Capítulo 4 Cartografía de cromosomas eucarióticos mediante recombinación TEXTO Preguntas claves ¿Qué procesos celulares producen la recombinación de genes ligados? ¿Qué frecuencias de recombinantes indican que existe ligamiento? ¿Cómo se puede generar un mapa cromosómico a partir del análisis de las frecuencias de recombinantes? ¿Cómo se utilizan conjuntamente los mapas de recombinación y los mapas físicos del DNA? Esquema 4.1 Diagnóstico del ligamiento 4.2 Cartografía mediante frecuencias de recombinación 4.3 Cartografía con marcadores moleculares 4.4 Cartografía del centrómero mediante tétradas lineales 4.5 Uso de la prueba de chi-cuadrado para el análisis de ligamiento 4.6 Uso de la puntuación Lod para estimar el ligamiento en genealogías humanas 4.7 Estima de los entrecruzamientos múltiples no observados 4.8 Utilización conjunta de los mapas de recombinación y los mapas físicos 1 Algunas de las preguntas que los genetistas quisieran responder acerca del genoma son: ¿Qué genes están presentes en el genoma? ¿Qué funciones desempeñan? ¿Cuál es su posición en los cromosomas? La respuesta a la tercera pregunta planteada se conoce como cartografía genética. La cartografía es el tema principal de este capítulo; sin embargo, como veremos más adelante, las tres preguntas están interrelacionadas. La importancia de los mapas en general es evidente, pues los hemos utilizado en muchos momentos de la vida para orientarnos. Es relevante en el contexto de este capítulo el que en ciertas situaciones se deban utilizar varios mapas al mismo tiempo. Un buen ejemplo de la vida cotidiana es cuando se transita entre las calles y edificios de una ciudad como Londres. Se necesita un mapa de calles donde se muestre el trazado general de las calles. Sin embargo, el mapa de calles es usado tanto por turistas como por londinenses, junto al mapa del sistema de transporte subterráneo ferroviario. El sistema de transporte subterráneo es tan complejo, algo así como espaghettis, que Harry Beck, un ingeniero de circuitos eléctricos, desarrolló en 1933 un mapa esquemático (aunque distorsionado) que hasta la fecha permanece como un icono PAGINA 129 ______________________________________________________________________ PÁGINA 130 de Londres. En la Figura 4-1 se comparan los mapas de calles y del transporte subterráneo de Londres. Observe que la posición de las estaciones del tren subterráneo y las distancias exactas entre éstas no son importantes, excepto como una manera de llegar a un destino de interés como podría ser la Abadía de Westminster. Veremos este paralelo entre los mapas de Londres con los mapas cromosómicos que se utilizan para dirigir la atención a un lugar particular del genoma o a genes específicos. Primero, con 2 frecuencia son necesarios mapas cromosómicos de distinto tipo y se deben usar conjuntamente. Segundo, los mapas que contienen distorsiones también son útiles. Tercero, muchos sitios de un mapa cromosómico están posicionados solamente porque son útiles para aproximarse a otros sitios que son los que en realidad interesan. La elaboración de un mapa con la posición de los genes en los cromosomas ha sido un esfuerzo que ha mantenido ocupado a miles de genetistas durante los últimos 80 años. ¿Por qué es tan importante este objetivo? Hay varias razones: 1. La posición del gen es una información crucial y necesaria para construir genotipos complejos que se requieren para propósitos experimentales o en aplicaciones comerciales. Por ejemplo, en el Capítulo 6 veremos casos en los que ciertas combinaciones alélicas especiales deben ponerse juntas para explorar la interacción génica. 2. El conocimiento de la posición que ocupa un gen es el punto de partida para comprender su estructura y función. La posición de un gen se puede utilizar para definirlo en el nivel del DNA. A su vez, la secuencia de DNA de un gen tipo salvaje o de un alelo mutante también es una información necesaria para deducir su función subyacente. 3. Los genes existentes y el orden en que están dispuestos en los cromosomas suelen diferir ligeramente entre especies relacionadas. Por ejemplo, uno de los cromosomas humanos mayores (el número 2), está partido en dos cromosomas pequeños en los grandes simios. Los genetistas comparan estas diferencias para inferir los mecanismos genéticos evolutivos mediante los cuales estos genomas han divergido. Por lo tanto, los mapas cromosómicos también son útiles para interpretar algunos mecanismos de la evolución. 3 PAGINA 130 ______________________________________________________________________ PÁGINA 131 La distribución de los genes en los cromosomas se representa mediante un diagrama similar a un mapa cromosómico unidimensional en el que se definen las posiciones génicas, conocidas como loci (locus en singular), y las distancias entre los loci en una escala determinada. En genética se utilizan normalmente dos tipos principales de mapas cromosómicos, que se elaboran con procedimientos bastantes distintos, pero se utilizan complementariamente. En los mapas basados en la recombinación, que es el tema de este capítulo, se cartografían los loci de aquellos genes que se han identificado mediante fenotipos mutantes que se heredan como un único gen. Los mapas físicos (véase Capítulo 13) muestran los genes como segmentos ordenados a lo largo de la molécula del DNA que constituye el cromosoma. Estos mapas presentan diferentes perspectivas del genoma, pero como sucede con los mapas de Londres, ambos pueden ser utilizados conjuntamente para llegar a comprender mejor la función de los genes en el nivel molecular y cómo esta función influye en el fenotipo. Mensaje Los mapas son útiles para obtener cepas, para interpretar mecanismos evolutivos y para descubrir la función desconocida de un gen. El descubrimiento de la función de un gen es más fácil cuando se integra la información de mapas de recombinación y físicos. 4.1 Diagnóstico del ligamiento 4 Los mapas de recombinación de cromosomas se elaboran generalmente con dos o tres genes a la vez, aplicando un método llamado análisis de ligamiento. Cuando un genetista afirma que dos genes están ligados, quiere decir que los loci de esos genes están en el mismo cromosoma y por tanto, los alelos de un homólogo están físicamente unidos (ligados) por el DNA entre ellos. Conocer cómo los primeros genetistas dedujeron el ligamiento es una manera útil de introducir muchas de las ideas claves y los procedimientos de este análisis. Uso de la frecuencia de recombinación para reconocer el ligamiento A principos del siglo XX, William Bateson y R. C. Punnett (a quién se debe el nombre del cuadrado de Punnett) estudiaron la herencia de dos genes en el guisante. Después de un cruzamiento entre la primera generación dihíbrida F1, la generación F2 no mostró la proporción esperada 9:3:3:1 que predice el principio de la transmisión independiente. De hecho, Bateson y Punnet observaron que ciertas combinaciones de alelos eran más frecuentes de lo esperado, como si de alguna manera estuvieran físicamente unidas; pero no tenían una explicación para este descubrimiento. Posteriormente, Thomas Hunt Morgan encontró una desviación similar de la segunda ley mendeliana cuando estudiaba dos genes autosómicos de Drosophila. Morgan propuso el ligamiento como una hipótesis para explicar el fenómeno de la aparente asociación de alelos. Observaremos algunos datos de Morgan. Uno de los genes involucrados fue el de color de ojos (pr, púrpura y pr+, rojo) y el otro el de la longitud de las alas (vg, vestigial y vg+, normal). Los alelos salvajes de ambos genes son dominantes. Morgan 5 efectuó un cruzamiento para obtener dihíbridos y luego mediante un cruzamiento prueba: P pr / pr vg / vg pr / pr vg / vg Gametos pr vg pr vg F1 dihíbrida pr /pr vg /vg Cruzamiento prueba pr+/pr · vg+/vg ♀ × pr/pr · vg/vg ♂ Hembra dihíbrida F1 Macho prueba PAGINA 131 ______________________________________________________________________ PÁGINA 132 El uso de los cruzamientos prueba de Morgan es importante. Tal como fue descrito en los Capítulos 2 y 3, el progenitor prueba contribuye solamente con alelos recesivos, luego el fenotipo de la descendencia revela directamente los alelos de los gametos del progenitor dihíbrido. Por lo tanto, el analista puede concentrarse en la meiosis de uno de los progenitores (el dihíbrido) y olvidarse de la meiosis del otro (el de prueba); a diferencia del cruzamiento estándar de la F1 entre sí, donde habría que considerar los dos conjuntos de meiosis en el análisis de la progenie: uno del progenitor macho y el otro de la hembra. Los resultados del cruzamiento prueba de Morgan fueron los siguientes (listados según las clases gaméticas del dihíbrido): pr+ · vg+ pr · vg pr+ · vg pr · vg+ 6 1339 1195 151 154 2839 Obviamente, estos números se desvían significativamente de la proporción mendeliana esperada 1:1:1:1. Las primeras dos combinaciones alélicas son muy mayoritarias, indicando claramente que ambos genes están asociados o “ligados”. Otra forma de evaluar el resultado de cruzamientos prueba es considerando el porcentaje de recombinantes en la progenie. Por definición, los dos tipos pr+· vg y pr · vg+ son los recombinantes de este cruzamiento, ya que ninguno corresponde a los dos genotipos homocigóticos de las moscas parentales originales (más específicamente a sus gametos) del dihíbrido F1. Se puede ver que los dos tipos recombinantes están en frecuencias muy similares (151 ~ 154). El total es 305, que equivale a una frecuencia de (305/2839) × 100 ó 10.7%. Con esta información se puede proponer, como hizo Morgan, que los genes están en el mismo cromosoma y por tanto las combinaciones alélicas de los progenitores se mantienen juntas en la mayor parte de la progenie. Luego la conformación alélica del dihíbrido debía ser la siguiente: pr+ pr vg+ vg En la Figura 4-2 se muestra gráficamente la tendencia de los alelos ligados a ser heredados conjuntamente. Ahora veamos otro cruzamiento realizado por Morgan utilizando los mismos alelos pero combinados de distinta manera. En este cruzamiento, cada progenitor es homocigótico para el alelo salvaje de un gen y para el mutante del otro gen. Nuevamente, las hembras de la F1 fueron sometidas a un cruzamiento prueba. 7 P Gametos pr / pr vg / vg pr / pr vg / vg pr vg pr vg F1 dihíbrida pr /pr vg /vg Cruzamiento prueba pr+/pr · vg+/vg ♀ × pr/pr · vg/vg ♂ Hembra dihíbrida F1 Macho prueba PAGINA 132 ______________________________________________________________________ PÁGINA 133 A partir del cruzamiento prueba se obtuvo la siguiente descendencia: pr+ · vg+ pr · vg pr+ · vg pr · vg+ 157 146 965 1067 2335 Nuevamente, estos resultados no están cercanos a la proporción mendeliana 1:1:1:1. Sin embargo, ahora las clases recombinantes son las contrarias a las del cruzamiento anterior: pr+ vg+ y pr vg. Pero se puede observar que su frecuencia es aproximadamente la misma: (157+146)/2335 × 100 = 12.9%. Otra vez se propone la existencia de ligamiento, pero ahora el genotipo de la F1 dihíbrida tenía que ser de la siguiente manera: pr+ vg _________ pr vg+ Resultados de cruzamientos prueba dihíbridos como el presentado aquí suelen encontrarse en la genética. En general, muestran un mismo patrón: 8 Dos clases no recombinantes de igual frecuencia que suman más del 50% y Dos clases recombinantes de igual frecuencia que suman menos del 50% Mensaje Cuando dos genes están próximos en el mismo par cromosómico (es decir, que están ligados), no segregan independientemente, y producen una frecuencia de recombinación menor del 50%. En consecuencia, una frecuencia de recombinación menor del 50% es el criterio principal para el diagnóstico de ligamiento. Los entrecruzamientos producen recombinantes en genes ligados La hipótesis de ligamiento explica porque las combinaciones de alelos de la generación parental permanecen juntas: los genes están físicamente unidos por el segmento de cromosoma entre ellos. Pero, ¿cómo se producen algunos recombinantes cuando los genes están ligados? Morgan sugirió que cuando el par de cromosomas homólogos se emparejan en la meiosis, ocasionalmente se rompen e intercambian partes, proceso al que denominó entrecruzamiento. La Figura 4-3 muestra este intercambio físico de segmentos cromosómicos. Las dos nuevas combinaciones reciben el nombre de productos del entrecruzamiento. ¿Existe algún proceso celular observable al microscopio que pueda explicar el entrecruzamiento? Cuando se emparejan los cromosomas homólogos ya duplicados en la meiosis (en términos genéticos, cuando las dos diadas se unen en un bivalente), se suele producir una estructura en forma de aspa entre las cromátidas no hermanas, que recibe el nombre de quiasma (en latín chiasma) (en plural quiasmas; en latín 9 chiasmata). En la Figura 4-4 se pueden observar quiasmas. Para Morgan, la manifestación visible del quiasma corroboró el concepto de entrecruzamiento. (Observe que los quiasmas indican que PAGINA 133 ______________________________________________________________________ PÁGINA 134 las cromátidas participan en el entrecruzamiento, y no los cromosomas sin duplicar. Volveremos a este tema posteriormente.) Mensaje En los genes ligados, los recombinantes se producen por entrecruzamiento. Los quiasmas son la manifestación visible del entrecruzamiento. Simbolismo y terminología del ligamiento El trabajo de Morgan demostró que los genes ligados de un dihíbrido pueden estar presentes en una de dos conformaciones básicas. Por un lado, los dos alelos dominantes (o los del tipo salvaje) están presentes en el mismo homólogo (Figura 4-3); esta configuración se denomina conformación cis (cis significa adyacente). Por otro lado, cuando los alelos dominantes (o los del tipo salvaje) se encuentran en diferentes homólogos, se denomina conformación trans (trans significa opuesto). Estas dos conformaciones se escriben de la siguiente manera: Cis Trans AB/ab ó ++/ab Ab/aB ó b/a+ 10 Tenga en cuenta las siguientes convenciones que se refieren al simbolismo de ligamiento: 1. Los alelos que se encuentran en el mismo cromosoma homólogo no tienen puntuación entre ellos. 2. Una barra oblicua separa simbólicamente a los dos homólogos. 3. Los alelos siempre son escritos en el mismo orden en cada homólogo. 4. Los genes conocidos que se encuentran en distintos cromosomas homólogos (genes no ligados) se escriben separados por un punto y coma (tal como se mencionó en los primeros capítulos). Por ejemplo: A/a; C/c. 5. En este libro, los genes cuyo ligamiento es desconocido se escriben separados por un punto. Por ejemplo A/a · D/d. Evidencia que el entrecruzamiento es un proceso de rotura y unión Fue muy convincente la idea de que los recombinantes se producen por algún tipo de intercambio de material entre los cromosomas homólogos. Sin embargo, para probar esta hipótesis fue necesario hacer experimentos. El primer paso fue encontrar un caso en el que el intercambio de partes entre cromosomas fuera visible al microscópico. Varios investigadores se aproximaron a este problema de la misma manera, y uno de sus análisis fue como se describe a continuación. Harriet Creighton y Barbara McClintock (1931) estudiaron dos genes de maíz cuya posición ya conocían en el cromosoma 9. Uno de estos genes afecta el color de las semillas (C, coloreado y c, sin color), y el otro se refiere a la composición del endospermo (Wx, ceroso, wx, almidonoso). La planta era un dihíbrido en conformación cis. Sin embargo, en una planta se observó algo poco común; el cromosoma 9 con los 11 alelos C y Wx también llevaba un elemento grande y densamente teñido (denominado pomo) en el extremo del locus C y un segmento cromosómico extra en el extremo del locus Wx. De modo que el heterocigoto podría representarse así: Aquí hay un gráfico Wx wx C c Compararon los genotipos recombinantes y parentales en la progenie de un cruzamiento prueba de esta planta. Encontraron que todos los recombinantes heredaban PAGINA 134 ______________________________________________________________________ PÁGINA 135 un tipo u otro de los siguientes cromosomas, dependiendo del contenido de sus recombinantes: Aquí hay un gráfico wx C Wx c De esta manera, había una correlación precisa entre suceso genético de la aparición de recombinantes y el fenómeno cromosómico del entrecruzamiento. En consecuencia, los quiasmas parecían ser los sitios de intercambio, aunque la prueba definitiva no se obtuvo hasta el año 1978. ¿Qué se puede decir sobre el mecanismo molecular de intercambio cromosómico en un suceso de entrecruzamiento? Una respuesta breve es que un entrecruzamiento resulta de la rotura y unión del DNA. Los dos cromosomas parentales se rompen en la 12 misma posición y luego cada segmento se une con el segmento del otro cromosoma homólogo. En el Capítulo 14, se estudiarán modelos de los procesos moleculares que permiten al DNA romperse y volverse a unir de una manera tan precisa que no se pierde ni se gana material genético. Mensaje Un entrecruzamiento es la rotura de dos moléculas de DNA en una misma posición y su reunión posterior en dos combinaciones recombinantes recíprocas. Evidencia de que el entrecruzamiento tiene lugar en el estado de cuatro cromátidas Como se ha visto en la Figura 4-3, la representación esquemática del entrecruzamiento muestra que se produce durante la meiosis en el estado de cuatro cromátidas. En otras palabras, los entrecruzamientos se dan entre cromátidas no hermanas. Sin embargo, teóricamente es posible que el entrecruzamiento se produzca antes de la replicación, en el estado de dos cromosomas. Esta duda se despejó mediante el análisis genético de organismos cuyos cuatro productos meióticos permanecen juntos en grupos de cuatro llamados tétradas. Estos organismos, que ya conocimos en los Capítulos 2 y 3, son los hongos y las algas unicelulares. El producto de la meiosis en una tétrada simple puede aislarse, lo que equivale a aislar las cuatro cromátidas de un meiocito. Los análisis de tétradas de cruzamientos en los que los genes están ligados presentan muchas tétradas que contienen cuatro combinaciones alélicas distintas. Por ejemplo, a partir del cruce: AB × ab algunas tétradas (pero no todas), contienen cuatro genotipos: 13 AB Ab aB ab Se puede explicar este resultado solamente si los entrecruzamientos se producen en el estado de cuatro cromátidas, ya que si los entrecruzamientos se produjeran en el estado de dos cromosomas sólo habría PAGINA 135 ______________________________________________________________________ PÁGINA 136 un máximo de dos genotipos