores,
permitió la implementación del control mecánico (transparencia 7). Se puede
considerar que la etapa del control químico moderno (transparencia 7) se inició a partir
de la síntesis del ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) lograda en 1941 y su
caracterización como regulador del crecimiento vegetal. Posteriormente se descubrió
que su uso a dosis mayores podía matar plantas. Así, en 1945 se otorgó una patente
para el uso del 2,4-D como herbicida. A partir de la década del 50 se empezaron a
descubrir y a difundir otros grupos de herbicidas. El control de malezas es crítico en
los primeros estadios del cultivo.
Herbicidas
Transparencias 8-20
La incorporación del uso de herbicidas a la agricultura fue muy posterior al de otros
productos químicos como los insecticidas o los funguicidas. A pesar de ello, los
herbicidas representan hoy el biocida agrícola más vendido en los Estados Unidos
(65% de las ventas). Con la incorporación del uso de herbicidas en la agricultura nace
la Ciencia de las Malezas (en inglés, weed science). Esta puede ser considerada como
una rama de la ecología aplicada que intenta modificar el ambiente contra las
tendencias evolutivas naturales. En 1952, se creó la revista Weed Science que publica
manuscritos sobre biología, ecología, fisiología de malezas así como su manejo y
control, herbicidas y reguladores de crecimiento. El uso de herbicidas ha sido, en
buena parte, responsable del aumento de rendimiento de los cultivos. Por otra parte, al
generar un ambiente nuevo para los cultivos, esto permitió a los mejoradores
genéticos seleccionar genotipos con mayor índice de cosecha (biomasa
cosechada/biomasa total) ya que resultó innecesario obtener follajes abundantes para
competir por sombreado con las malezas. Asimismo, es interesante considerar que la
mecanización agrícola característica de la agricultura moderna (de la que forma parte
el uso de herbicidas) permite que un número de personas cada vez menor tenga a su
cargo la producción de alimentos para la totalidad de la población. Una consecuencia
directa de esto es la urbanización de la población.
Los herbicidas de contacto no se translocan en la planta (por ejemplo, glufosinato).
Los herbicidas sistémicos se translocan en la planta (por ejemplo, glifosato, 2-4,D).
Estos últimos resultan particularmente aptos para el control de malezas perennes. Los
herbicidas que se aplican al suelo tienen residualidad y se absorben por las raíces y
los tallos de plántulas en germinación. La aplicación de herbicidas post-emergentes
requiere del uso de surfactantes para mejorar el mojado de la planta. Los herbicidas
alteran diferentes procesos vitales de las plantas, muchos de los cuales ocurren en los
cloroplastos, y son generalmente de tipo específico. Por esta razón, a diferencia de lo
que ocurre con otros tipos de biocidas empleados en agricultura como los insecticidas,
los herbicidas presentan menor toxicidad para las personas y animales. El modo de
acción se refiere al proceso metabólico inhibido por un herbicida mientras que el sitio
blanco corresponde a la proteína particular con la cual interfiere el mismo. Si bien los
procesos metabólicos inhibidos por la mayoría de los herbicidas se conocen en detalle,
en general no se conoce la causa última por la cual las plantas susceptibles mueren
luego de su aplicación. Las transparencias 11 y 12 muestran una clasificación de los
principales herbicidas de acuerdo con su modo de acción y/o sitio blanco. Los
herbicidas reciben un nombre común, uno químico y diferentes nombres comerciales
(que pueden corresponder a formulaciones diferentes).
Ejemplos:
Nombre común
nombre químico
nombres comerciales
glifosato
N-( fosfonometil)glicina
Round up
atrazina
6-cloro-N-etil-N’-(1-metiletil)-1,3,5triazina-2,4-diamina
Attrex, Gesaprim
fosfinotricina o glufosinato ácido 2-amino-4-(hidroximetilfosfinil) butanoico
Basta, Liberty
La clasificación de los herbicidas no es una cuestión sencilla ya que no hay una
relación simple entre la estructura química de los mismos y su acción bioquímica. Así,
herbicidas que pertenecen a la misma familia química pueden tener modos de acción
diferentes. Por ejemplo, dentro de la familia de las piridazinonas, el pirazon es un
inhibidor fotosintético mientras que el norflurazon es un inhibidor de la síntesis de
carotenoides. Cabe asimismo aclarar que hay herbicidas cuyo modo de acción no ha
sido aún determinado.