distintos en cada tétrada individual. En la Figura 4-5 se muestra gráficamente este razonamiento. Los entrecruzamientos múltiples pueden incluir más de dos cromátidas El análisis de tétradas puede también mostrar otras dos características importantes del entrecruzamiento. Primero, en algún meiocito individual se pueden producir varios entrecruzamientos a lo largo del par cromosómico. Segundo, en algún meiocito, estos entrecruzamientos múltiples pueden intercambiar material entre más de dos cromátidas. Para aproximarse a este tema, es necesario comenzar observando el caso más simple: el entrecruzamiento doble. Para estudiar el entrecruzamiento doble se necesita tener tres genes ligados. Por ejemplo, si los tres loci están ligados en el cruzamiento mostrado a continuación: ABC × abc 14 son posibles muchos tipos distintos de tétradas, pero sólo algunos tipos son informativos en este contexto porque sólo se pueden lograr por entrecruzamientos dobles en los que han intervenido más de dos cromátidas. Por ejemplo, considere la siguiente tétrada: ABc AbC aBC abc La composición de esta tétrada se puede explicar mediante dos entrecruzamientos en los cuales han intervenido tres cromátidas, tal como se muestra en la Figura 4-6a. Además, las cuatro cromátidas pueden participar en entrecruzamientos durante la misma meiosis (Figura 4-6b), como se muestra en el siguiente tipo de tétradas ABc Abc aBC abC Por lo tanto, para todo par de cromosomas homólogos, en un suceso de entrecruzamiento en un meiocito pueden intervenir dos, tres o cuatro cromátidas. Sin embargo, observe que cualquier entrecruzamiento simple siempre es entre dos cromátidas. Cabe preguntarse si se dan entrecruzamientos entre cromátidas hermanas. Se producen, pero son raros. Puesto que no producen nuevas combinaciones alélicas, no se suelen considerar. PAGINA 136 ______________________________________________________________________ PÁGINA 137 15 4.2 Cartografía mediante frecuencia de recombinación La frecuencia de recombinación que produce el entrecruzamiento es la clave para la cartografía cromosómica. Mediante el análisis de tétradas de hongos se ha demostrado que para cualquier par de genes específicos que estén ligados se produce entrecruzamiento entre ellos en algunos meiocitos, pero no en todos (Figura 4-7). Mientras más lejos estén los genes entre sí, será más probable un entrecruzamiento entre ellos y se producirá una mayor proporción de productos recombinantes. De esta manera, la proporción de recombinantes es un indicio de la distancia que separa dos loci en el mapa cromosómico. Como se afirmó inicialmente respecto a los datos de Morgan, la frecuencia de recombinación fue significativamente menor al 50%, específicamente 10.7%. En la Figura 4-8 se presenta la situación general del ligamiento en el que los recombinantes constituyen menos del 50%. La frecuencia de recombinación en diferentes genes ligados varía entre 0% y 50%, dependiendo de su proximidad (véase la página 141). Cuanto más alejados se encuentren los genes, la frecuencia de recombinación será más próxima al 50%, habiendo casos en los que es difícil afirmar si los genes están ligados o si están en diferentes cromosomas. ¿Qué se puede decir sobre la frecuencia de recombinación mayor del 50%? Como se demostrará más adelante, la respuesta es que tales frecuencias nunca se observan. Observe en la Figura 4-7 que un entrecruzamiento simple genera dos productos recombinantes recíprocos, lo que explican porque las clases recombinantes recíprocas se producen generalmente en frecuencias muy semejantes. El corolario de este punto es 16 que los dos tipos no recombinantes (los parentales) también deben producirse con frecuencias semejantes, hecho que también fue observado por Morgan. Unidades de mapa Un estudiante de Morgan desarrollo el método básico para cartografiar genes mediante el uso de la frecuencia de recombinación. Morgan estudió más y más PAGINA 137 ______________________________________________________________________ PÁGINA 138 genes ligados y observó que la proporción de progenie recombinante variaba de manera considerable, en función de que genes ligados se estaban estudiando, y pensó que, de alguna manera, esta variación en la frecuencia de recombinación puede indicar la distancia real que separa a los genes en los cromosomas. Morgan asignó la cuantificación de este proceso a un estudiante pregraduado, Alfred Sturtevant, quien también llegó a ser uno de los más importantes genetistas. Morgan encargó a Sturtevant que intentara dar algún sentido a la información que se obtenía sobre el entrecruzamiento entre genes ligados. Una tarde Sturtevant desarrolló un método para cartografiar genes, tan efectivo, que todavía hoy se sigue utilizando. En palabras del propio Sturtevant, “En las postrimerías de 1911, conversando con Morgan, me percaté de repente que las variaciones en la fuerza del ligamiento, a las que Morgan ya había atribuido a diferencias en la separación especial de los genes, ofrecía la posibilidad de determinar secuencias en la dimensión lineal del cromosoma. Marché a casa, y pasé gran parte de la noche (en detrimento de mis deberes de estudiante) elaborando el primer mapa cromosómico.” 17 Como ejemplo de la lógica de Sturtevant, considere el resultado de los cruzamientos prueba de Morgan para los genes pr y vg, en los que calculó una frecuencia de recombinación de 10.7%. Sturtevant sugirió que se utilice esta proporción de recombinantes como un indicador cuantitativo de la distancia lineal que separa a los genes en el mapa genético, también conocido como mapa de ligamiento. La idea básica es muy simple. Imagine dos genes específicos situados a una distancia fija determinada. Ahora imagine entrecruzamientos aleatorios a lo largo del par de cromosomas homólogos. En algunas meiosis, el entrecruzamiento entre cromátidas no hermanas será probablemente en la región cromosómica entre los genes. Los recombinantes se producen en estas meiosis. En otras divisiones meióticas, cuando no hay entrecruzamiento en la región entre los genes, no se producen recombinantes. (para ver un esquema, volver a la Figura 4-7). Sturtevant propuso una proporcionalidad aproximada: cuanto mayor es la distancia entre genes ligados, mayor es la probabilidad de entrecruzamiento en la región entre los genes, y por tanto, se producirá una mayor proporción de recombinantes. De esta manera, determinando la frecuencia de recombinantes, podemos obtener una medida de la distancia de mapa entre los genes. De hecho, Sturtevant definió una unidad de mapa genético (m.u.) como la distancia entre genes en la que se produce 1 recombinante de cada 100 productos meióticos. Por ejemplo la frecuencia de recombinación (FR) de 10.7%, obtenida por Morgan, se define como 10.7 m.u. Una unidad mapa también es conocida como un centimorgan (cM) en honor a Thomas Hunt Morgan. El mapa lineal que se produce con este método, ¿corresponde a la linealidad del cromosoma? Sturtevant predijo sobre un mapa lineal, que si los genes A y B están 18 separados cinco unidades de mapa (5 m.u.), mientras que A y C están separados tres m.u., entonces B y C debería estar separados ocho o dos m.u. (Figura 4-9). Sturtevant pudo verificar su predicción. En otras palabras, su análisis sugería fuertemente que los genes están organizados en orden lineal, haciendo que las distancias de mapa fueran aditivas. (Como se verá más adelante, hay algunas excepciones menores que no son insignificantes). ¿Cómo se representa un mapa? Por ejemplo, en Drosophila el locus del gen del color de ojos y el locus del gen de tamaño de alas están separados aproximadamente 11 m.u. La relación entre estos loci se esquematiza de la siguiente manera: Aquí hay un gráfico pr 11.0 vg Generalmente, nos referimos en forma abreviada al locus del gen del color de ojos como “locus pr” por el primer alelo mutante descubierto, pero significa el lugar del cromosoma donde se encontrará cualquier alelo de dicho gen, mutante o salvaje. Como se ha indicado en los Capítulos 2 y 3, el análisis genético puede ser aplicado en dos direcciones opuestas. Este mismo principio se puede aplicar a la frecuencia de recombinación. En un sentido, la frecuencia de recombinación puede ser utilizada para hacer mapas. En el otro sentido, cuando se ha establecido un mapa con distancias genéticas en unidades de mapa, se puede predecir PAGINA 138 ______________________________________________________________________ PÁGINA 139 19 las frecuencias de las diferentes clases de genotipos en la progenie. Por ejemplo, la distancia genética entre los loci pr y vg en Drosophila es aproximadamente 11 unidades de mapa. De modo que, conociendo este valor sabemos que habrá 11% de recombinantes en la progenie de un cruzamiento prueba con una hembra heterocigótica dihíbrida en conformación cis (pr vg/pr+ vg+). Estos recombinantes serán de dos tipos recíprocos con igual frecuencia: 5.5% serán del tipo pr vg+ y 5.5% serán pr+ vg. También sabemos que 100 – 11 = 89%, serán no recombinantes en dos clases con igual frecuencia, 44.5% pr vg y 44.5% pr+ vg+. (Observe que la contribución del macho prueba fue ignorada al escribir los genotipos). importante consecuencia de que la “distancia” en un mapa de ligamiento fuera una distancia física a lo largo del cromosoma Es una inferencia fuerte suponer que la “distancia” de un mapa de ligamiento es una distancia física a lo largo del cromosoma, por más que Morgan y Sturtevant pretendieran que fuera así. Pero deberíamos tener en cuenta que el mapa de ligamiento es una entidad hipotética construida solamente a partir del análisis genético. El mapa de ligamiento podría haberse derivado aún sin saber qué los cromosomas existen. Además, en este punto del argumento, no es posible afirmar que la “distancia genética” calculada mediante la frecuencia de recombinación representa la distancia física real en los cromosomas. Sin embargo, la cartografía física nos ha mostrado que las distancias genéticas son significativamente proporcionales a las distancias basadas en recombinación. Hay algunas excepciones a esta relación entre distancias física y genética, debidas a puntos calientes de recombinación, que son lugares en el genoma donde se producen los entrecruzamientos con más frecuencia que lo usual. La presencia de puntos calientes de recombinación produce una expansión proporcional de algunas 20 regiones en el mapa. También se conocen los bloques de recombinación, que tienen el efecto opuesto. En la Figura 4-10 se muestra un resumen de la forma en que se utilizan los recombinantes de un entrecruzamiento en la cartografía de genes. Los entrecruzamientos se producen de manera más o menos aleatoria a lo largo del par cromosómico. En general, en las regiones más largas el número promedio de entrecruzamientos es mayor; en consecuencia, se obtienen más recombinantes, traduciéndose en una distancia de mapa mayor. Mensaje La recombinación entre genes ligados se puede utilizar para cartografiar la distancia que los separa en el cromosoma. La unidad de mapa (1 m.u.) se define como una frecuencia de recombinación del 1%. PAGINA 139 ______________________________________________________________________ PÁGINA 140 Cruzamiento prueba de tres puntos Hasta ahora, se ha estudiado el ligamiento en cruzamientos dihíbridos (heterocigotos dobles) con progenitores de prueba dobles recesivos. El siguiente nivel de complejidad es un cruzamiento de un trihíbrido (heterocigoto triple) con un progenitor triple recesivo. Este tipo de cruzamiento, llamado cruzamiento prueba de tres puntos, se utiliza a menudo en el análisis de ligamiento. El objetivo es deducir si los tres genes están ligados, y si lo están, deducir el orden y las distancias de mapa entre ellos. 21 Veamos un ejemplo, también en Drosophila. En este ejemplo, los alelos mutantes son v (ojos bermellón), cv (crossveinless, ausencia de venas transversales en PAGINA 140 ______________________________________________________________________ PÁGINA 141 alas) y ct (cut, alas recortadas). Se realiza el análisis mediante los siguientes cruzamientos: P v / v cv / cv ct / ct X v / v cv / cv ct / ct Gametos v cv ct v cv ct F1 trihíbrida v / v cv / cv ct/ct Se realiza un cruzamiento prueba entre las hembras trihíbridas y machos triples recesivos: v/v+ · cv/cv+ · ct/ct+ ♀ Hembra trihíbrida F1 x v/v · cv/cv · ct/ct ♂ Macho de prueba En cualquier trihíbrido, solamente son posibles 2 × 2 × 2 = 8 genotipos gaméticos. Estos son los genotipos que se observan en la progenie del cruzamiento prueba. El siguiente cuadro muestra el número de individuos con cada uno de los ocho genotipos gaméticos, en una muestra de 1448 moscas de la progenie. En las columnas se muestran los genotipos que son recombinantes (R) para los loci tomados a pares. Se debe ser cuidadoso en la clasificación de los tipos recombinantes y parentales. Observe que la contribución parental de genotipos por los triples heterocigotos es v+ ∙ cv ∙ ct y v ∙ cv+ ∙ ct+; toda combinación diferente a estas dos será considerada como recombinante. 22 Gametos v · cv + · ct + v + · cv · ct v · cv · ct + v + · cv + · ct v · cv · ct v + · cv + · ct + v · cv + · ct v + · cv · ct + Recombinantes para los loci v y cv v y ct cv y ct 580 592 45 40 89 94 3 5 1448 R R R R 268 R R R R R R 191 R R 93 Analicemos los loci tomados a pares, empezando con los loci v y cv. En otras palabras, observemos las primeras dos columnas bajo el encabezado “Gametos” y tapemos la tercera columna. Puesto que sabemos que en estos loci los progenitores son v+ · cv y v · cv+, los recombinantes serán por definición: v · cv y v+ · cv+. De este tipo de recombinantes hay 45 + 40 + 89 + 94 = 286. Esta FR representa el 18.5% de las 1448 moscas producidas. Para los loci v y ct, los recombinantes son v · ct y v+ · ct+. De las 1448 moscas hay 89 + 94 + 3 + 5 = 191 de este tipo de recombinantes, por lo que la FR es 13.2%. Para ct y cv, los recombinantes son cv · ct+ y cv+ · ct. Entre las 1448 moscas de la progenie existente, 45 + 40 + 3 + 5 = 93 de estos tipos de recombinantes, así que la FR es 6.4%. Es evidente que todos los loci están ligados, ya que todos los valores de la FR son considerablemente menores al 50%. Puesto que los loci v y cv tienen el valor más 23 grande de FR, deben ser los que están más alejados entre sí. Por tanto, el locus ct debe estar situado entre ambos. Se puede dibujar un mapa de la siguiente manera: v Aquí hay un gráfico ct cv 13.2 6.4 m.u. m.u. PAGINA 141 ______________________________________________________________________ PÁGINA 142 Ahora que se conoce el orden de ligamiento, el cruzamiento prueba puede ser nuevamente escrito de la siguiente manera: v+ ct cv / v ct+ cv+ × v ct cv / v ct cv Observe varios puntos importantes. Primero, se ha deducido un orden que es distinto al utilizado en la lista de genotipos de la progenie. La lista original fue necesariamente arbitraria porque el objetivo del ejercicio fue determinar la relación de ligamiento entre estos genes; el orden no se conocía antes que los datos fueran analizados. De ahora en adelante, los genes deben ser escritos en el orden correcto. Segundo, se ha establecido de manera definitiva que el locus ct está entre los loci v y cv. En el esquema se ha colocado de forma arbitraria a v a la izquierda y a cv a la derecha; sin embargo, el mapa podría estar igualmente bien dibujado si se colocan estos loci en orden inverso. 24 Tercero, observe que los mapas de ligamiento son sencillamente mapas de loci relacionados unos con otros, mediante el uso de unidades de mapa estándar. No se sabe dónde están los loci en el cromosoma y menos aún, en qué cromosoma se encuentran. En análisis posteriores, cuando otros loci se cartografíen en relación a estos tres, se podrá llegar a completar el mapa de un cromosoma. Mensaje Los cruzamientos prueba de tres o más puntos permiten al genetista averiguar las relaciones de ligamiento entre tres o más genes y determinar su orden lineal en un único cruzamiento. Un último punto a considerar es que las dos distancias de mapa más pequeñas (13.2 m.u. y 6.4 m.u.) suman 19.6 m.u., que es un valor mayor que 18.5 m.u. (la distancia calculada para v y cv). ¿Por qué? La respuesta a esta pregunta está en el tratamiento que se ha dado a las dos clases más raras de la progenie (8 en total), con respecto a la recombinación de v y cv. Ahora con el mapa, se puede observar que las dos clases más raras son de hecho recombinantes dobles, surgidos de dos entrecruzamientos (Figura 4-11). Sin embargo, cuando se ha calculado el valor de la FR para v y cv, no se contaron los genotipos v ct cv+ y v+ ct+ cv. Después de todo, respecto a v y cv, son combinaciones parentales (v cv+ y v+ cv). Sin embargo, en el mapa se puede observar que este descuido induce a subestimar la distancia entre los loci v y cv. No solamente se debería incluir las dos clases más raras, sino que deberían haberse contado dos veces cada una de ellas, debido a que representan dobles recombinantes. Por tanto, se puede corregir el valor sumando los números 45 + 40 + 89 + 94 + 3 + 3 + 5 + 5 = 284. Este número es el 19.6% de 1448, que es igual a la suma de los dos valores integrantes. (En 25 la práctica no es necesario hacer este cálculo, porque la suma de las dos distancias más pequeñas representa la mejor estimación de la distancia total) Deducción del orden de los genes mediante inspección Ahora que ya se tiene algo de experiencia con cruzamientos prueba de tres puntos, es momento de volver a las listas de la progenie de los trihíbridos de genes ligados y ver que es posible deducir el orden de los genes mediante inspección, sin hacer un análisis de frecuencia de recombinación. En genes ligados, es característico tener ocho genotipos diferentes con las siguientes frecuencias: dos con frecuencias muy altas dos con frecuencias intermedias dos con frecuencias intermedias distintas a la anterior dos raros PAGINA 142 ______________________________________________________________________ PÁGINA 143 Hay sólo tres formas posibles en que pueden estar ordenados los de genes, cada una con un gen distinto en la posición del medio. Generalmente, es cierto que los dobles recombinantes son las clases más pequeñas, como las que están al final de la lista del ejemplo. En la Figura 4-12 se muestra que sólo un orden es compatible con el hecho de que las clases menos frecuentes se hayan producido por entrecruzamientos dobles. Es decir, solamente un orden permite la formación de recombinantes dobles de genotipos v ct cv+ y v+ ct+ cv. Por tanto, una regla general sencilla para deducir cual es el gen en la 26 posición central es consiste en saber que par de alelos ha cambiado de posición en las clases de recombinantes dobles. Interferencia El conocimiento de la existencia de los entrecruzamientos dobles nos plantea la posibilidad de la interdependencia. Es decir ¿los entrecruzamientos en regiones adyacentes del cromosoma son sucesos independientes? ¿Un entrecruzamiento en una región, afecta la probabilidad de que se produzca un entrecruzamiento en una región adyacente? La respuesta es que, generalmente, los entrecruzamientos inhiben la formación de otro entrecruzamiento (en la misma región cromosómica) mediante una interacción conocida como interferencia. Las clases de recombinantes dobles se pueden utilizar para deducir la magnitud de esta interferencia. La interferencia se puede medir de la siguiente manera. Si los entrecruzamientos en dos regiones son independientes se utiliza la regla del producto (véase página 95) para predecir la frecuencia de recombinantes dobles: esta frecuencia debería ser igual al producto de las frecuencias de recombinantes en las regiones adyacentes. En los datos de recombinación para v-ct-cv, el valor de la FR de v-ct es 0.132 y el valor la FR para ct-cv es 0.064; luego si no hubiera interferencia, se espera que los recombinantes dobles se encuentren en una frecuencia de 0.132 × 0.064 = 0.0084 (0.84%). Entonces, se esperan 0.0084 × 1448 = 12 recombinantes dobles en la muestra de 1448 moscas, pero los datos muestran sólo 8 recombinantes dobles. Si este déficit de recombinantes dobles se observara de manera consistente, sería una demostración de que las dos regiones no son independientes, y nos indica que la distribución de entrecruzamientos favorece a los simples a expensas de los dobles. En otras palabras, existe algún tipo de interferencia: 27 un entrecruzamiento reduce la probabilidad de que se produzca otro entrecruzamiento en una región adyacente. Para cuantificar la interferencia, se calcula primero un término denominado coeficiente de coincidencia (c.o.c.), que es la razón entre recombinantes dobles observados y esperados. La interferencia (I) que se define como 1 – c.o.c. Por tanto, frecuenciaobservadao númeroo dobles recombinantes I 1 128 124 I 13 ,1o–33 por ciento frecuenciaesperada o númeroo dobles recombinantes En nuestro ejemplo I = 1 - 8/12 = 4/12 = 1/3 o 33% En algunas regiones nunca se han observado recombinantes dobles. En estos casos, el c.o.c = 0,y así I = 1 y la interferencia es total. Los valores de interferencia varían entre 0 y 1 en distintas regiones del genoma y en diferentes organismos. Puede preguntarse porqué siempre se utilizan hembras heterocigóticas para los cruzamientos prueba en Drosophila. La explicación se asocia a una característica inusual de los machos de Drosophila. Por ejemplo, cuando machos pr vg/pr+ vg+ se cruzan con hembras pr vg/pr vg, en la descendencia se observan solamente las clases pr vg / pr+ vg+ y pr vg/pr vg. Este resultado nos demuestra que no hay entrecruzamiento en los machos de Drosophila. Sin embargo, esta ausencia de entrecruzamiento en un sexo se limita únicamente a algunas especies; no se observa en todas las especies PAGINA 143 ______________________________________________________________________ PÁGINA 144 PAGINA 144 28 ______________________________________________________________________ PÁGINA 145 (o en el sexo heterogamético). En otros organismos hay entrecruzamiento en machos XY y en hembras WZ. La razón para la ausencia de entrecruzamiento entre machos de Drosophila es que tienen una inusual profase I, en la que no se forma el complejo sinaptonémico. También hay una recombinación diferencial entre sexos en la especie humana. Para los mismos loci, las mujeres presentan niveles más elevados de recombinación que los hombres. Miles de genes en los que se han identificado variantes (mutantes) fenotípicas han sido cartografiados mediante el uso reiterado de técnicas basadas en la recombinación. En la Figura 4-13 se muestra gráficamente un ejemplo sencillo en el tomate. Se muestran los cromosomas tal como se observan bajo el microscopio junto a los mapas cromosómicos basados en el análisis de ligamiento de varios pares alélicos con el fenotipo asociado respectivo. Utilización de las proporciones para el diagnóstico El análisis de proporciones es uno de los pilares de la genética. Hasta ahora hemos encontrado en el texto muchas proporciones diferentes cuyas consecuencias se han presentado en varios capítulos. El reconocimiento de las proporciones y su utilización en el diagnóstico del sistema genético en estudio son parte cotidiana del trabajo en genética, por lo que se revisarán las principales proporciones estudiadas hasta ahora. En la Figura 4-14 se presentan estas proporciones. Se pueden leer a partir del ancho relativo de laos rectángulos coloreados en cada línea. La Figura 4-14 considera un cruzamiento estándar entre la F1 y de cruzamientos prueba monohíbrido, dihíbrido (con transmisión 29 independiente y con ligamiento) y trihíbrido (también con transmisión independiente y con ligamiento de todos los genes). No se representa el cruzamiento de un trihíbrido en el que sólo dos de los tres genes están ligados. A manera de ejercicio, deduzca el patrón general que debería tener para ser incluido en el esquema. Observe que con respecto al ligamiento, el tamaño de las clases depende de las distancias de mapa. Un genetista deduce un estado genético desconocido de la siguiente manera: “una proporción 9:3:3:1 nos indica que la proporción es muy parecida a la que produce un cruzamiento entre dihíbridos en los que los genes están en cromosomas distintos.” PAGINA 145 ______________________________________________________________________ PÁGINA 146 4.3 Cartografía con marcadores moleculares La variación fenotípica basada en alelos de genes es solamente una parte de la variación total entre los individuos de una población. Como se dijo en el Capítulo 2, la evaluación de las secuencias de DNA de diferentes individuos de una especie revela una variación considerable. Por ejemplo, un individuo puede tener el par de bases GC en la posición 5658 del DNA y otro individuo puede tener AT en esa misma posición. También es posible que el mismo individuo que tiene GC en esa posición en uno de los miembros del par cromosómico, pueda tener AT en el mismo sitio en el otro miembro del par cromosómico. De esta manera, un individuo es un heterocigoto molecular (“AT/GC”) para esa posición del DNA. Parte de esta variación afecta el fenotipo (por ejemplo, mutaciones nulas dentro de genes). Sin embargo, la mayor proporción de variación en las secuencias parece no estar relacionadas con el fenotipo; dicho en otras palabras, es variación silenciosa. 30 Las variantes moleculares son tan comunes que muchos individuos son heterocigóticos moleculares en muchos loci diferentes en el genoma. Esto es útil para cartografíar, puesto que los heterocigotos moleculares (“AT/GC”) pueden situarse en un mapa de la misma manera que con los heterocigotos fenotípicos A/a. Un locus constituido por un heterocigoto molecular puede posicionarse en un mapa cromosómico mediante análisis de la frecuencia de recombinación exactamente de la misma forma como se hace con un locus heterocigótico “fenotípico”. Este principio es válido aun cuando la variación suele ser una diferencia silenciosa (probablemente fuera de un gen). Estos loci de heterocigosidad molecular se conocen como marcadores moleculares. Los marcadores moleculares son útiles para orientar al investigador en la búsqueda y localización de un gen de interés, ya que actúan como “hitos” o puntos de referencia sobre el mapa genético. Para entender esta función, considere los hitos reales: tienen poco interés por si mismos, pero son muy útiles para indicar cuan cerca se está del destino. En un ejemplo genético específico, supongamos que se quiere conocer la posición en el mapa de un gen de ratón que produce una enfermedad, tal vez como una forma de dirigirse hacia su secuencia de DNA. Se realiza un número de cruzamientos. En cada caso, se cruza un individuo que tiene el gen de la enfermedad con otro individuo cuyo genotipo tiene un conjunto de alelos para distintos marcadores moleculares de posición conocida en el mapa genético. Se llevan a cabo cruzamientos para probar todos los marcadores. El resultado de estos cruzamientos podría revelar que el gen de la enfermedad está a dos unidades de mapa de uno de los marcadores (al que denominaremos M). El procedimiento experimental podría ser como el que se explica a continuación. Denominemos a los alelos del gen de la enfermedad A y a y a los alelos del marcador molecular M1 y M2. Supongamos que el cruzamiento es A/a ∙ M1/M2 × a/a ∙ M1/M1, un tipo de cruzamiento prueba. La progenie debe ser primero evaluada 31 para los fenotipos A y a, y después se extrae el DNA de cada individuo y se secuencia (o se evalúa de otra manera) para determinar los alelos moleculares. Supongamos que se obtienen los siguientes resultados: A/a · M1/M1 49 % a/a · M2/M1 49 % A/a · M2/M1 1 % a/a · M1/M1 1 % Estos resultados nos indican que la configuración del cruzamiento debió ser la siguiente: A M1/a M2 × a M1/a M1 y los dos últimos genotipos de la progenie de la lista deben ser recombinantes, con una distancia de dos unidades de mapa entre el locus A/a y el locus M1/M2. Por lo tanto, se sabe ahora la posición genómica general del gen y se puede estrechar más la posición en el cromosoma mediante aproximaciones de escala más fina de posicionamiento. Además, se pueden cartografiar diferentes marcadores moleculares entre sí, generando un mapa conteniendo una serie de hitos de referencia para encontrar entre ellos genes de fenotipo interesante. Se verá en esta sección que aunque en la cartografía basada en marcadores moleculares los cruzamientos prueba son el tipo más simple de análisis informativo, PAGINA 146 ______________________________________________________________________ PÁGINA 147 32 muchos cruzamientos que se realizan con marcadores moleculares no son de prueba. Sin embargo, debido a que cada alelo molecular tiene su propia firma, detectable incluso en los heterocigotos, tales cruzamientos con frecuencia son informativos ya que permiten detectar a los recombinantes y a los no recombinantes en los descendientes. Mensaje Cualquier heterocigosidad del DNA puede ser cartografiada y usada como marcadores o hitos moleculares de los cromosomas. Los dos principales marcadores moleculares utilizados en la elaboración de mapas genéticos son los polimorfismos de un único nucleótido y los polimorfismos simples de longitud de la secuencia. Polimorfismos de un único nucleótido La secuenciación del DNA ha demostrado, como se esperaba, que las secuencias genómicas de los individuos en una especie son, en su mayoría, idénticas. Por ejemplo, al comparar las secuencias de diferentes personas se observa una identidad del 99.9%. Prácticamente la totalidad del 0.1% diferente se debe a diferencias de un único nucleótido. Por ejemplo, un individuo puede tener la siguiente secuencia: ….AAGGCTCAT…. ….TTCCGAGTA…. mientras que en otro individuo, este mismo segmento de DNA puede tener la siguiente secuencia: ….AAAGCTCAT…. ….TTTCGAGTA…. 33 Además, la mayor proporción de estas secuencias localizadas se han encontrado como polimórficas, lo que significa que ambos “alelos” son comunes en la población. Globalmente, todas estas diferencias entre individuos se conocen como polimorfismos de un único nucleótido (abreviadas como SNPs, del inglés single nucleotide polymorphism, y pronunciadas como “snips”). Los SNPs tienen gran potencial como hitos de referencia en el análisis cartográfico. En humanos, se estima que existen alrededor de tres millones de SNPs distribuidos de manera más o menos aleatoria, con una frecuencia que varía entre 1 por cada 300 a 1000 bases. Esto los convierte en un conjunto de marcadores muy útiles para una cartografía a escala más fina. Aunque todos los SNPs pueden se pueden utilizar en la cartografía genética, algunos tienen otros usos, dependiendo de su efecto en el nivel fenotípico. Hay varias categorías, entre las cuales podemos citar: 1. SNPs silenciosos dentro de genes. Estos SNPs no tienen efecto aparente sobre el fenotipo. Aun así, son útiles como etiquetas de alelos particulares. Por ejemplo, si un variante de un SNP está dentro de un alelo a recesivo, entonces este alelo puede ser fácilmente detectado mediante el SNP. 2. SNPs en los que un alelo del SNP produce un fenotipo mutante que sigue una herencia monogénica. Estos SNPs fueron estudiados en Capítulo 2 (página 54) cuando se habló de las mutaciones. En estos casos, con frecuencia dentro de una secuencia que codifica para una proteína, un “alelo” de un SNP noquea o altera la función del gen, produciendo alguna forma de fenotipo discreto. En humanos, este tipo de SNP puede estar asociado a dos estados: uno a un alelo que produce una enfermedad, como la PKU 34 o la enfermedad de Tay-Sachs, y el otro que es el tipo salvaje. Aquí nuevamente el SNP se puede utilizar como una etiqueta; por ejemplo, una persona de fenotipo A/– puede ser diagnosticada como heterocigótica A/a mediante la detección de la variante asociada del SNP. 3. SNPs en poligenes (QTLs) De la misma manera como se discutió para fenotipos de genes simples, estos SNPs son útiles para descubrir poligenes que contribuyen al fenotipo que muestra una variación continua. PAGINA 147 ______________________________________________________________________ PÁGINA 148 4. SNPs intergénicos. Estos SNPs no tienen efecto fenotípico medible, pero son también útiles como hitos que ayudan a encontrar la posición de los genes de interés mediante el procedimiento general descrito al inicio de esta sección (ver páginas 51 y 148). 5. RFLPs. Ya hemos visto los polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs), que son SNPs localizados en un sitio diana de una enzima de restricción. En estos casos, habrán dos “alelos” RFLPs o formas, una que tiene la diana de restricción y el otro que no la tiene. Los sitios RFLPs pueden estar entre o dentro de genes. Al igual que todos los SNPs, los RFLPs son útiles como marcadores para cartografiar genes de interés. Aunque son relativamente engorrosos de usar, los RFLPs tienen la ventaja de que no se necesita secuenciar para detectarlos. En la Figura 4-15 se muestra un ejemplo de utilización de RFLPs para cartografiar un gen de interés. En este ejemplo, la frecuencia de recombinantes es uno de cada ocho. Sin embargo, se necesitarían muchos cruzamientos similares para obtener una muestra estadísticamente significativa. En la Figura 4-15 el SNP cambia un 35 PAGINA 148 ______________________________________________________________________ PÁGINA 149 sitio de restricción, pero todo SNP puede ser cartografiado de esta manera utilizando la secuenciación, incluso si no altera el sitio de restricción. Cartografía mediante el uso de haplotipos de SNPs Hemos visto que los SNPs individuales, como por ejemplo los RFLPs, se pueden utilizar como cualquier sitio heterocigótico para la identificación de ligamiento a partir de la frecuencia de recombinación. Adicionalmente las combinaciones de SNPs se pueden utilizar para deducir el ligamiento de una manera ligeramente distinta, basada en la noción de haplotipo. Un haplotipo es un segmento cromosómico definido por un conjunto específico de alelos de los SNPs que contiene. Por tanto, si utilizamos el signo prima (') para distinguir alelos alternativos de SNPs, dos haplotipos definidos con cinco SNPs pueden ser: ………1 ………1' 2' 2 3' 3 4 4' 5 ……… y 5' ……… Este tipo de ordenación pueden ser de cualquier tamaño, pero suelen variar entre 10 y 50 kb. En el nivel poblacional, los haplotipos se heredan en forma de bloques. Con el paso del tiempo, se espera que los entrecruzamientos rompan los haplotipos, pero a corto plazo los alelos se mantendrán unidos. Los haplotipos tienen una vida finita, `pues se espera que los entrecruzamientos los erosionen. Durante esta vida finita, los alelos de 36 los SNPs de un haplotipo se dice que están en desequilibrio de ligamiento (el estado de equilibrio se alcanzaría una vez los entrecruzamientos hayan roto el haplotipo). El desequilibrio de ligamiento permite que los haplotipos se puedan utilizar para cartografiar la posición de un gen de interés. Esta técnica es especialmente útil en la cartografía de alelos de interés médico en el genoma humano, como los alelos de enfermedades y otros que predisponen a la susceptibilidad a los fármacos. Por todo ello, se viene realizando un gran esfuerzo para identificar los haplotipos en las poblaciones humanas y se ha logrado elaborar un mapa completo (el “HapMap”). Fue una sorpresa descubrir con el HapMap que, en la especie humana, los haplotipos son “islas” de baja frecuencia de entrecruzamiento separadas por puntos calientes de recombinación. En la Figura 4-16 se presenta un caso ilustrativo sobre cómo se pueden utilizar los haplotipos para encontrar genes. En la parte superior se observa un haplotipo de SNPs en el que hace algún tiempo se produjo una mutación en un gen de interés (por ejemplo, una mutación que produce una enfermedad). Con el paso del tiempo, los entrecruzamientos introducen diferentes alelos de SNPs, pero el análisis de asociación de los alelos del haplotipo en la población muestran que los alelos originales 4 y 5 no “han recombinado” y todavía se encuentran en “desequilibrio de ligamiento” con el alelo mutante. Por tanto, el locus del gen de la enfermedad puede ser situado con bastante precisión puesto que los SNPs humanos se encuentran a una kb de distancia aproximadamente. Un análisis haplotípico de este tipo se ha utilizado para localizar en el cromosoma 4 humano, el gen que tienen un alelo que produce una sensibilidad extrema a la bronquitis viral, que es una de las causas más frecuentes de hospitalización de niños. 