La selectividad es un aspecto fundamental para la utilización de herbicidas en
agricultura, ya que resulta necesario que el cultivo no se vea afectado por el mismo
(transparencia 13). No sucede lo mismo en otros usos como puede ser la aplicación en
banquinas o vías de ferrocarril. En este sentido, es importante considerar que la
selectividad basada en mecanismos bioquímicos es mucho más efectiva que la
selectividad física, que se ve afectada por una serie de cuestiones circunstanciales
(viento, regulación de las pulverizadoras, etc.) que pueden tener consecuencias
fitotóxicas para el cultivo.
La selectividad bioquímica implica la existencia de una base genética para la misma.
Así, si bien la mayoría de los herbicidas son compuestos sintéticos, es decir no
naturales, los productos de los genes de resistencia a herbicidas, que son la base de
la selectividad bioquímica, sí lo son. Una consecuencia de esto es la existencia de
variabilidad genética para el carácter “respuesta a un herbicida” que se verifica tanto
entre como dentro de especies cultivadas. Esta situación también se observa en las
malezas y constituye el fundamento de la selección de biotipos de malezas con
resistencia herbicidas particulares. La transparencia 14 ejemplifica un caso de esta
variabilidad natural. La tabla de la transparencia 20, amplía la información para
abarcar otros compuestos.
El metabolismo de los xenobióticos puede ser dividido en tres fases (transparencia
16). La fase I comprende las reacciones iniciales que pueden ser de oxidación,
reducción o hidrólisis. La fase II corresponde a la conjugación primaria con sustratos
endógenos tales como azúcares, aminoácidos o glutatión. La fase III corresponde a
conjugación secundaria, formación de residuos insolubles o secuestro en la vacuola.
Los microorganismos son capaces de usar los xenobióticos como fuente de carbono o
energía. Por el contrario las plantas superiores y los animales han desarrollado
sistemas de detoxificación que permiten su eliminación. Los mamíferos efectuan, en
forma rápida y localizada (en el hígado), las dos primeras fases descriptas y excretan
del cuerpo los metabolitos producidos. Las plantas deben modificarlos y convertirlos
en compuestos no tóxicos que almacenan en la vacuola o exportan al apoplasto. El
maíz es resistente a la atrazina por detoxificación vía glutatión-S-transferasas.
Compuestos denominados antídotos o safeners son ampliamente utilizados en
monocotiledóneas para incrementar el control selectivo de malezas con herbicidas.
Esto se logra tratando el cultivo con estos compuestos cuyo efecto es la inducción de
enzimas responsables de la degradación de herbicidas (citocromo P450 oxigenasas,
glutatión-S-transferasas y glucosil transferasas) protegiendo al cultivo del daño por el
herbicida. Excepcionalmente, se produce la activación metabólica de un herbicida. Un
ejemplo clásico es el los ácidos fenoxibutíricos como el 2,4-DB. En la mayoría de las
plantas, éste se convierte en 2,4-D por β-oxidación (recordar que este último
compuesto tiene acción herbicida en dicotiledóneas). Las leguminosas no realizan esta
activación (o lo hacen muy lentamente) por lo cual se puede usar el 2,4-DB en este
grupo de plantas para el control selectivo de malezas de hoja ancha.
El metabolismo del herbicida puede estar dado por una enzima capaz de detoxificar el
mismo antes de que este actúe. Un grupo de estas enzimas son las citocromo P450
monooxigenasas (P450s). La forma en que las P450 inhiben la acción de los
herbicidas es insertando un átomo de oxígeno en moléculas hidrofóbicas (en este caso
herbicidas) transformándolas en moléculas hidrosolubles y por lo tanto de más fácil
extracción (transparencias 17 y 18).
Aplicaciones biotecnológicas al control de malezas
Transparencias 21-24
Es muy importante destacar que las aplicaciones biotecnológicas al control de malezas
no se limitan a la obtención de plantas transgénicas con resistencia herbicidas
(transparencia 22). Así, la aplicación de marcadores moleculares tiene gran
importancia para la correcta identificación taxonómica de malezas y para el
conocimiento de las relaciones genéticas entre poblaciones, el estudio del modo de
reproducción y del flujo de genes con plantas cultivadas. Los recientes avances en la
caracterización funcional de genomas vegetales están encontrando creciente
aplicación en este campo. La genómica funcional permite identificar genes cuyas
formas mutantes son letales, constituyendo éstos blancos ideales para su inhibición
por un herbicida. Por otra parte, la utilización de microarreglos permite estudiar a nivel
genómico los efectos de “herbicidas candidato” sobre la expresión génica. Estos datos
deben ser luego confirmados en estudios proteómicos. Es interesante destacar que
técnicas simples, como la selección in vitro y la mutagénesis, han permitido el
aislamiento de mutantes con resistencia a herbicidas con buena expresión a campo y
que, en varios casos, se ha alcanzado el nivel de la utilización comercial.
La transparencia 23 enumera los objetivos que generalmente se priorizan al
desarrollar cultivos tolerantes a herbicidas. Estos objetivos dan un marco de referencia
para encarar el desarrollo de cultivos con resistencia a un herbicida Es importante
comprender que existen diferentes problemas de malezas en cultivos particulares no
resueltos aún y que se trata de una situación dinámica, ya que las malezas
evolucionan permanentemente en respuesta a las prácticas de control empleadas por
los agricultores. El desarrollo de cultivos tolerantes debe privilegiar la utilización de
herbicidas con menos efectos deletéreos para el medio ambiente.
El descubrimiento de nuevos herbicidas no es una tarea sencilla ni económica. Esta
tarea ha sido tradicionalmente desarrollada mediante el ensayo de compuestos
desarrollados por síntesis química. Estos se prueban sobre malezas y cultivos
particulares. Aquellos compuestos promisorios deben ser analizados desde un punto
de vista toxicológico. Para tener alguna oportunidad de ser comercializados, deberán
tener buena actividad biológica contra un amplio espectro de malezas, ser no tóxicos
para cultivos, mamíferos e invertebrados, tener poca residualidad en el suelo y un
costo de producción favorable. En este contexto, el desarrollo de cultivos con
resistencia a los herbicidas no selectivos ya existentes, parecía una opción interesante
para ser explorada por la industria agroquímica respecto al desarrollo de nuevos
herbicidas. Debe remarcarse que esto implica un cambio de paradigmas tecnológicos:
antes, se desarrollaban herbicidas para su uso en cultivos particulares; ahora, se
modifican genéticamente los cultivos para favorecer el uso de herbicidas particulares.
Cultivos resistentes a herbicidas
Transparencias 25-68
Es interesante notar que la obtención de plantas transgénicas con resistencia a
herbicidas tuvo un rol fundacional en el desarrollo de la ingeniería genética en plantas.
Como consecuencia de ello, el primer cultivo transgénico con impacto agronómico fue
la soja con resistencia al glifosato que se liberó comercialmente en los Estados Unidos
en 1995.
La transparencia 27 muestra las rutas metabólicas involucradas en la toxicidad de
algunos herbicidas de gran impacto económico. Otros blancos importantes involucran
a varios componentes que participan del transporte de electrones en la cadena
fotosintética. La transparencia 28 enumera las principales estrategias seguidas para
desarrollar resistencia en cultivos agronómicos mediante técnicas de ingeniería
genética. Cabe mencionar que de las estrategias mencionadas sólo la segunda y la
tercera han producido aplicaciones comerciales.
Además de participar de la síntesis de proteínas, los aminoácidos aromáticos actúan
en las plantas como precursores de numerosos compuestos. Así, alrededor del 20%
del carbono fijado fluye a través de la ruta del shikimato, llevando a la formación de
tirosina, fenilalanina y triptofano, los que sirven de precursores a una vasta gama de
metabolitos secundarios como la lignina, los flavonoides y los alcaloides. La inhibición
de la 5-enolpiruvil shikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) por parte del glifosato
produce clorosis y seguida de necrosis apical y, finalmente, de la muerte lenta de la
planta tratada, no resultando claro cual de todos los procesos afectados es
responsable de esto (transparencia 30). Como la ruta del shikimato está ausente en
mamíferos, la EPSPS es un blanco atractivo para el desarrollo de nuevos agentes
antimicrobianos con acción sobre patógenos bacterianos, fúngicos y parásitos. Así, se
ha demostrado que el glifosato inhibe el crecimiento de parásitos como Plasmodium
falciparum y Toxoplasma gondii. La EPSPS es codificada en plantas por un gen
nuclear cuyo producto activo se localiza en los plástidos.
El cultivo de células fue una herramienta clave en el estudio del mecanismo de acción
del glifosato. Experimentos de selección in vitro realizados con bacterias y plantas
demostraron que el efecto inhibitorio causado por el glifosato podía ser superado si se
adicionaban al medio de cultivo los aminoácidos aromáticos fenilalanina, tirosina y
triptofano. Esto orientó la búsqueda de la enzima inhibida por este herbicida a la ruta
biosintética correspondiente a estos compuestos y experimentos posteriores señalaron
a la EPSPS como blanco de acción de este herbicida (transparencia 32). La EPSPS es
la enzima mejor estudiada de la vía del shikimato. Se ha determinado por cristalografía
de rayos X la estructura del complejo ternario EPSPS/S3P/glifosato en Escherichia
coli.