37 Se puede observar que las técnicas para cartografiar un gen mediante desequilibrio de ligamiento, aunque son superficialmente distintas de las que utilizan la frecuencia de recombinación, tienen su fundamento en el mismo principio por el que las combinaciones alélicas de los loci estrechamente ligados tienden a heredarse juntas. Los SNPs y el análisis de ligamiento de haplotipos son la gran promesa para el descubrimiento de los poligenes (QTLs). Los poligenes constituyen también un modelo genético para fenotipos que presentan distribución continua tales como el peso y la altura. Los poligenes también nos suministran un modelo para la herencia de condiciones humanas como el labio leporino, el pie zambo, enfermedades cardiacas, arterioesclerosis e PAGINA 149 ______________________________________________________________________ PÁGINA 150 hipertensión. Estos desórdenes son de herencia compleja que pueden explicarse mediante un modelo poligénico en el que la condición se expresa cuando la dosis poligénica alcanza un umbral. Los análisis de SNPs y haplotipos tienen un gran potencial para descubrir genes subyacentes a la variación continua y a los caracteres con un umbral de aparición. En los organismos modelo, los haplotipos se utilizan para explorar segmentos del genoma a lo largo de las generaciones y correlacionar estos segmentos con el carácter de interés. Esta idea se ilustra en la Figura 14-17, donde se utilizan líneas puras de ratones que se diferencian en algunos caracteres poligénicos, como la tendencia a la arterioesclerosis o enfermedades cardiacas. Se hace una correlación estadística entre el fenotipo y los haplotipos que marcan regiones cromosómicas específicas. Por ejemplo, 38 si el fenotipo de la línea consanguínea que se muestra en el lado inferior derecho de la Figura 4-17 difiere significativamente del de la línea parental B, entonces, la región negra probablemente contiene un poligén contribuyente. Se debe resaltar el hecho de que la genética del ratón ha generado modelos importantes de desórdenes en mamíferos y mucho de lo que se conoce en ratones puede ser aplicado a la especie humana. Indudablemente, esta última afirmación también será cierta para los poligenes. En humanos, los haplotipos compartidos en familias o poblaciones pueden ser utilizados en análisis estadísticos similares para identificar poligenes. PAGINA 150 ______________________________________________________________________ PÁGINA 151 Polimorfismo de longitud de secuencia simple Una de las sorpresas del análisis molecular fue la comprobación de que muchos genomas tienen una gran cantidad de DNA repetitivo. Además, hay muchos tipos de DNA repetitivo. En un extremo del espectro están las secuencias de DNA pequeñas repetitivas múltiples y adyacentes. No se conoce el origen de estas repeticiones, pero la propiedad que las hace tan útiles es que con frecuencia el número de copias es distinto en cada individuo. Estas repeticiones se denominan polimorfismo de longitud de secuencia simple (SSLP del inglés simple sequence length polymorphism). También se les conoce como número variable de repeticiones en tándem (VNTRs, del inglés variable number tandem repeats). Los SSLPs generalmente tienen muchos alelos; habiéndose encontrado hasta 15 alelos en un locus SSLP. Con este nivel de polimorfismo, muchas veces es posible tener 39 progenitores con los 4 alelos diferentes (2 por cada progenitor), a los que se les puede seguir la pista en una genealogía. Hay dos tipos de SSLPs que son útiles para la cartografía cromosómica y para otros tipos de análisis del genoma: los minisatélites y los microsatélites. (La palabra satélite se refiere al hecho de que cuando el DNA genómico se aísla mediante técnicas físicas experimentales, el DNA que contiene las secuencias repetitivas forma una fracción que se separa físicamente del resto; se dice que es una fracción satélite en el sentido de que está separada del grueso del DNA). Marcadores minisatélites. Un marcador minisatélite basa su variabilidad en el número de repeticiones en tándem de una unidad repetitiva de DNA cuyo tamaño varía entre 15 y 100 nucleótidos de largo. En humanos, la longitud de la unidad que se repite va de 1 a 5 kb. Los loci minisatélites que tienen la misma unidad repetitiva, pero diferente número de repeticiones, están dispersos a través del genoma. Para definir un locus minisatélite, primero el DNA genómico total se corta con una enzima de restricción que no tenga dianas de restricción dentro de las unidades repetitivas pero que sí pueda cortar las regiones adyacentes. Así, la longitud de cada fragmento corresponderá al número de repeticiones. Si se dispone de una sonda que reconoce la secuencia repetitiva, entonces un ensayo de transferencia Southern revelará un gran número de fragmentos de distinto tamaño ligados a la sonda. De hecho, estos patrones se denominan huella digital del DNA. (Estas “huellas digitales” son muy singulares, y por tanto, tienen gran valor forense). Si los progenitores difieren en una banda particular, esta diferencia producirá un sitio heterocigótico que, mediante el análisis de recombinación, se puede utilizar para cartografiar genes ligados de interés. En la Figura 4-18 se muestra un ejemplo sencillo de cómo puede emplearse la huella digital del DNA para establecer ligamiento. 40 Marcadores microsatélites. Un marcador microsatélite está formado por una secuencia todavía más simple (generalmente un dinucleótido) que se repite en tándem un número variable de veces. El tipo más común de microsatélite es la repetición de CA y su complemento GT, como se muestra en el siguiente ejemplo: 5' C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A-C-A 3' 3' G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T-G-T 5' Los alelos de microsatélites se revelan mediante la síntesis de réplicas de la región repetitiva utilizando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fundamento de esta técnica se explicará con mayor detalle en el Capítulo 20, pero en esencia se utiliza un par de cebadores de la replicación del DNA (“iniciadores de la síntesis”) que ceba la síntesis de DNA en un tubo de ensayo con una determinada secuencia genómica que actúa como molde. Los cebadores son direccionales. En este caso, se diseñan dos cebadores de PCR, uno en cada extremo del VNTR y ”señalando” hacia el otro, Se inicia el mecanismo de síntesis de ida y PAGINA 151 ______________________________________________________________________ PÁGINA 152 vuelta entre los cebadores, promoviendo la síntesis in vitro de un gran número de copias de la región. Cebador 1 ----------------- (CA)n ---------------------------------- (GT)n -----------------Cebador 2 La muestra amplificada de copias idénticas se puede observar como una banda en un gel de electroforesis. Toda variación de tamaño de los microsatélites en diferentes 41 individuos se revelará en forma de bandas (de diferente tamaño) que migran hacia posiciones distintas en un gel. De esta manera, se pueden detectar todas las variaciones de tamaño de la repetición del microsatélite. Una proporción elevada de este tipo de análisis de PCR revela varios “alelos” marcadores o bandas con un número distinto de repeticiones. En la Figura 4-19 se presenta un esquema de la técnica de cartografía mediante el uso de microsatélites. Miles de de pares de cebadores de microsatélites puede producirse para detectar igualmente millares de loci marcadores. La Figura 4-20 contiene algunos datos reales que nos muestran como los marcadores moleculares pueden completar un mapa de un cromosoma humano. Se puede ver que el número de marcadores moleculares que han sido cartografiados es significativamente mayor al número de genes con fenotipos mutantes. Observe en la que hay tantos SNPs cartografiados que no pueden estar representados completamente sobre el mapa del cromosoma de la Figura 4-20, puesto que habría miles. Un centimorgan (1 unidad mapa) de DNA humano es un segmento enorme, cuyo tamaño se estima en una megabase (1 Mb = 1 millón de pares de bases o 1000 kb). Por tanto, es evidente la necesidad que se tiene de un conjunto de marcadores moleculares que permitan un análisis a una escala menor para la resolución de distancias más pequeñas. El tamaño real de DNA que equivale a una unidad mapa varía entre las especies; por ejemplo, en el parásito de la malaria Plasmodium falciparium, una unidad mapa = 17 kb. PAGINA 152 ______________________________________________________________________ PÁGINA 153 PAGINA 153 ______________________________________________________________________ PÁGINA 154 42 4.4 Cartografía del centrómero con tétradas lineales Los centrómeros no son genes, pero sí son regiones de DNA de vital importancia para la reproducción de los organismos vivos, por lo que son de gran interés en genética. En la mayoría de eucariotas, el análisis de recombinación no se puede utilizar para cartografiar los loci del centrómero, debido a que no presentan heterocigosidad que permita usarlos como marcadores. Sin embargo, en los hongos que producen tétradas lineales (véase Capítulo 3, página 105), los centrómeros sí pueden ser cartografiados. Emplearemos el hongo Neurospora como ejemplo. Recuerde que en hongos como Neurospora (un haploide), la división meiótica se produce a lo largo del eje mayor de las ascas, y cada meiocito produce una ordenación lineal de 8 ascosporas, denominada octada. Estas ocho ascosporas se forman a partir de los cuatro productos de la meiosis (una tétrada) seguidos de una mitosis postmeiótica. Expresado en los términos más simples, para la cartografía del centrómero se considera un locus génico y se plantea la pregunta ¿a qué distancia está dicho locus del centrómero asociado (el que está en el mismo cromosoma)? El método se basa en el hecho de que se formarán diferentes patrones de alelos en las tétradas lineales u octadas producidas en la meiosis con un entrecruzamiento en la región entre un gen y su centrómero. Considere un cruzamiento entre dos individuos, cada uno con un alelo diferente en un locus (por ejemplo A × a). La ley de Mendel de la segregación equitativa dicta que una octada siempre habrá cuatro ascosporas de genotipo A y cuatro de genotipo a, pero ¿cómo estarán ordenadas? Si no se ha producido entrecruzamiento en la región entre A/a y el centrómero, habrán dos bloques adyacentes de cuatro ascosporas en la octada (véase Figura 3-10, página 106). Sin embargo, si hay un entrecruzamiento 43 en esa región, habrá uno de cuatro patrones distintos en la octada, cada patrón está formado por bloques de dos alelos idénticos adyacentes. En la siguiente tabla se presentan algunos datos de un cruzamiento A × a. A A A A a a a a 126 a a a a A A A A 132 Octadas A a A A a A a A a a A a A a a A a a a A A a A A 9 11 10 Total = 300 a a A A A A A A 12 Las dos primeras columnas en el lado izquierdo de la tabla son de las meiosis sin entrecruzamiento en la región entre el locus A y el centrómero. Este tipo de ordenación de los productos de la meiosis se conocen como patrón de segregación de primera división (patrón MI) debido a que los tipos de alelos se segregan en dos núcleos hijos diferentes en la primera división meiótica. Las otras cuatro columnas son de meiocitos con un entrecruzamiento. Estos patrones se denominan patrones de segregación de segunda división (MII) debido a que se ha producido un entrecruzamiento en la región entre el locus y el centrómero, y los alelos A y a permanecen unidos en el núcleo al final de la primera división meiótica (Figura 4-21). No hay segregación en la primera división. Sin embargo, en la segunda división meiótica PAGINA 154 ______________________________________________________________________ PÁGINA 155 44 los alelos A y a segregan en núcleos separados. En la Figura 4-21 se presenta un esquema que muestra como se produce uno de estos patrones MII. Los otros patrones MII se producen de manera semejante, pero las cromátidas se mueven en diferentes direcciones durante la segunda división meiótica (Figura 4-22). Se puede ver que la frecuencia de las octadas con el patrón MII debería proporcional al tamaño de la región entre el centrómero y el locus A/a, y podría utilizarse para estimar el tamaño de dicha región. En el ejemplo, la frecuencia de M II es 42/300 = 14%. ¿Este porcentaje significa que el locus de tipo de apareamiento está a 14 unidades de mapa del centrómero? La respuesta es no, pero este valor puede ser utilizado para calcular el número de unidades de mapa que separa al centrómero del locus A. El valor de 14% es un porcentaje de meiosis y no se ajusta a la definición de unidades de mapa. Las unidades de mapa se definen como el porcentaje de cromátidas recombinantes que se producen en la meiosis. Puesto que un entrecruzamiento en cualquier meiosis produce un 50% de cromátidas recombinantes (cuatro de ocho; véase Figura 4-21), se debe dividir el 14% entre dos, para convertir la frecuencia de MII (una frecuencia de meiosis) en unidades de mapa (una frecuencia de cromátidas recombinantes). Por tanto, esta región debe tener siete unidades de mapa de tamaño, y esta medida sí que puede incorporarse en el mapa de este cromosoma. 4.5 Uso de la prueba de chi-cuadrado para el análisis de ligamiento En el análisis de ligamiento con frecuencia surge la siguiente pregunta: ¿están ligados estos dos genes? Algunas veces la respuesta es obvia debido a que la frecuencia de recombinación es significativamente menor que 50%, pero otras veces no. En ambas 45 situaciones se aplica un test estadístico para confirmar o negar de manera objetiva nuestra intuición. La prueba de χ2, que se vio en el Capítulo 3, es una herramienta útil para decidir si dos genes están ligados. ¿Cómo se aplica la prueba de χ2 al ligamiento? Como se ha discutido previamente en este capítulo, podemos inferir que dos genes están ligados en el mismo cromosoma si la FR es menor del 50%. Pero ¿qué pasa cuando los valores son cercanos al 50%? Utilizaremos la prueba de χ2 para evaluar un conjunto específico de datos de ligamiento. Supongamos un cruzamiento de progenitores homocigóticos para los genotipos A/A·B/B y a/a·b/b, que produce un dihíbrido de genotipo A/a·B/b, con el que se realiza un cruzamiento prueba con a/a·b/b. Un total de 500 individuos de la progenie se clasifican de la siguiente manera (escritos según los gametos del dihíbrido): 142 133 113 112 Total: 500 A·B a·b A·b a·B parental parental recombinante recombinante PAGINA 155 ______________________________________________________________________ PÁGINA 156 A partir de estos datos, la frecuencia de recombinantes es 225/500 = 45%. A partir de esta evidencia, el producto observado parece compatible con la existencia de ligamiento porque la FR es menor del 50% que se espera en la segregación independiente. Sin embargo, es posible que los genes no estén ligados y que las clases recombinantes sean menores del 50% solamente por efecto del azar. Por tanto, es 46 necesario realizar una prueba de χ2 para calcular la probabilidad de que este resultado se debe al azar. Como es habitual en las pruebas de χ2, el primer paso es calcular los esperados (E) para cada clase. Para el cálculo de E, inmediatamente surge el inconveniente de no tener una distancia de ligamiento precisa para usarla como valor esperado en la hipótesis de que los genes se encuentren ligados. ¿Están los genes separados una, 10, ó 45 m.u? Por tanto, no se puede examinar el ligamiento de manera directa. Sin embargo, se puede utilizar la hipótesis de la transmisión independiente (en otras palabras, la ausencia de ligamiento) para hacer una predicción más precisa. Si los resultados observados producen el rechazo de la hipótesis de no ligamiento, entonces inferimos que existe ligamiento. Este tipo de hipótesis, conocida como hipótesis nula, se utiliza en el análisis de χ2, ya que nos permite hacer una predicción experimental precisa que puede ser puesta a prueba. ¿Cómo podemos calcular los valores E de los gametos para la hipótesis de que no hay ligamiento? Una alternativa es hacer una predicción sencilla, basados en la primera y la segunda leyes de Mendel, de la siguiente manera: Valores E 0.5 B 0.25 A ; B 0.5 b 0.25 A ; b 0.5 B 0.25 a ; B 0.5 b 0.25 a ; b 0.5 A 0.5 a 47 Por lo tanto, se puede afirmar que si el par de alelos del dihíbrido segrega independientemente, habría una proporción 1:1:1:1 de tipos gaméticos. Por eso, es razonable el uso de 1/4 de 500 (ó 125), como proporción esperada de cada clase gamética. Sin embargo, observe que la proporción 1:1:1:1 es la esperada sólo si todos los genotipos son igualmente viables. Es frecuente que los genotipos no tengan la misma viabilidad debido a que los individuos que tienen ciertos alelos no sobreviven hasta llegar a adulto. Por tanto, la proporción de alelos 0.5:0.5 utilizada al inicio puede cambiar a 0.6 A : 0.4 a ó 0.45 B : 0.55 b. Se debería usar estas proporciones en la predicción de independencia. Se ordenan las clases genotípicas observadas en una cuadrícula para observar con mayor claridad las proporciones de alelos: Valores observados Segregación de Byb B b Total Segregación de Aya A a 142 112 113 133 255 245 Puede observarse que las proporciones son 246 500 255 500 para el alelo A, Total 254 246 500 245 500 para a, 254 500 para B y para b. Ahora se calcula los valores esperados bajo el supuesto de transmisión independiente multiplicando simplemente estas proporciones alélicas por el tamaño de la muestra. Por ejemplo, para encontrar el número esperado de los PAGINA 156 ______________________________________________________________________ PÁGINA 157 48 genotipos A B en la muestra, si las dos proporciones son combinadas aleatoriamente, se multiplicaran los siguientes elementos: Esperado (E) o valor para A B = (255/500) × (254/500) × 500 = 129.54 Con el uso de esta técnica de cálculo, se obtiene la cuadrícula completa de valores esperados, de la siguiente manera: VALORES ESPERADOS Segregación de Byb B b Total Segregación de Aya A a 129.54 124.46 125.46 120.56 255 245 Total 254 246 500 El valor de χ2 se calcula de la siguiente manera (O es el valor observado): Genotipo O E (O - E)2 / E AB 142 129.54 1.19 ab 133 120.56 1.29 Ab 113 125.46 1.24 aB 112 124.46 1.25 Total (que es igual al valor de χ2) = 4.97 El valor calculado de χ2 (4.97) sirve para encontrar el valor de la probabilidad correspondiente (p) mediante el uso de la tabla χ2 (revise la Tabla 3-1, página 99). Primero, es necesario determinar los grados de libertad para escoger la fila correcta de la tabla. Generalmente, el número de grados de libertad se define como el número de valores no independientes. El trabajar algunos “experimentos mentales” nos mostrará 49 que se quiere decir con esta afirmación en el caso presente. En una tabla de datos de 2 × 2 (del tipo usado anteriormente), puesto que los totales de filas y columnas viene dados por los resultados experimentales, cuando se especifica un valor dentro de la tabla, automáticamente se determinan los otros tres valores. Luego, hay solamente un valor no dependiente y por tanto sólo un grado de libertad. Una regla general útil para cuadrículas mayores es que el número de grado de libertad es igual al número de clases representadas en las columnas menos uno multiplicada por el número de clases representada en las filas menos uno. Si se aplica esta regla en el ejemplo: df (2 1) (2 1) 1 Por lo tanto, utilizando la Tabla 3-1, buscamos a lo largo de la fila correspondiente a un grado de libertad hasta que encontramos el valor χ2 calculado de 4.97. No todos los valores de χ2 se muestran en la Tabla 3-1, pero 4.97 está cerca al valor de 5.021. Por tanto, la probabilidad es muy cercana a 0.025 ó 2.5%. El valor de p es el valor de la probabilidad que buscamos, el de obtener una desviación de los valores esperado igual o mayor que la obtenida, Esta probabilidad es menor del 5%, luego la hipótesis de segregación independiente debe rechazarse. De esta manera, habiendo rechazado la hipótesis de no ligamiento, se infiere que los loci están probablemente ligados. PAGINA 157 ______________________________________________________________________ PÁGINA 158 4.6 Uso de la puntuación Lod para evaluar el ligamiento en genealogías humanas Los humanos tenemos miles de fenotipos heredados autosómicamente, y la cartografía de los genes que producen estos fenotipos puede parecer sencilla de llevar a cabo 50 mediante el uso de la recombinación. Sin embargo, el progreso en la cartografía de estos loci al inicio fue lento por varias razones. Primero, no se pueden realizar cruzamientos controlados en humanos; los genetistas intentan calcular frecuencias de recombinantes a partir de dihíbridos ocasionales que se producen aleatoriamente en las familias. Los apareamientos equivalentes a los cruzamientos prueba son muy poco frecuentes. Segundo, los apareamientos humanos generalmente producen sólo una pequeña cantidad de descendientes, haciendo difícil que los datos sean lo suficientemente numerosos como para calcular distancias de mapa que sean estadísticamente fiables. Para obtener valores significativos de la FR, se requieren muestras de tamaño grande. Sin embargo, cuando el tamaño de la descendencia de todos los individuos apareados es pequeño, se puede obtener una estima más fidedigna combinando los resultados de muchos apareamientos idénticos. La forma estándar de hacerlo es calcular la puntuación Lod. El término Lod es una abreviación de la expresión inglesa “Log de odds“, logaritmo de odds, donde odds es una razón de probabilidades). El método consiste simplemente en calcular dos probabilidades diferentes para obtener el conjunto específico de recombinantes observados en una familia. La primera probabilidad se calcula suponiendo una transmisión independiente, y la segunda probabilidad se calcula suponiendo un determinado grado de ligamiento. Luego, se calcula la razón (odds) de probabilidades y se obtiene el logaritmo de este número que es la puntuación Lod. El procedimiento se repite para un conjunto de distintos grados de ligamiento. El grado de ligamiento que produce la puntuación Lod mayor es el más probable. Veamos cómo se realiza este cálculo con un ejemplo. 51 Suponemos que se dispone de la información de una familia en la que se ha producido un apareamiento semejante a un cruzamiento prueba dihíbrido. Se supone también que es posible deducir el aporte de gametos y por tanto evaluar los gametos individuales en la recombinación. El dihíbrido es heterocigótico para un alelo dominante de una enfermedad (D/d) y para un marcador molecular (M1/M2). Se supone que se trata de un hombre y que los gametos que produce son D · M1 y d · M2. Su esposa es d/d · M2/M2. En la genealogía de la Figura 4-23 se muestra a sus seis hijos, clasificados como parentales (P) o recombinantes (R), en función de la contribución gamética de su padre. De los seis hijos, hay dos recombinantes, que representan una FR del 33%. Así, la FR inferior al 50% sugiere que el gen de la enfermedad y el marcador están ligados con una separación de entre 30 y 40 unidades de mapa. Sin embargo, los genes y los marcadores probablemente no están ligados; pueden estar distribuyéndose de manera independiente, pero el tamaño pequeño de la muestra nos lleva a obtener un resultado erróneo. Calcule la probabilidad de este resultado bajo varias hipótesis. Se presentan las proporciones esperadas de los genotipos parentales (P) y recombinantes (R) considerando tres valores de FR y con transmisión independiente: FR P P R R 0.5 0.25 0.25 0.25 0.25 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.3 0.35 0.35 0.15 0.15 0.2 0.4 0.4 0.1 0.1 La probabilidad de obtener los resultados en condiciones de transmisión independiente (FR del 50%), serán igual a: 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 B 0.00024 B 52 PAGINA 158 PÁGINA 159 donde B = número de posibles órdenes de nacimiento posible para los cuatro individuos parentales y los dos recombinantes. Para una FR = 0.2 (20%), la probabilidad es: 0.4 0.1 0.4 0.4 0.1 0.4 B 0.00026 B La razón de ambas probabilidades es 0.00026/0.00024 = 1.08 (observe que B se cancela). Por tanto, basándose en la información de esta familia, la hipótesis de una FR = 0.2 es 1.08 veces tan probable como la hipótesis de la transmisión independiente. Finalmente, se obtiene el logaritmo de la razón para calcular la puntuación Lod. En la siguiente tabla se presentan otras razones de probabilidad y la puntuación Lod respectiva: FR 0.5 0.4 0.3 0.2 Probabilidad 0.00024 0.00032 0.00034 0.00026 Proporción 1.0 1.33 1.41 1.08 Lod 0 0.12 0.15 0.03 No llama la atención que estos resultados nos remitan nuevamente a la sospecha inicial de que el valor de la FR está entre el 30% y el 40%, ya que bajo ésta hipótesis se 53 genera la mayor puntuación Lod. Sin embargo, este resultado no es suficiente como prueba definitiva de ligamiento. Más bien, esta información puede ser utilizada conjuntamente con nuevos apareamientos del mismo tipo (entre los mismos genotipos), combinando sus proporciones de probabilidad para una mejor evaluación de la hipótesis de ligamiento. Por ejemplo, suponga que se encuentra para una FR de 20%, las siguientes razones de probabilidad en cinco apareamientos independientes distintos: 1.08, 1.20, 1.05, 1.32 y 1.15. La probabilidad (odds) conjunta será el producto de estas probabilidades (odds) individuales; o sea, el producto de todos los numeradores divididos entre el producto de todos los denominadores, en un cálculo similar a la regla del producto. El producto da 2.07, lo que indica que el modelo de 20% de recombinación es dos veces más probable que el modelo de independencia. Debido a que los logaritmos son exponentes, en la práctica es más conveniente sumar las puntuaciones Lod a partir de apareamientos individuales. De esta manera, los investigadores individuales pueden fácilmente sumar sus valores a los acumulados por otros. Por convención, se considera que una puntuación Lod acumulativa de al menos 3 es un respaldo convincente para un valor específico de FR. Considere que los logaritmos son exponentes de la base 10; luego, una puntuación Lod de 3 representa un valor de FR que es 1000 veces (103 veces) tan probable como la hipótesis de no ligamiento, por tanto esta prueba es bastante rigurosa. La puntuación Lod para el 20% de recombinación a partir de los datos combinados del párrafo anterior es de 0.3148, un valor todavía bien alejado del valor de 3. 4.7 Estima de los entrecruzamientos múltiples no observados 54 En la discusión de los análisis de los cruzamientos prueba de tres puntos, algunas cromátidas parentales (no recombinantes) son producto de dobles entrecruzamientos. Estos entrecruzamientos inicialmente no pueden ser contados en la frecuencia de recombinantes, por lo que sesgan los resultados. Esta situación conduce a la percepción preocupante de que toda distancia de mapa basada en la frecuencia de recombinación puede subestimar la distancia física debido a la ocurrencia de entrecruzamientos múltiples no observados, alguno de cuyos productos pueden ser no recombinantes. Se han diseñado varias aproximaciones matemáticas creativas al problema de los entrecruzamientos múltiples. Se presentarán dos métodos. Primero, PAGINA 159 PÁGINA 160 se examinará el método originalmente trabajado por J. B. S. Haldane en los años iniciales de la genética. Función de mapa La aproximación que desarrolló Haldane fue concebida como una función de mapa, que es una fórmula que relaciona el valor observado de frecuencia de recombinantes con la distancia de mapa corregida para los entrecruzamientos múltiples. Esta aproximación se desarrolló relacionando la FR con el número promedio de entrecruzamientos (m) que se deben haber producido en el segmento de cromosoma durante la meiosis y después deduciendo que distancia de mapa debió haber producido este valor de m. Para encontrar la relación de FR a m, primero se deben analizar los productos de los varios entrecruzamientos posibles. En toda región cromosómica se puede esperar 55 meiosis con cero, uno, dos, tres, cuatro o más entrecruzamientos. Sorprendentemente, cero es la única clase realmente importante. Para ver por qué, considere lo siguiente. Es un hecho curioso y no intuitivo que cualquier número de entrecruzamientos produce una frecuencia de 50% de recombinantes dentro de esas meiosis. En la Figura 4-24 se muestra un ejemplo con entrecruzamientos simple y doble, pero es cierto para cualquier número de entrecruzamientos. Por tanto, el verdadero determinante de la FR es el tamaño relativo de las clases sin entrecruzamiento (la clase cero) comparada con las clases que tienen cualquier otro número de entrecruzamientos. Ahora, lo importante es calcular el tamaño de la clase cero. Los entrecruzamientos que suceden en una región cromosómica específica está bien descrita por una función estadística conocida como distribución de Poisson. La fórmula de Poisson en general describe la distribución de “éxitos” en muestras cuando la probabilidad promedio de un éxito es baja. Un buen ejemplo para ilustrar la idea es sumergir una red de juguete en un estanque de peces: la mayoría de veces no se pescará nada, una pequeña proporción de veces se pescará un pescado, una menor cantidad de veces se pescaran dos pescados y así sucesivamente. Esta analogía puede ser directamente aplicada a regiones cromosómicas que tienen 0, 1, 2 y más entrecruzamientos “exitosos” en diferentes meiosis. La fórmula de Poisson nos servirá para estimar la proporción de las clases con distintos números de entrecruzamientos. f i = (e-mmi)/i! Los términos de la fórmula significan lo siguiente: 56 e = base de logaritmo natural (aproximadamente 2.7) m = el número medio de éxitos en un tamaño de muestra definido i = el número actual de éxitos en una muestra de este tamaño fi = la frecuencia de muestras con i éxitos ! = el símbolo factorial (por ejemplo, 5! = 5 × 4 × 3 × 2 × 1) La distribución de Poisson nos dice que la frecuencia de la clase i = 0 (la primera) es: e m m0 0! Como m0 y 0! son ambos igual a 1, la fórmula se reduce a e-m. Ahora se puede escribir una función que relacione FR con m. La frecuencia de las clases con algún entrecruzamientos será 1 – e-m. Luego, en esas meiosis el 50% (1/2) de los productos serán recombinantes. Por lo tanto: RF 12 (1 em ) y esa fórmula es la función mapa que se ha estado buscando. PAGINA 160 PÁGINA 161 Veamos un ejemplo en el que FR se convierte en una distancia de mapa corregida para los entrecruzamientos múltiples. Se supone que en un cruzamiento prueba se obtiene una FR de 27.5% (0.275). Substituyendo este valor en la función nos permite encontrar la solución para m: 57 0.275 12 (1 e m ) luego e m 1 (2 0.275) 0.45 Realizando un cálculo, se obtiene que m = 0.8. Esto es, en promedio existen 0.8 entrecruzamientos por meiosis en esta región cromosómica. El paso final es convertir esta medida de frecuencia de entrecruzamiento en una distancia de mapa “corregida”. Todo lo que se debe hacer para convertir una unidad de mapa corregida es multiplicar por 50, la frecuencia promedio calculada, debido a que un entrecruzamiento produce 50% de recombinantes en promedio. Por tanto, el ejemplo PAGINA 161 PÁGINA 162 el valor numérico de m de 0.8 se convierte en una fracción recombinante corregida de 0.8 × 50 = 40 unidades de mapa corregidas. Observe que este valor es sustancialmente mayor que las 27.5 unidades de mapa deducido a partir de la FR observada. Observe que la función de mapa explica claramente porque es valor máximo de FR para genes ligados es el 50%. Conforma m se hace muy grande, e-m se aproxima a cero y la FR se aproxima a 1/2 ó 50%. La fórmula de Perkins En hongos, y otros organismos que producen tétradas, existe otra forma de compensar los entrecruzamientos múltiples —especialmente los dobles entrecruzamientos (el tipo que se espera sea el más común). En el análisis de tétradas de “dihíbridos” generalmente hay sólo tres tipos posibles de tétradas cuando los productos se clasifican según la 58 presencia de genotipos recombinantes y parentales. Es decir, de un cruzamiento AB × ab, se obtiene: Ditipo parental Tretratipo Ditipo no parental (PD) (T) (NPD) A·B A·B A·b A·B A·b A·b a·b a·B a·B a·b a·b a·B Los genotipos recombinantes son muestran en color rojo. Si los genes están ligados, se puede utilizar una técnica cartográfica simple para estimar su distancia, mediante la siguiente fórmula: distanciamapa RF 100(NPD 12 T) con esta fórmula se calcula el porcentaje total de recombinantes. Sin embargo, en la década de los 60, David Perkins desarrolló una fórmula para compensar el efecto de los dobles entrecruzamientos. La fórmula de Perkins nos permite estimar con más precisión la distancia de mapa: distancia mapacorregida 50(T 6NPD) No derivaremos esta fórmula, de la que nos limitaremos a decir que se basa en los totales esperados de las clases PD, T y NPD, de las meiosis con 0, 1 y 2 59 entrecruzamientos (se supone que las meiosis con un mayor número de entrecruzamientos son prácticamente inexistentes). Veamos un ejemplo: en un cruzamiento hipotético de A B × a b, la frecuencias observadas de las clases de tétradas son 0.56 PD, 0.41 T y 0.03 NPD. Mediante la fórmula de Perkins, encontramos las distancias de mapa corregidas entre los loci a b. 50[0.41 + (6 × 0.03)] = 50(0.59) = 29.5 m.u. Se compara este valor con otro no corregido y obtenido directamente a partir de la FR. Basándose en los mismos datos, se encuentra: distanciamapa no corregida 100( 12 T NPD) 100(0.205 0.03) 23.5 m.u. Esta distancia es 6 m.u. menor que la estima obtenida con la fórmula de Perkins porque no se corrigen los entrecruzamientos dobles. PAGINA 162 PÁGINA 163 A modo de digresión, cuando se trata de genes no ligados, ¿qué valores se esperan para PD, NPD y T? El tamaño de las clases PD y NPD será el mismo debido a la transmisión independiente. La clase T puede ser producida solamente a partir de entrecruzamientos entre cualquiera de los dos loci y sus respectivos centrómeros, y por lo tanto, el tamaño de la clase T dependerá del tamaño total de las dos regiones que hay 60 entre el locus y el centrómero. Sin embargo, la fórmula 1 2 T + NPD siempre daría 0.50, reflejando la transmisión independiente. Mensaje: La tendencia inherente a los entrecruzamientos múltiples de subestimar la distancia de mapa se puede evitar mediante el uso de funciones de mapa (en cualquier organismo) o la fórmula de Perkins (en hongos y otros organismos que producen tétradas). 4.8 Utilización conjunta de los mapas de recombinación y los mapas físicos Los mapas de recombinación han sido el tema principal de este capítulo. Estos mapas presentan los loci de genes que poseen alelos mutantes (y sus respectivos fenotipos) conocidos. La posición de estos loci sobre un mapa se determina a partir de la frecuencia de recombinación en la meiosis. Se supone que la frecuencia de recombinación es proporcional a la distancia que hay entre los dos loci en el mismo cromosoma; por tanto, la frecuencia de recombinación se utiliza como unidad de mapa. Esta cartografía basada en la recombinación de genes con fenotipos mutantes conocidos se ha venido realizando durante casi un siglo. Hemos visto como sitios de heterocigosidad molecular (no asociados con fenotipos mutantes) también se pueden incluir en un mapa de recombinación. Al igual que cualquier otro sitio del genoma en el que existe heterocigosis, estos marcadores moleculares son cartografiados por recombinación y después utilizados para “navegar” hacia un gen de interés biológico. Suponemos de forma perfectamente razonable que un mapa de recombinación representa el orden de los genes en el cromosoma, pero estos mapas son en realidad una construcción hipotética, según se afirmó inicialmente. Por el contrario, los mapas físicos 61 son los mapas más cercanos al mapa del genoma real que la ciencia puede llegar a obtener. El tema de mapa físico será examinado con detalle en el Capítulo 13, pero podemos adelantar algunos aspectos ahora. Un mapa físico es sencillamente un mapa del DNA genómico real, una secuencia de nucleótido de DNA muy grande donde se muestra la situación de los genes, cuán grande son, qué hay entre ellos y otras señales de interés. La unidad de distancia en el mapa físico es el número de bases de DNA. La kilobase es la unidad preferida por conveniencia. La secuencia completa de una molécula de DNA se obtiene descifrando primero la secuencia de un gran número de pequeños fragmentos de DNA genómico y después ensamblándolos en una única secuencia completa. La secuencia es a continuación “rastreada” por un ordenador, programado para analizar segmentos similares a genes en función de las características en su secuencia, incluyendo las secuencias señal para el inicio y el término de la transcripción. Cuando el programa de ordenador encuentra un gen, compara su secuencia con una base de datos pública donde están los genes de secuencia y función conocidas de otros organismos. En muchos casos, se logra encontrar una secuencia muy parecida de un gen cuya función se conoce en otra especie. En tales casos, las funciones de los dos genes también pueden ser parecidas. La similitud de la secuencia (a menudo proxima al 100%) se explica por la herencia de un gen desde un ancestro común y la conservación general de la secuencia funcional a través del tiempo evolutivo. Otros genes descubiertos por el ordenador no muestran similitud de secuencia con ningún otro gen de función conocida. Por lo que pueden ser considerados “genes en busca de una función”. Por su puesto, el