El gen que codifica la EPSPS se clonó inicialmente en bacterias y se demostró que el
incremento de su expresión, logrado mediante la localización del mismo en un
plásmido multicopia, confiere resistencia al herbicida (transparencia 36). Asimismo, se
demostró en varias especies vegetales (zanahoria, petunia, tabaco, alfalfa y soja) que
la selección gradual con glifosato en cultivos celulares permite obtener líneas celulares
con resistencia al herbicida mediada por un proceso de amplificación génica. Cuando
se comenzaron a expresar secuencias de EPSPS de origen bacteriano resistentes al
glifosato en plantas transgénicas, se comprobó la importancia de dirigir correctamente
el producto del transgen dentro de la célula. Dada la localización plastídica de la
EPSPS en plantas, resultó claro la necesidad de introducir las secuencias de péptidos
señal apropiados en las construcciones genéticas para lograr el efecto fenotípico
deseado.
Se observó que el glifosato es rápidamente degradado por bacterias del suelo
(transparencia 38). El catabolismo de este herbicida puede producirse por la ruta de la
C-P liasa (observada en Pseudomonas sp.) o por la del ácido aminometilfosfónico
(AMPA). Esta última es la vía más frecuente y ha sido identificada en bacterias Gram
positivas y negativas. Estas reacciones no se producen en plantas superiores. Cabe
notar que se ha estudiado extensamente el efecto del glifosato, del AMPA y del
Roundup® sobre la salud humana, concluyéndose que el uso de este herbicida no
presenta ningún potencial para producir efectos adversos sobre la misma.
Para mayor información sobre los genes mencionados en la diapositiva 39 ver Barry et
al. (1992). Es interesante mencionar que, en términos generales, la utilización del gen
cp4 epsps ha resultado más eficiente que la del gen gox. Se ha observado en varios
casos que la expresión de este último gen en presencia del herbicida está asociada a
síntomas que sugieren fitotoxicidad de los productos de degradación. A partir de 1997,
se ha detectado la aparición de resistencia al glifosato en malezas. El análisis
molecular de la resistencia ha sido realizado en biotipos resistentes de la maleza
Eleusine indica encontrados en Malasia. Los estudio realizados permitieron identificar,
por primera vez en plantas, mutaciones puntuales en el gen que codifica para la
EPSPS que explicarían, al menos parcialmente, la resistencia observada.
La transparencia 40 muestra un esquema del mecanismo de resistencia operante en
cultivos transgénicos transformados con un gen de EPSPS resistente al glifosato. Es
importante notar que las plantas transgénicas como la ejemplificada en la
transparencia son heterocigotos funcionales para el gen de resistencia ya que
expresan tanto la forma resistente como la sensible de la proteína blanco del
herbicida. Esto puede afectar negativamente el nivel de resistencia en comparación
con mutantes homocigotas para la forma resistente.
La descripción de las construcciones mencionadas en la transparencia 41 es parcial,
ya que se ha omitido información sobre la región regulatoria en el extremo 3‘. Es
interesante notar que a pesar de que todas ellas se basan en la secuencia codificante
cp4 epsps, hay importantes variaciones entre las mismas. El sentido de éstas es
optimizar la expresión de los transgenes de modo de proporcionar a la planta
transgénica que las contiene, un nivel de resistencia al herbicida que sea útil
agronómicamente. Esto implica que el cultivo no es dañado por dosis del herbicida que
permiten un control eficiente de las principales malezas del cultivo.
En la Argentina la soja transgénica con resistencia a glifosato se incorporó a la
producción en la campaña 96/97. Este tipo de cultivar de soja es ideal para ser usado
en combinación con técnicas de siembra directa (transparencia 42). La siembra directa
es una práctica agrícola que, al no realizarse labranzas, permite mejorar la
conservación del suelo. En este contexto, la utilización de herbicidas es fundamental
para el control de malezas. La asociación soja transgénica/siembra directa permitió un
crecimiento acelerado de la superficie sembrada con este cultivo en Argentina. Así, se
pasó de un área sembrada de alrededor de 5 millones de ha, a superar actualmente
los 14 millones de ha, convirtiéndose en el cultivo más sembrado del país. Más del
90% del área sembrada corresponde a soja transgénica. Es interesante mencionar la
expansión del cultivo hacia provincias extra-pampeanas en zonas anteriormente
consideradas como marginales por razones agroecológicas. Es de notar que se trata
de un único evento transgénico que ha sido eficientemente incorporado a fondos
genéticos adaptados a las condiciones locales y de diferentes grupos de madurez,
aspectos que han favorecido su difusión. En 2004, las autoridades argentinas
autorizaron la introducción del maíz resistente a glifosato.
El glufosinato es un análogo del ácido glutámico que se obtiene por síntesis química y
es una mezcla racémica de la cual sólo el isómero L es biológicamente activo
(transparencia 43). El bialafos se obtiene por fermentación de Streptomyces
hygroscopicus y es uno de los pocos ejemplos de herbicidas naturales actualmente en
uso comercial. La asimilación primaria comprende el amonio originado a partir del
nitrato absorbido del suelo por las raíces. La asimilación secundaria comprende la
reasimilación del amonio libre que se forma en la planta, como consecuencia de
procesos tales como la deaminación de aminoácidos, la fotorrespiración, etc.
En plantas tratadas con glufosinato, la inhibición de la reacción que produce glutamina
a partir del glutamato conduce a una rápida acumulación de amonio (transparencia
44). Además, la fotosíntesis y la síntesis de proteínas decrecen. El conjunto de estos
procesos producen la muerte de la planta unos pocos días luego del tratamiento.
Experimentos de selección in vitro de células de alfalfa tratadas con glufosinato
permitieron obtener células resistentes a este herbicida debido a una mayor expresión
de glutamina sintetasa (GS) producida por amplificación génica. Posteriormente, se
obtuvieron plantas transgénicas de tabaco que sobreexpresaban en forma constitutiva
una secuencia codificante de GS proveniente de alfalfa. Como se observa en la
transparencia 47, estas plantas fueron más resistentes al herbicida que plantas no
transgénicas. Sin embargo, el nivel de resistencia alcanzado no fue suficiente para su
utilización agrícola.
Dos grupos de trabajo clonaron en forma independiente los genes bar y pat. Estos
tienen un 87% de homología a nivel de nucleótidos y codifican para la enzima
fosfinotricin-acetil transferasa
El uso del glufosinato como herbicida se ha visto limitado por su costo. Es interesante
notar que no se ha comunicado la aparición de biotipos de malezas con resistencia al
glufosinato. No se espera la aparición de resistencia en malezas debido a la presencia
de una forma de la glutamina sintetasa insensible al mismo, ya que como el herbicida
se une al sitio de unión del glutamato a la enzima, se considera que una mutación que
disminuya la afinidad de la enzima por el herbicida, afectará en forma significativa su
actividad catalítica, esencial para la vida de la planta. Considerando la ya mencionada
poca efectividad obtenida por la sobrexpresión de una forma insensible de esta
enzima, tampoco se considera que pueda desarrollarse resistencia a este herbicida
por amplificación génica.
La transparencia 51 muestra un ejemplo de los primeros ensayos de campo realizados
por Plant Genetics System, empresa desarrollada a partir de la Universidad de Ghent,
Bélgica. En ellos, aplicando dosis agronómicas de glufosinato, se comparaban plantas
transgénicas que expresaban en forma constitutiva el gen bar con controles no
transgénicos. Los ensayos permitieron confirmar que el glufosinato puede ser utilizado
como herbicida post-emergente selectivo en cultivos transgénicos. Esta prueba de
concepto permitió el posterior desarrollo de cultivos comerciales basados en esta
estrategia. La transparencia 53 ilustra un ensayo de resistencia a glufosinato realizado
con plantas de Solanum tuberosum (var. Spunta) transformadas con el gen bar. Las
plantas fueron tratadas con el equivalente a 1,8 Kg/ha del herbicida.
Los inhibidores de la acetolactato sintetasa (ALS), una enzima clave de la síntesis de
aminoácidos ramificados, se han difundido debido a que presentan varias ventajas: a)
se utilizan en dosis muy bajas; así, mientras que para la mayoría de los herbicidas se
usan dosis de 1-2 kg de principio activo/ha, los de este grupo se utilizan en dosis que
pueden llegar a 2 gramos/ha; b) son de amplio espectro; c) tienen actividad residual en
el suelo; d) permiten una amplia ventana de aplicación y buen margen de seguridad
para el cultivo; e) presentan baja toxicidad para mamíferos (transparencia 54).
La ALS es un blanco muy particular ya que es inhibida por herbicidas que pertenecen
a grupos con diferente estructura química. La transparencia 55 ilustra las estructuras
químicas de dos herbicidas que inhiben la actividad de ALS. Cada uno de ellos
corresponde a un grupo diferente.
La expresión de ALS es necesaria siempre que haya síntesis de proteínas, por ello
esta enzima se expresa a lo largo del ciclo de vida de la planta. Como se muestra en
la transparencia 57, ALS cataliza el primer paso de las dos ramas de la biosíntesis de
aminoácidos ramificados, proceso que en las plantas se localiza en los cloroplastos.