investigador es quien busca y tiene que encontrar la función, 62 y no el gen. El conocimiento de la secuencia en diferentes individuos de una población permite encontrar sitios de PAGINA 163 PÁGINA 164 heterocigosidad molecular, que al igual que en los mapas de recombinación, actúan como hitos de orientación en el mapa físico. Considerando que los mapas físicos de muchos de los principales organismos que sirven de modelos genéticos están ahora disponibles, ¿son realmente necesarios los mapas de recombinación? ¿Podrían ser considerados como fuera de moda? La respuesta es que los dos mapas son utilizados conjuntamente en la búsqueda de la función de los genes para “triangular”, aplicando el principio que explicamos al inicio del capítulo sobre el uso los mapas de Londres. La aproximación general se ilustra en la Figura 4-25, que representa un mapa físico y un mapa de recombinación de la misma región del genoma. Ambos mapas contienen genes y marcadores moleculares. En la parte inferior de la Figura 4-25, se puede ver una sección de un mapa de recombinación, con las posiciones en el mapa de genes de fenotipos mutantes. No todos los genes han sido incluidos en este segmento. En algunos de estos genes la función se ha conocido mediante estudios bioquímicos o de cepas mutantes; por ejemplo, los genes de las proteínas A y B. El gen del medio es un “gen de interés” porque un investigador ha descubierto que tiene efecto sobre un aspecto del desarrollo que está siendo estudiado. El mapa físico puede ser útil para determinar su función. Los genes en el mapa físico que están en la región del gen de interés en el mapa de recombinación serán genes candidatos, cualquiera de los cuales podría ser el gen de interés. Se requieren estudios más completos para precisar la elección de uno de ellos. Si en este caso simple, se trata 63 de un gen cuya función se conoce en otros organismos, entonces se sugiere esta función para el gen de interés. De esa manera, el fenotipo cartografiado en el mapa de recombinación puede ser relacionado con una función deducida a partir del mapa físico. Los marcadores moleculares sobre ambos tipos de mapas (no mostrados en la Figura 425) pueden ser alineados para ayudar en el proceso de caracterización de esta región. Por lo tanto, vemos que ambos mapas contienen elementos de función: el mapa físico muestra una posible acción del gen en el nivel celular, mientras que el mapa de recombinación contiene la información relacionada con el efecto del gen en el nivel fenotípico. En algún etapa los dos son mapas deben “fusionarse” para entender la contribución del gen al desarrollo del organismo. Mensaje La unión de mapas de recombinación y mapas físicos pueden asignar una función bioquímica a un gen identificado por su fenotipo mutante. PAGINA 164 PÁGINA 165 Resumen En un cruzamiento prueba dihíbrido en Drosophila, Thomas Hunt Morgan encontró una desviación de la ley de Mendel de la transmisión independiente. Él propuso que los dos genes estaban localizados en el mismo par de cromosomas homólogos. Esta relación se denomina ligamiento. El ligamiento explica por qué las combinaciones génicas parentales permanecen juntas, pero no explica cómo se producen las combinaciones recombinantes (las no 64 parentales). Morgan postuló que durante la meiosis debería producirse un intercambio físico de partes del cromosoma a través de un proceso al que denominó entrecruzamiento. Como resultado de la rotura física y la unión de partes del cromosoma, se produce entrecruzamiento durante el estado de cuatro cromátidas en la meiosis. Así, hay dos tipos de recombinación meiótica. La recombinación debida a la transmisión independiente mendeliana, que produce frecuencias de recombinantes de 50%; y el entrecruzamiento, que produce frecuencias de recombinación generalmente menores del 50%. Conforme Morgan estudiaba más genes ligados, descubrió muchos valores diferentes para las frecuencias de recombinación y encontró que estos valores tenían correspondencia con las distancias reales entre los genes en un cromosoma. Alfred Sturtevant, estudiante de Morgan, desarrolló un método para determinar la distancia entre los genes sobre un mapa de ligamiento, basado en la FR. La forma más fácil de medir la FR es a través de cruzamientos prueba con un dihíbrido o un trihíbrido. Los valores de FR expresados como porcentaje pueden ser utilizados como unidades de mapa para construir un mapa cromosómico que muestre los loci génicos analizados. En hongos ascomicetos, los centrómeros también pueden ser localizados en el mapa midiendo las frecuencias de segregación en la segunda división. Los marcadores moleculares como los SNPs y los SSLPs también se utilizan para cartografiar cromosomas. Las “islas” de SNPs (haplotipos) son relativamente estables en el tiempo, y se manifiestan como desequilibrio de ligamiento. Los haplotipos se utilizan para encontrar alelos mutantes, pues los alelos de SNP que 65 permanecen en desequilibrio de ligamiento con un alelo mutante deben estar estrechamente ligados. Aunque la prueba básica para probar ligamiento es una desviación de la transmisión independiente, esta desviación puede no ser obvia en un cruzamiento prueba, y se se necesita un análisis estadístico. La prueba de χ2 es especialmente útil para determinar si los loci están ligados, ya que nos indica en que medida las observaciones se desvían del resultado esperado solamente por el azar. Los tamaños de muestra en los análisis de genealogías humanas son demasiado pequeños para permitir la cartografía, pero la acumulación de datos expresada mediante la puntuación Lod (logaritmo de razón de probabilidades), puede respaldar la hipótesis de ligamiento. Las puntuaciones Lod son acumulativas, por lo que todas las medidas realizadas en un intervalo específico del mapa pueden ser sumadas para producir una puntuación Lod acumulativa. Algunos entrecruzamientos múltiples pueden dar lugar a cromátidas no recombinantes, produciendo una subestimación de la distancia de mapa basada en la FR. La función de mapa, aplicable a todos los organismos, corrige este sesgo o tendencia. La fórmula de Perkins sirve para el mismo fin en el análisis de tétradas de hongos. En genética un mapa de recombinación suele usarse conjuntamente con un mapa físico, como el de la secuencia completa de DNA donde se indican todas las secuencias de tipo génico. El conocimiento de la posición del gen en ambos tipos de mapas nos permite relacionar la función celular con el efecto del gen en el fenotipo. 66 Términos clave centimorgan (cM) (p.138) coeficiente de coincidencia (c.o.c) (p.143) conformación cis (p.134) conformación trans (p. 134) cruzamiento prueba de tres puntos (p. 140) desequilibrio de ligamiento (p. 149) distribución de Poisson (p. 160) entrecruzamiento (p.133) frecuencia de recombinación (FR) (p. 138) función mapa (p. 150) genes ligados (p. 131) haplotipo (p. 149) hipótesis nula (p. 156) huella digital del DNA (p. 151) interferencia (p. 143) locus (p. 131) mapa cromosómico (p. 131) mapa de ligamiento (p. 138) mapa de recombinación (p. 131) mapa físico (p. 163) marcador microsatélite (p. 151) marcador minisatélite (p.151) 67 marcador molecular (p. 146) número variable de repeticiones en tándem (VNTR) (p. 151) octada (p. 154) patrón de segregación en la primera división (patrón MI) (p. 154) patrón de segregación en la segunda división (MII) (p. 154) polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) (p. 148) polimorfismo de un único nucleótido (SNP) (p. 147) polimorfismo de longitud de secuencia simple (SSLP) (p. 151) producto del entrecruzamiento (p.133) puntuación Lod (p.158) unidad de mapa genético (m.u.) (p.138) PAGINA 165 PÁGINA 166 Problemas resueltos Problema resuelto 1. La genealogía humana de esta página muestra un caso de herencia del raro síndrome uña-rótula (uñas y rótulas deformadas). Muestra también el genotipo de grupo sanguíneo ABO de cada persona. Ambos loci implicados son autosómicos. a. ¿Es dominante o recesivo el fenotipo del síndrome uña-rótula? De argumentos que respalden su afirmación. b. A partir de la información que se muestra en esta genealogía ¿existe evidencia de ligamiento entre el gen uña-rótula y gen del tipo sanguíneo ABO? ¿Por qué sí o por qué no? 68 c. Si existen pruebas de ligamiento, dibuje los alelos en los homólogos implicados de los abuelos. Si no hay pruebas de ligamiento, dibuje la configuración de las dos parejas de homólogos. d. Según su modelo, ¿que descendientes corresponden a recombinantes? e. ¿Cuál es la mejor estima de la FR? f. Si el varón III-1 se casa con una mujer normal del tipo sanguíneo O, ¿qué probabilidad hay de que su primer hijo sea de tipo sanguíneo B y tenga el síndrome uñarótula? AQUÍ VA UN GRAFICO Solución a. Lo más probable es que el síndrome uña-rótula sea dominante. Se nos dice que es una anormalidad rara, por lo que las personas no afectadas que entran a formar parte de la familia por casamiento es muy improbable que lleven el supuesto alelo recesivo para el síndrome uña-rótula. Si se llama N al alelo que causa el síndrome, entonces todas las personas con el síndrome son heterocigóticas N/n, porque todas (incluyendo probablemente a la abuela) proceden de un matrimonio con personas normales n/n. Se observa que el síndrome se manifiesta en tres generaciones sucesivas, otra indicación de un patrón de herencia dominante. b. Hay pruebas de la existencia de ligamiento. Observe que la mayor parte de las personas afectadas, aquellos que tienen el alelo N, también tienen el alelo IB; lo más probable es que estos alelos estén ligados en el mismo cromosoma. 69 c. AQUÍ VA UN GRÁFICO (La abuela debe llevar ambos alelos recesivos para que pueda dar descendencia de genotipo i/i y n/n.) d. Observe que el casamiento entre los abuelos es equivalente a un cruzamiento prueba; por lo que los recombinantes en la generación II son: II-5 : n IB/n i y II-8: N i/n i mientras que el resto no son recombinantes, siendo bien N IB/n i o n i/n i. e. Observe que el matrimonio entre los abuelos y los dos primeros matrimonios de la generación II son idénticos, y equivalentes a cruzamientos prueba. Tres de los 16 descendientes son recombinantes (II-5, II-8 y III-3). El cruzamiento entre II-6 y II-7 no es un cruzamiento prueba, pero de los cromosomas aportados por II-6 puede deducirse que son no recombinantes. De esta manera, FR = 3/18, o sea, un 17%. f. AQUÍ VA UN GRÁFICO (III-1♂) (Tipo normal O ♀) Gametos Tipo sanguíneo B, uña-rótula 70 Las dos clases parentales son siempre iguales, y también las dos clases recombinantes. Por lo tanto, la probabilidad que el primer niño tenga el síndrome uña-rótula y sea del grupo sanguíneo B es del 41.5%. Problema resuelto 2. En Drosophila, el alelo b determina cuerpo negro, y b+, el fenotipo salvaje, cuerpo marrón. En otro gen, el alelo wx determina alas cerosas y wx+ determina alas no cerosas, el fenotipo salvaje. El alelo cn de un tercer gen determina ojos cinabrio, y el alelo cn+ determina ojos rojos, el fenotipo salvaje. Se realiza un cruzamiento prueba con una hembra heterocigótica para estos tres genes y se clasifica la progenie de 1000 individuos de la siguiente manera: 5 tipo salvaje; 6 negras, cerosas, cinabrio; 69 cerosas, cinabrio; 67 negras; 382 cinabrio; 379 negras, cerosas, 48 cerosas y 44 negras, cinabrio. Observe que la progePAGINA 166 PÁGINA 167 nie se describe según el fenotipo mutante. a. Explique estos números. b. Represente estos alelos en su posición apropiada en los cromosomas de los triples heterocigotos. c. Si la explicación que propone lo requiere, calcule la interferencia. Solución a. Una recomendación general es que sea metódico. En este caso, una buena idea para escribir los genotipos es que pueden ser inferidos a partir de los fenotipos. El cruce es un cruzamiento prueba del siguiente tipo: 71 b+/b · wx+/wx · cn+/cn × b/b · wx/wx · cn/cn Observe las distintas parejas de clases de progenie en función de su frecuencia. Ahora puede adivinar que las dos clases mayores representan los cromosomas parentales, las dos clases de unos 68 individuos representan entrecruzamientos simples en una región, que las dos clases de alrededor de 45 individuos representan entrecruzamientos simples en otra región y que las otras dos clases de aproximadamente 5 individuos representan los dobles entrecruzamientos. Se pueden escribir las progenies como clases derivadas de los gametos de la hembra, agrupados de la siguiente manera: b+ · wx+ · cn 382 b · wx · cn+ 379 b+ · wx · cn 69 b · wx+ · cn+ 67 b+ · wx · cn+ 48 b · wx+ · cn 44 b · wx · cn 6 b+ · wx+ · cn+ 5 1000 Esta clasificación confirma que los pares de clases son, en realidad, genotipos recíprocos que se producen a partir de cero, uno o dos entrecruzamientos. 72 Al inicio, puesto que no se conocen los progenitores de la hembra triple heterocigótica, no se puede aplicar la definición de recombinación en la que los genotipos de los gametos se comparan con los dos genotipos de los progenitores que aportaron la constitución genética de un individuo. Pero, reflexionando un poco, los únicos tipos que tiene sentido como parentales según los datos presentados son b+/b+ · wx+/wx+ · cn/cn y b/b · wx/wx · cn+/cn+, ya que son las clases gaméticas más comunes. Ahora podemos calcular las frecuencias de recombinantes. Para b–wx, RF 69 67 48 44 22.8% 1000 para b–cn, RF 48 44 6 5 10.3% 1000 RF 69 67 6 5 14.7% 1000 y para wx–cn, Por tanto, el mapa es: AQUÍ VA UN GRAFICO 73 b. Los cromosomas parentales de la hembra triple heterocigótica eran: AQUÍ VA UN GRAFICO c. El número esperado de dobles recombinantes es: 0.103 × 0.147 × 1000 = 15.141. El número observado es 6 + 5 = 11, de manera que la interferencia se puede calcular como: I = 1 – (11/15.141) = 1 – 0.726 = 0.274 = 27.4% Problema resuelto 3. Se cruza una cepa haploide de Neurospora de genotipo nic+ ad con otra cepa haploide de genotipo nic ad+. De este cruzamiento, se aislaron en total 1000 ascas lineales y se clasificaron como se muestra en la tabla de abajo. Cartografíe los loci ad y nic en relación al centrómero y entre ellos. 1 2 3 4 5 6 7 nic + · ad nic+ · ad+ nic+ · ad+ nic+ · ad nic+ · ad nic+ · ad+ nic+ · ad+ nic + · ad nic+ · ad+ nic+ · ad+ nic+ · ad nic+ · ad nic+ · ad+ nic+ · ad+ nic + · ad nic+ · ad+ nic+ · ad nic · ad nic · ad+ nic · ad nic · ad nic + · ad nic+ · ad+ nic+ · ad nic · ad nic · ad+ nic · ad nic · ad nic · ad + nic · ad nic · ad+ nic+ · ad+ nic+ · ad nic+ · ad+ nic+ · ad nic · ad + nic · ad nic · ad+ nic+ · ad+ nic+ · ad nic+ · ad+ nic+ · ad nic · ad + nic · ad nic · ad nic · ad+ nic · ad+ nic · ad nic · ad+ nic · ad + nic · ad nic · ad nic · ad+ nic · ad+ nic · ad nic · ad+ 808 1 90 5 90 1 5 74 PAGINA 167 PÁGINA 168 Solución ¿En qué principios podemos basarnos para resolver este problema? Es una buena idea empezar por algo sencillo, como calcular las distancias de los dos locus al centrómero. No se sabe si los loci ad y nic están ligados, pero no es necesario saberlo. La frecuencia de patrones MII en cada locus nos permite deducir la distancia del locus al centrómero. (Ya nos preocuparemos después si se trata del mismo centrómero.) Recordemos que un patrón MII es todo aquel que no presenta bloques de cuatro. Empezemos con la distancia entre el locus nic y el centrómero. Todo lo que se tiene que hacer es sumar los tipos de ascas 4, 5, 6 y 7, ya que son patrones M II para el locus nic. El total es 5 + 90 + 1 + 5 = 101 de 1000, lo que equivale al 10.1%. En este capítulo se ha visto que para convertir el porcentaje en unidades de mapa debemos dividir entre 2, lo que da 5.05 m.u. AQUÍ VA UN GRAFICO Se procede de la misma manera con el locus ad. El total de los patrones MII, está representado por los tipos 3, 5, 6 y 7 cuyos valores son 90 + 90 + 1 + 5 = 186 de 1000 ó 18.6%, que equivalen a 9.3 m.u. AQUÍ VA UN GRAFICO 75 Ahora, debemos poner los dos loci juntos y decidir de entre las siguientes alternativas cuál es compatible con la distancia al centrómero que hemos calculado: a. AQUÍ VA UN GRÁFICO b. AQUÍ VA UN GRÁFICO c. AQUÍ VA UN GRÁFICO Una mezcla de sentido común y capacidad de análisis simple nos indica qué alternativa es la correcta. Primero, una inspección de las ascas revela que el tipo simple más común es el etiquetado con 1, el cual contiene más del 80% de todas las ascas. Este tipo contiene solamente los genotipos nic+ · ad y nic · ad+, y por lo tanto son los genotipos parentales. Así pues, deducimos que la recombinación es muy baja y que los loci están efectivamente ligados. Esto descarta la alternativa a. Consideraremos ahora la alternativa c. Si esta alternativa fuera correcta, un entrecruzamiento entre el centrómero y el locus nic generaría no solamente patrones MII para este locus, sino también para el locus ad, ya que está más lejos del centrómero que el locus nic. Las ascas producidas por la alternativa c deberían ser: AQUÍ VA UN GRAFICO Recordemos que el locus nic presenta patrones MII en ascas de los tipos 4, 5, 6 y 7 (un total de 101 ascas). De todos éstos, el tipo 5, del que hemos estado hablando, contiene 90 ascas. Por tanto, la alternativa c parece ser correcta porque las ascas del tipo cinco comprenden 90% de las ascas MII para locus nic. Esta relación no se daría si la 76 alternativa b fuera la correcta, ya que los entrecruzamientos a ambos lados del centrómero generarían patrones MII independientes entre los loci nic y ad. ¿Es la distancia de mapa de nic a ad simplemente 9.30 – 5.05 = 4.25 m.u? Cerca, pero no suficientemente. La mejor forma de calcular la distancia de mapa entre loci es siempre a través de la frecuencia de recombinación. Utilizando la información de las ascas se podría contar todas las ascosporas recombinantes, pero es más sencillo se se emplea la formula RF 12 T NPD. Las ascas T son de la clase 3, 4 y 7, y las ascas NPD son de las clases 2 y 6. Por tanto, RF [ 12 (100) 2] / 1000 5.2 % ó 5.2 m.u., y un mapa mejor es: AQUÍ VA UN GRAFICO La razón para la subestimación de la distancia ad – centrómero, calculada a partir de la frecuencia de MII, es la formación de dobles entrecruzamientos, que puede producir un patrón MI para ad, como el del tipo 4 de asca: AQUÍ VA UN GRAFICO PAGINA 168 PÁGINA 169 Problemas Problemas básicos 1. En una planta de genotipo: 77 AQUÍ VA UN GRÁFICO se lleva a cabo un cruzamiento prueba con: Gráfico Si los dos loci están separados 10 m.u. ¿qué proporción de la descendencia será AB/ab? 2. El locus A y el locus D están tan estrechamente ligados que nunca se observa recombinación entre ellos. Si Ad/Ad se cruza con aD/aD y la F1 se cruza entre sí, ¿qué fenotipos se observará en la F2 y en qué proporciones? 