Los herbicidas que inhiben la ALS afectan ambas ramas. Estos se unen a dominios de
la ALS que no corresponden al sitio catalítico. Como consecuencia de esto pueden
presentarse mutaciones de punto que afecten la unión de un herbicida a la ALS sin
modificar su actividad catalítica.
Las malezas parásitas son un problema importante aún no resuelto en varios
agroecosistemas (transparencia 58). Un ejemplo de ello son Striga hermonthica y S.
asiatica que producen muy importantes pérdidas en el África sub-sahariana. Estas
malezas afectan varios cultivos en zonas donde se concentran los agricultores más
pobres. Entre los mismos se encuentra el maíz, que en esa región es un componente
importante de la dieta humana. El daño al maíz es producido por estas malezas a
través de fitotoxinas antes de su emergencia del suelo. Por otra parte, en esta región
se suele inter-sembrar leguminosas de grano en el cultivo de maíz; por ello la
aplicación de herbicidas para el control de Striga se hace difícil. Se ha demostrado
recientemente que, usando variedades maíz resistentes a imidazolinonas obtenidas
por cultivo in vitro, se puede tratar la semilla con pequeñas cantidades de
imidazolinonas, lo que produce un control muy efectivo y económico de estas malezas
sin afectar al cultivo acompañante.
Se ha descripto en malezas varias sustituciones de aminoácidos que convierten a la
ALS sensible a herbicidas en una forma de la enzima resistente a por lo menos un
herbicida (transparencia 59). Los aminoácidos conservados sustituidos y sus
posiciones son: a) Alanina 122; b) Prolina 197; c) Alanina 205; d) Triptofano 574; e)
Serina 653. Los números de aminoácido corresponden a la proteína completa de
Arabidopsis thaliana. El laboratorio de Patrick Granel, en la Universidad de Illinois, se
han caracterizado las sustituciones aminoacídicas observadas en cada especie de
malezas así como la resistencia que confiere la mutación en cuestión a diferentes
grupos de herbicidas que inhiben la ALS.
Algunos herbicidas no afectan determinados cultivos porque estos no poseen el sitio
blanco del mismo. Este es el caso de los arilfenoxipropionatos y las
ciclohexanodionas. Estas familias de herbicidas tienen como sitio blanco la enzima
acetil-CoA-carboxilasa. Esta enzima cataliza el primer paso en la síntesis de ácidos
grasos que tiene lugar en los cloroplastos. Las plantas presentan dos formas
diferentes de esta enzima: una forma homodimérica localizada en el citosol y
denominada eucariótica por su similitud a la observada en animales y una forma
heteromérica formada por cuatro subunidades localizada en los plástidos y
denominada procariótica por su parecido a la enzima bacteriana. Las poáceas
constituyen una excepción ya que presentan sólo la forma eucariótica de la enzima y,
debido a ello, son susceptibles a los herbicidas mencionados, los que inhiben
específicamente la forma homodimérica de la enzima. Han sido descriptos más de 280
biotipos correspondientes a 171 especies de malezas (tanto mono como
dicotiledóneas) con resistencia a herbicidas en agroecosistemas con una historia de
reiterado uso de herbicidas. En la mayoría de los casos la resistencia que surge en las
malezas se debe a alteraciones en el sitio blanco del herbicida y se conocen ejemplos
para la mayoría de los sitios blanco conocidos.
La atrazina (transparencia 63) es el herbicida más utilizado en USA (27000 toneladas
en cultivos como maíz, sorgo y caña de azúcar). Se usa, además, en otros 80 países.
El primer caso problemático de resistencia a herbicidas en malezas fue el de las
triazinas, el cual ha sido reportado reiteradamente a partir de 1968 (transparencias 64
y 65). Las bases moleculares de este fenómeno fueron extensamente estudiadas y en
la mayoría de los casos la resistencia se debió a la presencia de la mutación puntual
descripta en la transparencia. Se transfirió la resistencia de malezas a algunos
cultivares de colza por cruzamiento. Nótese que la colza con resistencia a atrazina que
aparece en la transparencia deriva del trabajo citado. Cabe destacar que el trabajo que
se menciona en las transparencias fue el primero en que se obtuvieron
experimentalmente plantas con tolerantes a la atrazina en una especie de importancia
agronómica. Nótese que no se trabajó con mutágenos sino que se utilizó un genotipo
con inestabilidad genética a nivel del plastoma. Es interesante mencionar que la
inversión de recursos económicos motivada por el atractivo comercial que tienen los
herbicidas llevó a una fuerte relación bidireccional entre la ciencia de las malezas y la
biología molecular. Esto impulsó importantes avances en el conocimiento básico en
ciencias vegetales y otras áreas.