3. Los loci R y S están separados 35 m.u. Si una planta de genotipo AQUÍ VA UN GRAFICO se autofecunda, ¿qué fenotipos se observarán en la progenie y en qué proporciones? 4. El realiza el cruzamiento E/E · F/F × e/e · f/f , y la F1 se retrocruza con el parental recesivo. Los genotipos de la progenie son inferidos a partir de los fenotipos. Los genotipos de la progenie, ordenados según la contribución gamética del progenitor heterocigótico, se encuentran en las siguientes proporciones: E·F 2 6 E·f 1 6 78 e·F 1 6 e·f 2 6 Explique estos resultados 5. Una cepa de Neurospora con genotipo H · I se cruza con una cepa de genotipo h · i. La mitad de la progenie es H · I, y la otra mitad es h · i. Explique cómo es posible este resultado. 6. Un animal hembra de genotipo A/a · B/b se cruza con un macho doble recesivo (a/a · b/b). La progenie incluye: 442 A/a · B/b, 458 a/a · b/b, 46 A/a · b/b, y 54 a/a · B/b. Explique estos resultados. 7. Si A/A · B/B se cruza con a/a · b/b y con la F1 se realiza un cruzamiento prueba, ¿qué porcentaje de la progenie del cruzamiento prueba será de genotipo a/a · b/b si los dos genes: (a) no están ligados; (b) están completamente ligados (no existe entrecruzamiento entre ellos); (c) están separados 10 m.u.; (d) están separados 24 m.u.? 8. En un organismo haploide, los loci C y D están separados 8 m.u. A partir de un cruzamiento C d × c D, calcule la proporción de cada una de las siguientes clases en la progenie: (a) C D; (b) c d; (c) C d; (d) todos los recombinantes. 9. Una mosca de la fruta con genotipo BR/br se utiliza en un cruzamiento prueba con otra de genotipo br/br. En el 84% de las meiosis no se observan quiasmas entre los 79 genes ligados y en el 16% de las meiosis hay un quiasma entre los genes. ¿Qué proporción de la progenie será B r/b r? 10. En el maíz, se realizó un cruzamiento prueba de tres puntos. Los resultados y el análisis de recombinación se muestran en la tabla de abajo. Es un cruzamiento prueba de tres puntos estándar (p = hojas púrpuras, = hojas verdes; v = plántulas resistentes a virus, = plántulas sensibles; b = semillas de borde marrón, = semillas de color liso). El estudio y los resultados se muestran en los apartados de la a a la c. / · / · / P · · Gametos F1 × p/p · v/v · b/b p·v·b +/p · +/v · +/b × p/p · v/v · b/b (prueba) a. Determine qué genes están ligados. b. Dibuje un mapa que muestre las distancias en unidades de mapa. c. Si es apropiado, calcule la interferencia Recombinantes entre Fenotipo de Clase Gametos F1 Números la progenie 1 ver sen lis · · 3 210 2 pur res bor p·v·b 3 222 80 p–b p–v v–b 3 ver res lis ·v· 1 024 R R 4 pur sen bor p· ·b 1 044 R R 5 pur res lis p·v· 690 R R 6 ver sen bor · ·b 678 R R 7 ver res bor ·v·b 72 R R 8 pur sen lis p· · 60 R R 1 500 2 200 Total 10 000 3 436 PAGINA 169 PÁGINA 170 Problema paso a paso 10 1. Dibuje una representación de las plantas del maíz parentales (P), F1 y de la utilizada como individuo de prueba, y utilice flechas para mostrar exactamente cómo podría realizar el experimento. Indique de dónde se obtienen estas semillas. 2. ¿Por qué se emplea repetidas veces el signo , incluso para genes distintos? ¿Por qué estos genes no lleva a confusión? 3. ¿Cómo puede ser un fenotipo púrpura y marrón (por ejemplo) al mismo tiempo? 4. ¿Es significativo que los genes se describan en el orden p-v-b en el problema? 5. ¿Qué es un individuo prueba y por qué se utiliza en este análisis? 6. ¿Qué representa la columna marcada como “Fenotipo de la progenie”? Por ejemplo, en la clase 1, ¿qué significa “ver sen lis”? 7. ¿Qué representa la columna “Gametos”, y en qué es distinta de la columna de nombre “Gametos F1”? ¿Por qué es importante en la recombinación la comparación de estos dos tipos de gametos? 81 8. ¿Qué meiosis es la que importa en este estudio? Señálela en su esquema. 9. ¿Por qué no se muestran los gametos del progenitor prueba? 10. ¿Por qué hay sólo ocho clases fenotípicas? ¿Falta alguna? 11. ¿Qué clases genotípicas (y en qué proporciones) se esperarían si cada uno de los genes estuviera en cromosomas distintos? 12. ¿A qué corresponden los cuatro tamaños de las clases (dos muy numerosas, dos intermedias, otras dos intermedias, y dos muy pequeña)? 13. ¿Qué se puede decir sobre el orden de los genes, tras una simple inspección de las clases fenotípicas y sus frecuencias? 14. ¿Qué tipo de distribución de clases fenotípicas se esperaría si sólo dos de los genes estuvieran ligados? 15. ¿Qué significa la palabra “punto” en un cruzamiento prueba de tres puntos? ¿Implica esa palabra la existencia de ligamiento? ¿Cómo sería un cruzamiento de cuatro puntos? 16. ¿Cuál es la definición de recombinante, y cómo se aplica aquí? 17. ¿Qué significado tienen las columnas de “Recombinantes entre”? 18. ¿Por qué existen solamente tres columnas bajo el título “Recombinantes entre”? 19. ¿Qué significan las R y cómo son determinan? 20. ¿Qué significan los totales de las columnas y cómo se usan en este análisis? 21. ¿Cuál es el criterio para diagnosticar la existencia de ligamiento? 22. ¿Qué es una unidad mapa? ¿Es lo mismo que un centimorgan? 23. En un cruzamiento prueba de tres puntos como éste, ¿por qué la F1 y el progenitor prueba son considerados como parentales para el cálculo de la recombinación? (En cierto sentido son parentales.) 82 24. ¿Cuál es la fórmula de la interferencia? ¿Cómo se calculan las frecuencias “esperadas” de la fórmula del coeficiente de coincidencia? 25. ¿Por qué la parte c del problema dice “Si es apropiado”? 26. ¿Cuánto trabajo cuesta obtener un número tan grande de descendientes en el maíz? ¿Cuál de los tres genes cuesta más trabajo de evaluar? ¿Cuántos descendientes, aproximadamente, representa una mazorca? 11. Se tiene una línea de Drosophila que es homocigótica para los alelos autosómicos a, b y c que están ligados en este mismo orden. Se cruzan hembras de esta línea con machos homocigóticos para los alelos de tipo salvaje. Los machos heterocigóticos de la F1 se cruzan entonces con sus hermanas heterocigóticas. En la F2 se obtienen los siguientes fenotipos (donde las letras denotan fenotipos recesivos y los signos “ ” indican fenotipos salvajes): 1364 , 365 a b c, 87 a b , 84 + c, 47 a , 44 b c, 5 a c, y 4 b . a. ¿Cuál es la frecuencia de recombinación entre a y b? ¿Entre b y c? (Recuerde, que no hay entrecruzamiento en el macho de Drosophila.) b. ¿Qué es el coeficiente de coincidencia? 12. R. A. Emerson cruzó dos líneas puras de maíz y obtuvo una F1 de fenotipo salvaje que era heterocigótica para los tres siguientes alelos que determinan el fenotipo recesivo: an determina la antera; br, determina braquítico y f, determina delgado. Realizó un cruzamiento prueba entre la F1 y una variedad homocigótica recesiva para los tres genes y obtuvo una progenie con los siguientes fenotipos: 355 anteras; 339 braquíticos y delgados; 88 salvajes; 55 anteras, braquíticos y delgados; 21 delgados; 17 anteras y braquíticos; 2 braquíticos; 2 anteras y delgados. a. ¿Qué genotipos tenían las líneas parentales? 83 b. Dibuje un mapa de ligamiento de los tres genes (incluya las distancias de mapa). c. Calcule el valor de la interferencia. 13. El cromosoma 3 de maíz tiene tres loci (b para el color intensificado de la planta, v para planta verdosa, y lg para planta sin lígula). Un cruzamiento prueba entre un triple recesivo con plantas F1 heterocigóticas para los tres genes, produce una descendencia con los siguientes genotipos: 305 v lg, 275 b , 128 b lg, 112 v , 74 lg, 66 b v , 22 y 18 b v lg. Indique el orden de los genes en el cromosoma, la distancia de mapa entre los genes y el coeficiente de coincidencia. 14. Los grudis son organismos haploides útiles (aunque de ficción) como herramientas genéticas puras. Un grudi salvaje es gordo, de la cola larga y con flagelos. Existen líneas mutantes delgadas, o sin cola o sin flagelos. Los grudis se pueden aparear entre sí (aunque son tan vergonzosos que no sabemos como lo hacen) y producir recombinantes. PAGINA 170 PÁGINA 171 Un grudi salvaje se cruza con uno de cuerpo delgado sin cola ni flagelo. Se producen 1000 grudis bebés y se clasifican como se muestra en la figura. Asigne los genotipos, y dibuje el mapa de los tres genes. (Problema 14 es de Burton S. Guttman.) AQUÍ VA UN GRAFICO 84 15. En Drosophila el alelo dp+ determina alas largas y dp determina alas cortas (“regordete”). En un locus distinto, e+ determina cuerpo gris y e determina cuerpo de color ébano. Ambos loci son autosómicos. Empezando con líneas parentales puras, se realizó el siguiente cruzamiento: P largas, ébano ♀ × cortas, gris ♂ F1 cortas, gris ♀ × cortas, ébano ♂ (línea pura) F2 largas, ébano 54 largas, plomo 47 cortas, plomo 52 cortas, ébano 47 200 Utilice la prueba de χ2 para determinar si estos loci están ligados. Al hacerlo, (a) establezca la hipótesis, (b) calcule el valor de χ2, (c) el valor de p, (d) indique que significa el valor de p, (e) establezca su conclusión, (f) infiera la constitución cromosómica de los parentales, la F1, los machos prueba y la progenie. 16. La madre de una familia de 10 hijos es del grupo sanguíneo Rh+. También manifiesta una afección muy rara (eliptocitosis, fenotipo E, ) que determina que los glóbulos rojos de la sangre sean ovales y no redondos, pero sin producir efectos clínicos adversos. El padre es Rh– (carece de antígenos Rh+) y tiene los glóbulos rojos normales (fenotipo e). Los hijos son 1 Rh+ e, 4 Rh+ E y 5 Rh– e. Se dispone de información sobre los padres de la madre, que son Rh+ E y Rh– e. Uno de los diez 85 hijos (que es Rh+ E) se casa con alguien cuyo genotipo es Rh+ e, y tienen un hijo Rh+ E. a. Dibuje la genealogía de la familia completa. b. ¿Coincide la genealogía con la hipótesis de que el alelo Rh+ es dominante y el alelo Rh– es recesivo? c. ¿Cuál es el mecanismo de transmisión genética de la eliptocitosis? d. ¿Podrían estar los genes que dirigen los fenotipos E y Rh en el mismo cromosoma? Si así es, estime la distancia de mapa entre ellos, y comente su resultado. 17. A partir de varios cruzamientos del tipo general A/A · B/B × a/a · b/b, los individuos de la F1 A/a · B/b se utilizaron en cruzamientos prueba con individuos a/a · b/b. Los resultados son los que siguen: Progenie del cruzamiento prueba Cruzamiento prueba A/a ·B/b a/a ·b/b A/a ·b/b a/a ·B/b 1 310 315 287 288 2 36 38 23 23 3 360 380 230 230 4 74 72 50 44 con la F1 del cruce Utilice la prueba de χ2 para decidir si existe evidencia de ligamiento en cada caso. 86 18. En las dos genealogías dibujadas aquí, los símbolos con una barra vertical indican deficiencia de en la enzima esteroide sulfatasa, y aquellos con una barra horizontal indican una deficiencia en la enzima ornitina transcarbamilasa. AQUÍ VA UN GRAFICO Primera genealogía Segunda genealogía a. ¿Hay alguna evidencia en estas genealogías de los genes que determinan estas deficiencias están ligados? b. Si los genes estuvieran ligados, ¿existe alguna evidencia en la genealogía de entrecruzamiento entre ellos? c. Indique los genotipos de estos individuos hasta donde sea posible. 19. En la genealogía acompañante, las líneas verticales señalan ceguera para los colores del tipo conocido como protanopía, y las rayas horizontales ceguera para los colores del tipo deuteranopía. Se tratan de dos afecciones diferentes que provocan distintos defectos en la percepción de los colores; cada una determinada por un gen distinto. PAGINA 171 PÁGINA 172 AQUÍ VA UN GRÁFICO a. ¿Muestra la genealogía alguna evidencia de ligamiento entre los genes? b. Si hubiera ligamiento, ¿hay alguna evidencia en la genealogía de entrecruzamiento? 87 Explique las respuestas a las preguntas en a y b con la ayuda de un esquema. c. ¿Puede calcular el valor de la recombinación entre estos genes? ¿Se trata de transmisión independiente o entrecruzamiento? 20. En el maíz se obtuvo un triple heterocigoto con los alelos mutantes s (encogido), w (aleurona blanca) e y (endospermo ceroso). Con este triple heterocigoto se realizó un cruzamiento prueba y se produjo la siguiente progenie: 116 encogidos y blancos; 4 completamente salvajes; 2538 encogidos, 601 encogidos, cerosos; 626 blancos; 2708 blancos y cerosos; 2 encogidos, blancos y cerosos y 113 cerosos. a. Determine si alguno de estos tres loci están ligados; si lo están, calcule la distancia de mapa entre ellos. b. Indique el orden de los alelos en los cromosomas del triple heterocigoto empleado en el cruzamiento prueba. c. Si es apropiado, calcule la interferencia. 21. a. Se hizo un cruzamiento, en ratones, A/a · B/b × a/a · b/b y se obtuvo la descendencia: 25% A/a · B/b, 25% a/a · b/b, 25% A/a · b/b, 25% a/a · B/b Con la ayuda de un esquema simplificado de la meiosis, explique las proporciones obtenidas. b. Se realiza un cruzamiento de ratones C/c · D/d × c/c · d/d y se obtiene la siguiente progenie: 88 45% C/c · d/d, 45% c/c · D/d, 5% c/c · d/d, 5% C/c · D/d Con la ayuda de un esquema simplificado de la meiosis, explique las proporciones obtenidas. 22. En la pequeña planta modelo Arabidopsis, el alelo recesivo hyg confiere resistencia de la semilla al fármaco higromicina, y el alelo recesivo her, de otro gen diferente, confiere a las semillas resistencia a herbicidas. Una planta homocigótica hyg/hyg · her/her se cruzó con otra de tipo salvaje y la F1 se cruzó entre sí. Las semillas producidas en la F2 se colocaron en placas petri que contenían higromicina y herbicida. a. Si los dos genes no están ligados, ¿qué porcentaje de semillas se espera que crezcan? b. De hecho, crecieron 13% de las semillas. ¿Este porcentaje de crecimiento apoya la hipótesis de ausencia de ligamiento? Explique su respuesta. Si no es así, calcule el número de unidades de mapa que hay entre los loci. c. Bajo su hipótesis, si se realiza un cruzamiento prueba con los miembros de la F1, ¿qué proporción de semillas crecerán en el medio que contiene higromicina y herbicida? 23. En la genealogía de la Figura 4-23, calcule la puntación Lod para una frecuencia de recombinación del 34%. 24. En un organismo diploide de genotipo A/a; B/b; D/d, los genes están en parejas de cromosomas homólogos distintos. Los dos esquemas siguientes tratan de mostrar 89 anafases (la fase de separación de los cromosomas o cromátidas) en células individuales. Una línea representa a un cromosoma o cromátida y el punto indica la posición del centrómero. Diga, para cada uno de los genotipos, si representan la mitosis, la meiosis I, la meiosis II, o si es imposible determinarlo. AQUÍ VA UN GRÁFICO PAGINA 172 PÁGINA 173 25. Se realiza el siguiente cruzamiento en Neurospora: al-2+ × al-2. El análisis de tétradas lineales revela que la frecuencia de segregación en la segunda división es del 8%. a. Dibuje dos ejemplos de patrones de segregación de la segunda división en este cruzamiento. b. ¿Qué se puede calcular utilizando el valor del 8%? 26. A partir de un cruzamiento arg-6 · al-2 × arg-6+ · al-2+ en hongos, ¿qué genotipos de las esporas estarán tétradas desordenadas que sean (a) ditipos parentales? (b) tetratipos? y (c) ditipos no parentales? 27. En una región cromosómica se ha estimado que el número medio de entrecruzamientos por meiosis es dos. En esta región, ¿qué proporción de meiosis se espera que produzcan (a) cero entrecruzamientos? (b) un entrecruzamiento? (c) dos entrecruzamientos? 90 28. En Neurospora se realizó un cruzamiento entre una cepa que porta el A para el tipo de apareamiento y el alelo mutante arg-1, con otra cepa que tiene los alelos a para el tipo de apareamiento y el alelo salvaje arg-1 ( ). Se aislaron cuatrocientas octadas lineales, que se clasificaron en las siete categorías que se muestran en la tabla. (Por simplicidad, se muestran como tétradas.) a. Deduzca el orden en el ligamiento de los genes para el tipo de apareamiento y el locus arg-1. Incluya el centrómero, o los centrómeros, en los mapas que elabore. Señale todos los intervalos en unidades de mapa. b. Haga un esquema de la división meiótica que da lugar a la clase 6. Márquela con claridad. 1 2 3 4 5 6 7 A · arg A·+ A · arg A · arg A · arg A·+ A·+ A · arg A·+ A·+ a · arg a·+ a · arg a · arg a·+ a · arg a · arg A·+ A · arg A·+ A · arg a·+ a · arg a·+ a·+ a·+ a · arg a·+ 36 2 127 125 100 4 6 El problema paso a paso 1. ¿Los hongos son generalmente haploides o diploides? 2. ¿Cuántas ascosporas hay en el asca de Neurospora? ¿Su respuesta es compatible con los números presentados en este problema? Explique cualquier discrepancia. 91 3. ¿Qué es el tipo de apareamiento en los hongos? ¿Cómo cree que se determinan experimentalmente? 4. ¿Los símbolos A y a tienen algo que ver con los conceptos de dominancia o recesividad? 5. ¿Qué significa el símbolo arg-1? ¿Cómo podría probar este genotipo? 6. ¿Cómo se relaciona el símbolo arg-1 con el símbolo de ? 7. ¿Qué significa la expresión tipo salvaje? 8. ¿Qué significa la palabra mutante? 9. ¿La función biológica de los alelos mostrados tiene alguna relación con la solución de este problema? 10. ¿Qué significa la expresión análisis de octadas lineales? 11. En general, ¿qué puede aprenderse de un análisis de tétradas lineales que no se pueda aprender de un análisis de tétradas no ordenadas? 12. ¿Cómo se realiza un cruzamiento en hongos como Neurospora? Explique cómo aislar el asca y las ascosporas individuales. ¿Cómo se relaciona el término tétrada con los términos asca y octada? 13. ¿En que punto del ciclo de vida de Neurospora se produce la meiosis? (Muéstrelo a través de un esquema del ciclo de vida.) 14. ¿Que tiene que ver el Problema 28 con la meiosis? 15. ¿Puede escribir los genotipos de las dos cepas parentales? 16. ¿Por qué se muestran sólo cuatro genotipos en cada clase? 17. ¿Por qué existen solamente siete clases? ¿De cuántas maneras se ha enseñado que pueden clasificarse las tétradas en general? ¿Cuál de estas clasificaciones se aplican tanto a las tétradas lineales como PAGINA 173 PÁGINA 174 92 a las no ordenadas? ¿Puede aplicar estas clasificaciones a las tétradas en este problema? (Clasifique cada clase de todas las maneras posible.) ¿Puede pensar en más posibilidades en este cruzamiento? Si es así, ¿por qué no se muestran estas clases? 18. ¿Cree usted que existen varias ordenaciones de esporas distintas dentro de cada clase? ¿Por qué estos diistintas ordenaciones de esporas no cambian la clase? 19. ¿Por qué no se incluye en la lista la siguiente clase? a·+ a·+ A · arg A · arg 20. ¿Qué significa la expresión el orden en el ligamiento? 21. ¿Qué es un intervalo genético? 