Los hidroxibenzonitrilos son inhibidores del fotosistema II en especies dicotiledóneas.
Por esta razón, cuando se aplican sobre dicotiledóneas resistentes a los mismos, se
suele incluir un herbicida de acción graminicida, de modo de ampliar el espectro de
control de malezas. Se obtuvieron plantas transgénicas de algodón, colza y tabaco
que expresan una secuencia codificante de una nitrilasa de Klebsiella pneumoniae. -
Estas plantas son resistentes a campo a los herbicidas ioxynil y bromoxynil y han sido
liberadas comercialmente en algunos países (transparencia 67).
Además del caso de resistencia a glufosinato por detoxificación ya presentado, se ha
explorado la utilización de otros genes bacterianos que producen la detoxificación de
distintos herbicidas (transparencia 68). Sin embargo, debe destacarse que ninguno de
los ejemplos mencionados en la transparencia, ha tenido difusión comercial. Por otra
parte, un interesante avance conceptual logrado con este tipo de genes es la
aplicación de técnicas de evolución molecular dirigida. Esta permite obtener, por
recombinación in vitro, genes que codifican enzimas con propiedades cinéticas
mejoradas, así como modificaciones que mejoran la especificidad de sustrato. De esta
forma, a partir de dos genes de Pseudomonas sp. relacionados que codifican enzimas
degradativas de algunas triazinas, se logró la obtención de enzimas con un mayor
rango de sustratos (es decir que degradan triazinas no degradadas por las formas
parentales) y mayor velocidad de degradación.
Si bien no hay todavía aplicaciones comerciales de transgenes eucarióticos que
confieran resistencia herbicidas, se considera que éstos tienen un interesante
potencial, tanto para el desarrollo de cultivos con resistencia a herbicidas, como para
fitorremediación de suelos contaminados por herbicidas. Se considera que el avance
en los estudios genómicos en plantas tendrá un notable impacto en la disponibilidad
de genes para tal propósito. Es interesante considerar que los genes candidatos
considerados (codificantes de glutatión-S-transferasas, glicosil transferasas y
citocromo P 450 oxigenasas) forman familias multigénicas compuestas por un
importante número de miembros. Por ejemplo, la familia de las citocromo P 450
oxigenasas está compuesta por 272 genes en el genoma de Arabidopsis thaliana
(especie con genoma poco redundante), constituyendo la mayor familia génica
descripta hasta ahora en plantas. Esta situación tiene como consecuencia la
disponibilidad de una interesante variabilidad de genes candidato.
Consideraciones sobre el uso de cultivos / herbicidas
Transparencias 70-73
Es importante definir criterios para elegir en qué especies y para qué herbicidas es
conveniente desarrollar, mediante técnicas biotecnológicas, cultivos con resistencia a
herbicidas (transparencia 71). Para mayor información sobre el contenido de esta
transparencia, ver Gressel (1993). Si bien no se ha observado la transferencia de
resistencia a herbicidas de cultivos a malezas, éstas han demostrado la posibilidad de
evolucionar permanentemente frente a las diferentes prácticas de control de malezas
implementadas por los agricultores, entre ellas la utilización de herbicidas. En este
contexto, resulta importante destacar que hay una serie de prácticas de manejo
agronómico que colaboran a reducir la presión de selección sobre las malezas ya que
producen cambios en el ambiente en que éstas crecen (ejemplos, rotación de cultivos,
mejorar la habilidad competitiva del cultivo). Es asimismo importante el monitoreo de
las poblaciones de malezas para un rápido reconocimiento y caracterización de los
biotipos resistentes que puedan aparecer.
La transparencia 72 enumera los principales criterios a considerar para evitar el
surgimiento de resistencia en malezas. Actualmente se cultivan en Canadá varios tipos
diferentes de cultivares transgénicos de colza. Por ejemplo, además de las variedades
convencionales, hay variedades con una composición particular de ácidos grasos (bajo
contenido de ácido linolénico) y variedades con resistencia a herbicidas (bromoxinil,
glufosinato, glifosato, inhibidores de la ALS). Considerando que la colza es una
especie con un 30% de alogamia, pueden producirse cruzamientos entre diferentes
tipos de variedades. Por otra parte, las semillas de colza que caen durante la cosecha,
pueden mantenerse en el suelo, germinando varios años más tarde, convirtiéndose así
en plantas voluntarias. Esto es importante, no sólo en cultivos que tienen por finalidad
la producción de semilla, sino también en cultivos comunes. La presencia de plantas
voluntarias puede tener impacto negativo tanto en el aspecto comercial como en el
agronómico. En la Unión Europea, cuando los cultivares de colza con bajo contenido
de ácido erúcico y de glucosinolatos reemplazaron a los tradicionales (con alto
contenido de ambas sustancias) a comienzos de los 90, hubo problemas comerciales
debido a la presencia de plantas voluntarias de tipo tradicional. Por otra parte, en los
últimos años se han detectado en Canadá plantas voluntarias de colza con resistencia
múltiple a herbicidas (glifosato, glufosinato e imazethapyr, un miembro de la familia de
las imidazolinonas). Las dos primeras resistencias mencionadas derivaron de
cultivares transgénicos, y la tercera, de un cultivar obtenido por mutagénesis. Este
problema está siendo controlado utilizando varias estrategias entre las cuales vale la
pena mencionar el uso del herbicida 2,4-D y la rotación con otros cultivos.
Las plantas transgénicas actualmente cultivadas comercialmente, en su mayoría
resistentes a herbicidas, pueden ser consideradas de manera similar a lo que fue el
Ford T en la historia del automóvil. Si lo contemplamos con ojos actuales, este modelo
poseía un bajo desempeño; sin embargo fue un adelanto importantísimo que cambió la
historia del transporte y permitió la notable evolución que alcanza actualmente la
industria. De un modo similar las actuales plantas transgénicas nos permiten ganar
experiencia y acumular el conocimiento necesario para desarrollar nuevas y mejores
generaciones de productos.
La transparencia 73 presenta algunos de los enfoques que pueden utilizarse para
mitigar la introgresión de genes de tolerancia a herbicidas desde cultivos a malezas.
La apomixis implica la producción de semilla no sexual por lo que la contención
biológica de cualquier transgen, en general, y de uno de resistencia a herbicidas, en
particular, es total. La selección de eventos de transformación ausentes en las
malezas se puede utilizar en cultivos poliploides como el trigo y la colza. En estos
casos, no todos los genes del cultivo pueden recombinar con los de las malezas. La
localización de un transgen en el plastoma puede facilitar su contención ya que en
muchas especies vegetales la transmisión de los plástidos es uniparental y materna.
Sin embargo, aún en esos casos, hay algo de transmisión de plástidos por el polen,
por lo cual la limitación al flujo génico con malezas no es total. La utilización de
construcciones en tandem se basa en: a) los genes que integran este tipo de
construcción están ligados en forma prácticamente completa por lo que no segregan;
b) hay genes (por ejemplo, los que controlan el enanismo) que pueden ser neutrales
para un cultivo y deletéreos para sus malezas y; c) debido a que las malezas se
desarrollan en un ambiente extremadamente competitivo, cualquier desventaja
selectiva las afecta seriamente. Se ha demostrado que es posible lograr resistencia al
glifosato a través de trans-splicing de proteínas mediado por inteínas. De esta forma,
se obtuvieron plantas de tabaco transformadas a nivel nuclear con el extremo 5’ de
una secuencia codificante de una EPSPS bacteriana resistente al glifosato dirigida al
cloroplasto, y con el resto de la secuencia de EPSPS integrada a nivel del plastoma.
Estas plantas expresaron una proteína EPSPS funcional y resistieron al glifosato en
ensayos de laboratorio.
La ingeniería genética ha sido utilizada para reducir notoriamente el uso de biocidas
como insecticidas y funguicidas, pero éste no ha sido el caso para los herbicidas
(transparencia 74). Sin embargo, se han desarrollado algunas estrategias que pueden
hacer un gran aporte en esta dirección. Los biocontroladores se refieren a hongos o
insectos que pueden atacar especies particulares de malezas. La aplicación de los
mismos se ve frecuentemente limitada por su falta de efectividad. Amsellem et al.
(2002) han demostrado que se puede incrementar, mediante técnicas de ingeniería
genética, la fitotoxicidad de un micoherbicida. La alteración de la virulencia mediante
esta estrategia requiere considerar el uso de mecanismos de seguridad que eviten la
diseminación de este tipo de genes. La mayor expresión de sustancias alelopáticas
podría hacer más competitivos a los cultivos frente a las malezas. Los cultivos de
cubierta tienen como fin mantener el campo libre de malezas. Una idea posible es
expresar transgenes que bajo ciertas condiciones ambientales produzcan la muerte
del cultivo de cubierta. Cabe notar que estas líneas de investigación están poco
desarrolladas y es necesario avanzar en muchos aspectos básicos como para que
éstas conduzcan a productos comerciales. Considerando que éstas no permiten
prever beneficios económicos a corto plazo, resulta fundamental el desarrollo de
investigaciones en estas temáticas en el sector público.