22. ¿Por qué el problema habla de “centrómero o centrómeros” y no solamente de “centrómero”? ¿Cuál es el método general para cartografiar los centrómeros en el análisis de tétradas? 23. ¿Cuál es la frecuencia total de ascosporas de A · ? (¿Calculó esta frecuencia empleando la fórmula o mediante inspección directa? ¿Es un genotipo recombinante? Si es así, ¿es el único genotipo recombinante?) 24. Las dos primeras clases son las más comunes y tienen aproximadamente la misma frecuencia. ¿Qué le dice esta información? ¿Cuál es su contenido de genotipos recombinantes y parentales? 93 29. Un genetista estudia 11 diferentes parejas de loci en Neurospora mediante cruzamientos del tipo a · b × a+ · b+ y el análisis posterior de 100 ascas lineales de cada cruzamiento. Para facilitar la transcripción de los resultados en una tabla, el genetista organiza los datos como si los 11 pares de genes tuviera la misma designación —a y b— según se muestra abajo. Elabore el mapa de los loci entre sí y su relación con el centrómero para cada cruzamiento. Número de tipos de ascas a·b a·b a·b a·b a · b+ a·b a·b + a+ · b+ a+ · b a·b a · b+ + a·b a+ · b a+ · b+ a+ · b a+ · b + a+ · b a+ · b+ a+ · b+ a+ · b a+ · b+ + Cruzamiento a + · b + a+ · b a+ · b a · b+ a·b a·b a·b + 1 34 34 32 0 0 0 0 2 84 1 15 0 0 0 0 3 55 3 40 0 2 0 0 4 71 1 18 1 8 0 1 5 9 6 24 22 8 10 20 6 31 0 1 3 61 0 4 7 95 0 3 2 0 0 0 8 6 7 20 22 12 11 22 9 69 0 10 18 0 1 2 94 10 16 14 2 60 1 2 5 11 51 49 0 0 0 0 0 30. Se analizan tres cruzamientos distintos de Neurospora basados en tétradas no ordenadas. Cada cruzamiento combina un par de genes ligados diferentes. Los resultados se presentan en la siguiente tabla: Cruzamiento Progenitores Ditipo Tetratipo Ditipo no (parental) (%) (%) parental (%) 1 a · b+ × a+ · b 51 45 4 2 c · d+ × c+ · d 64 34 2 3 e · f+ × e+ · f 45 50 5 En cada cruzamiento, calcule: a. La frecuencia de recombinación (FR). b. La distancia de mapa no corregida, basada en la FR. c. La distancia de mapa corregida, basada en la frecuencia de tétradas. d. La distancia de mapa corregida, basada en la función mapa. 31. En el cromosoma 4 de Neurospora, el gen leu3 está a la izquierda del centrómero y siempre segrega en la primera división, mientras que el gen cys2 está a la derecha del centrómero y segrega en la segunda división con una frecuencia de 16%. En un cruzamiento entre una cepa leu3 y una cepa cys2, calcule las frecuencias esperadas de las siguientes 7 clases de tétradas lineales donde l = leu3 y c = cys2. (Ignore los entrecruzamientos dobles y múltiples). 95 (i) l c (ii) l + (iii) l c (iv) l c (v) l c (vi) l + (vii) l + lc l+ l+ +c ++ +c +c ++ +c ++ ++ ++ +c ++ ++ +c +c l+ lc l+ lc PAGINA 174 PÁGINA 175 32. Un mejorador del arroz ha obtenido un triple heterocigoto que tiene tres alelos recesivos para flores albinas (al), arista de la espiga marrón (b), y hojas con pelusa (fu), todos emparejados con sus respectivos alelos salvajes. Se realizó un cruzamiento prueba con el triple heterocigoto. Los fenotipos de la progenie fueron: 170 tipo salvaje 150 albina, marrón, pelusa 5 marrón 3 albina, pelusa 710 albina 698 marrón, pelusa 42 pelusa 38 albina, marrón a. ¿Están ligados estos genes? Si es así, haga un esquema del mapa señalando las distancias entre los loci. (No se moleste en hacer la corrección por entrecruzamientos múltiples.) 96 b. Los triples heterocigotos fueron originalmente producidos por el cruzamiento de dos líneas puras. ¿Cuáles eran los genotipos de estas líneas? 33. En un hongo, un mutante prolina (pro) se cruzón con un mutante histidina (his). El análisis de tétradas no lineales dio el siguiente resultado: his his his pro his pro pro pro his pro his pro 6 82 112 a. ¿Están los genes están ligados o no? b. Indique en un mapa (si estuvieran ligados) o en dos (si no estuvieran ligados), las distancias de mapa basadas directamente en la frecuencia de recombinación, cuando sea apropiado. c. Si existe ligamiento, realice las corrección de las distancias debida a los entrecruzamientos múltiples (elija solamente una manera de hacerlo). 34. En el hongo Neurospora, una cepa auxotrófica para tiamina (alelo mutante t) se cruzó con otra cepa auxotrófica para metionina (alelo mutante m). Se aislaron las ascas lineales y se clasificaron en los siguientes grupos: Par de Tipo de asca 97 esporas 1y2 t t t t tm tm 3y4 t tm m tm 5y6 m t tm t 7y8 m m m m m Número 260 76 4 54 1 5 a. Determine las relaciones de ligamiento entre estos dos genes y su(s) centrómero(s) y entre ellos mismos. Especifique las distancias en unidades de mapa. b. Dibuje un diagrama para mostrar el origen del tipo de asca con una única asca representativa (segunda por la derecha). 35. Una genetista de maíz quiere obtener una planta que tenga los tres fenotipos dominantes antocianina (A), penacho largo (L) y planta enana (D). En su colección de líneas puras, las únicas líneas que llevan estos alelos son AA LL dd y aa ll DD. También tiene una línea completamente recesiva aa ll dd. Decide cruzar las dos primeras y realizar un cruzamiento prueba con el híbrido resultante para obtener la progenie de plantas con fenotipo deseado (que podría tener el genotipo Aa Ll Dd en este caso). Ella sabe que los tres genes están ligados en el orden escrito y que la distancia entre los loci A/a y L/l es 16 unidades de mapa y entre L/l y D/d es de 24 unidades de mapa. a. Haga un esquema de los cromosomas de los progenitores, del híbrido y del individuo prueba. 98 b. Haga un esquema del entrecruzamiento(s) necesario para producir el genotipo deseado. c. ¿Qué porcentaje de la progenie del cruzamiento prueba tendrá el fenotipo buscado? d. ¿Qué suposiciones ha hecho (si ha hecho alguna)? 36. En la planta modelo Arabidopsis thaliana se utilizaron en un cruzamiento los siguientes alelos: T = presencia de tricomas t = ausencia de tricomas D = plantas altas d = plantas enanas W = cutícula cerosa w = cutícula no cerosa A = presencia del pigmento a = ausencia del pigmento antocianina púrpura (blanco) Los loci T/t y D/d están ligados y se encuentran a 26 m.u. en el cromosoma 1, mientras que los loci W/w y A/a están ligados y separados entre sí 8 m.u. en el cromosoma 2. 99 Una línea pura doble homocigótica recesiva sin tricomas y de cutícula no cerosa se cruza con otra línea pura doble homocigótica recesiva enana y blanca. a. ¿Qué apariencia tendrá la F1? b. Represente los cromosomas 1 y 2 de los progenitores y de la F1, indicando el orden de los alelos. c. Si se realiza un cruzamiento prueba con individuos de la F1, ¿qué proporción de la progenie tendrá el fenotipo recesivo para los cuatro alelos? 37. En maíz, se realiza el cruzamiento WW ee FF × ww EE ff. Los tres loci están ligados de la siguiente manera: AQUÍ HAY UN GRÁFICO Suponga que no existe interferencia. a. Se realiza un cruzamiento prueba con la F1, ¿qué proporción de la progenie será de genotipo ww ee ff? PAGINA 175 PÁGINA 176 b. Se realiza un cruzamiento de la F1 consigo misma: ¿qué proporción de la progenie será ww ee ff? 38. En hongos, se realizó el cruzamiento · × c · m; y se recopilaron las tétradas no lineales (no ordenadas). Se obtuvieron los siguientes resultados: Total m c cm cm 112 cm 82 100 m m c c 6 a. A partir de este resultado, calcule la frecuencia de recombinantes simples. b. Compare la función mapa de Haldane con la fórmula de Perkins para convertir el valor de FR en una distancia de mapa “corregida”. c. En la derivación de la fórmula de Perkins, solamente se consideró la posibilidad de meiosis con cero, uno, o dos entrecruzamientos. ¿Podría explicar este límite cualquier discrepancia con los valores calculados? Explique brevemente (no necesita hacer cálculos). 39. En un cruzamiento de ratones, se emplearon los siguientes alelos: W = andar bailarín w = andar normal G = color gris normal g = albino B = cola torcida b = cola recta Un ratón bailarín, gris y con la cola torcida se cruza con otro ratón que camina normal, albino y con cola recta; después de varios años, se obtiene la siguiente descendencia: bailarín bailarín no bailarín no bailarín bailarín bailarín no bailarín no bailarín Total gris albino gris albino gris albino gris albino cola torcida cola torcida cola recta cola recta cola recta cola recta cola torcida cola torcida 18 21 19 22 4 5 5 6 100 a. ¿Cuáles eran los genotipos de los dos ratones progenitores en el cruzamiento? b. Haga un esquema de los cromosomas de los padres. 101 c. Si deduce que existe ligamiento, diga los valores de las unidades de mapa y muestre cómo los ha obtenido. 40. Considere el cruzamiento en Neurospora ; ×f;p Se sabe que el locus /f está muy cerca del centrómero en el cromosoma 7 —de hecho está tan cerca que nunca se produce una segregación en la segunda división. Se conoce también que el locus /p está en el cromosoma 5, a una distancia tal que hay un 12% promedio de segregaciones en la segunda división. Con esta información, ¿qué proporción habrá de octadas que sean a. ditipos parentales con patrones MI para ambos loci? b. ditipos no parentales con patrones MI para ambos loci? c. tetratipos con patrones MI para /f y patrones MII para /p? d. tetratipos con patrones MII para /f y patrones MI para /p? 41. En un hongo haploide, los genes al-2 y arg-6 están separados 30 unidades de mapa en el cromosoma 1, mientras que los genes lys-5 y met-1 están separados 20 unidades de mapa en el cromosoma 6. En el siguiente cruzamiento: al-2 ; met-1 × arg-6 ; lys-5 ¿qué proporciones de la progenie sería prototrófica ; ? 42. Los alelos recesivos: k (ojos arriñonados en vez de redondos como el tipo salvaje), c (ojos amoratados en vez de rojos como el tipo salvaje) y e (cuerpo ébano en vez de gris como es el tipo salvaje), permiten la identificación de estos tres genes en el 102 cromosoma 3 de Drosophila. Hembras con ojos arriñonados y amoratados se aparearon con machos ébano. La F1 fue de tipo salvaje. Del cruzamiento prueba con las hembras F1 utilizando machos kk cc ee, se obtuvo la siguiente progenie: k k k k c c e e c c e e Total 3 876 67 49 44 58 899 4 2000 a. Determine el orden de los genes y la distancia de mapa entre ellos. b. Indique como son los cromosomas de los progenitores y de la F1. c. Calcule la interferencia y diga qué piensa de su significado. Problemas para pensar 43. A partir de progenitores con genotipos A/A · B/B y a/a · b/b, se obtuvo un dihíbrido. Con este dihíbrido se realizó un cruzamiento prueba y se obtuvo la siguiente progenie en el orden que se indica: A/a · B/b, a/a · b/b, A/a · B/b, A/a · b/b, a/a · b/b, A/a · B/b y a/a · B/b Calcule la puntuación Lod de estos resultados suponiendo los siguientes valores de FR: (a) 10%, (b) 20% y (c) 30%. 44. Utilice la función de mapa de Haldane para calcular la distancia de mapa corregida cuando la FR medida es: 5%, PAGINA 176 PÁGINA 177 103 10%, 20%, 30% y 40%. Represente en un gráfico la FR verssus la distancia de mapa corregida y utilícelo para responder a la siguiente pregunta: ¿cuándo se debería usar la función mapa? 45. Un individuo heterocigótico en cuatro genes, A/a · B/b · C/c · D/d, se cruza con a/a · b/b · c/c · d/d, y se obtiene una descendencia de 1000 individuos que se clasifica según la contribución gamética de los progenitores heterocigóticos de la siguiente manera: a·B·C·D A·b·c·d A·B·C·d a·b·c·D a·B·c·D A·b·C·d A·B·c·d a·b·C·D 42 43 140 145 6 9 305 310 a. ¿Qué genes están ligados? b. Si se han cruzado dos líneas puras para obtener los individuos heterocigóticos, ¿cuáles podrían haber sido sus genotipos? c. Dibuje un mapa de ligamiento de los genes ligados, mostrando el orden y la distancia que los separa en unidades de mapa. d. Si es pertinente, calcule un valor de interferencia. 46. Un alelo autosómico N en humanos produce anormalidades en las uñas y rótulas, conocidas como síndrome uña-rótula. Considere un matrimonio en el que un miembro de la pareja tiene el síndrome uña-rótula y tipo sanguíneo A mientras que el otro miembro de la pareja tiene las uñas y rótulas normales y el tipo sanguíneo O. 104 Este matrimonio tiene algunos hijos con síndrome uña-rótula y tipo sanguíneo A. Suponga que niños no emparentados de este grupo fenotípico se hacen adultos, se casan entre sí y tienen hijos. En la segunda generación se observan cuatro fenotipos con los siguientes porcentajes: Síndrome de uña-rótula, grupo sanguíneo A 66% Uña-rótula normal, grupo sanguíneo O 16% Uña-rótula normal, grupo sanguíneo A 9% Síndrome de uña-rótula, grupo sanguíneo O 9% Haga un análisis completo de estos datos, ofreciendo una explicación de la frecuencia relativa de los cuatro fenotipos. (Para la base genética de los tipos sanguíneos, véase la página 255). 47. Suponga que en Drosophila se encuentran tres parejas de alelos: x+ y x, y+ e y, y z+ y z. Como indican los símbolos, cada alelo de tipo no salvaje es recesivo respecto de su alelo de tipo salvaje. Un cruzamiento entre hembras heterocigóticas de estos tres loci y machos salvajes produce una descendencia con los siguientes genotipos: 1010 x+ · y+ · z+ hembras, 430 x · y+ · z machos, 441 x+ · y · z+ machos, 39 x · y · z machos, 32 x+ · y+ · z machos, 30 x+ · y+ · z+ machos, 27 x · y · z+ machos, 1 x+ · y · z macho y 0 x · y+ · z+ hembras. a. ¿En qué cromosoma de Drosophila están los genes? b. Dibuje los cromosomas relevantes en la progenitora hembra heterocigótica mostrando el orden de los alelos. 105 c. Calcule la distancia de mapa entre los genes y el coeficiente de coincidencia. 48. A partir de los cinco conjuntos de datos presentados en la siguiente tabla, determine el orden de los genes por inspección directa —es decir, sin calcular los valores de recombinación. Los fenotipos recesivos se representan mediante letras minúsculas y los dominantes con el signo . Fenotipos observados en cruzamientos prueba de 3 puntos Conjuntos de datos 2 3 4 1 30 40 4 6 232 31 339 84 77 137 201 77 142 194 31 291 77 4 3 235 1 34 46 1 317 58 10 2 0 21 72 203 c b bc a a c ab a b c 5 305 0 28 107 124 30 1 265 49. A partir de los datos de fenotipo presentados en la siguiente tabla para dos cruzamientos prueba de tres puntos en (1) a, b y c y en (2) b, c y d, determine el orden en que están dispuestos los cuatro genes a, b, c y d, y las tres distancias de mapa entre ellos. Los fenotipos recesivos se simbolizan por letras minúsculas y los fenotipos dominantes por signos . a b a c b c a c a b c b 1 2 669 139 3 121 2 2280 653 2215 106 b c d b b d c d d c b c 8 441 90 376 14 153 65 141 50. El padre del Sr. Spock, el primer oficial de la nave espacial Enterprise, proviene del planeta Vulcano; la madre del Sr. Spock es terrícola. Los habitantes de Vulcano tienen las orejas puntiagudas (determinadas por el alelo P), ausencia de adrenales (determinada por el alelo A), y el corazón a la derecha (determinado por el alelo R). Todos estos alelos son dominantes sobre los alelos de los terrícolas normales. Los tres loci son autosómicos y están ligados, como se muestra en este mapa de ligamiento. AQUÍ HAY UN GRÁFICO PAGINA 177 PÁGINA 178 Si el Sr. Spock se casa con una mujer terrícola y no existe interferencia (genética), ¿qué proporción de sus hijos tendrá a. fenotipo de Vulcano para los tres caracteres? b. fenotipo terrícola para los tres caracteres? c. orejas y corazón de Vulcano y adrenales terrícolas? d. orejas de Vulcano y corazón y adrenales terrícolas? (El problema 50 ha sido tomado de D. Harrison, Problems in Genetics. AddisonWesley, 1970.) 51. En una planta diploide, los tres loci A, B y C están ligados de la siguiente manera: AQUÍ HAY UN GRÁFICO Dispone de una planta (le llamaremos la planta progenitora), con la constitución A b c/ a B C. a. Suponiendo que no hay interferencia, si la planta se autofecunda, ¿qué proporción de la progenie tendrá el genotipo a b c / a b c? 107 b. Suponiendo nuevamente que no existe interferencia, si la planta progenitora se cruza con una planta a b c/a b c, ¿qué clases genotípicas se encontrarán en la progenie? ¿cuáles serán sus frecuencias si tiene 1000 descendientes? c. Repita la parte b, pero esta vez suponga que existe un 20% de interferencia entre las regiones. 52. La genealogía presentada a continuación es de una familia con dos fenotipos anormales raros: la esclerosis azul (un defecto que produce huesos frágiles), representada mediante símbolos de borde grueso, y la hemofilia, representada por un símbolo con un cuadrado negro en el centro. Los miembros representados por símbolos completamente negros presentan ambos desórdenes. Los números en algunos símbolos corresponden al número de individuos de esos tipos. AQUÍ HAY UN GRÁFICO a. ¿Qué patrón de herencia muestra cada condición en esta genealogía? b. Deduzca el genotipo de tantos miembros de la la familia como sea posible. c. ¿Existe evidencia de ligamiento? d. ¿Existe evidencia de transmisión independiente? e. ¿Se puede afirmar que algún miembro de la familia es recombinante (esto es, formado por al menos un gameto recombinante)? 53. Los genes humanos para el daltonismo y de la hemofilia están en el cromosoma X y muestran una frecuencia de recombinación de 10%. El ligamiento entre un gen patológico y otro no perjudicial se puede utilizar en la prognosis genética. Se muestra abajo una parte de una genealogía mayor. Los símbolos negros indican que el sujeto tiene hemofilia, y los marcados con una X indican daltonismo. ¿Qué 108 información podría ofrecer a las mujeres III-4 y III-5 respecto a la probabilidad de tener hijos con hemofilia? AQUÍ HAY UN GRÁFICO (El problema 53 se ha adaptado de J. F. Crow, Genetics Notes: And Introduction to Genetics. Burguess, 1983.) 54. Un genetista cartografía los genes A, B, C, D y E mediante cruzamientos de 3 puntos. El primer cruzamiento de líneas puras es: A/A · B/B · C/C · D/D · E/E × a/a · b/b · c/c · d/d · e/e El genetista realiza un cruzamiento entre la F1 con un progenitor prueba recesivo y clasifica la progenie según la contribución gamética del progenitor F1: A·B·C·D·E a·b·C·d·E A·B·C·d·E a·b·C·D·E A·b·C·d·E a·B·C·D·E A·b·C·D·E a·B·C·d·E 316 314 31 39 130 140 17 13 1000 El segundo cruzamiento de líneas puras es: A/A · B/B · C/C · D/D · E/E × a/a · B/B · c/c · D/D · e/e PAGINA 178 PÁGINA 179 109 El genetista cruza de la F1 de este cruzamiento con un individuo prueba recesivo y obtiene: A·B·C·D·E a·B·c·D·e A·B·c·D·e a·B·C·D·E A·B·C·D·e a·B·c·D·E a·B·C·D·e A·B·c·D·E 243 237 62 58 155 165 46 34 1000 El genetista también sabe que los genes D y E se transmiten independientemente. a. Dibuje un mapa de estos genes, mostrando las distancias en unidades de mapa cuando sea posible. b. ¿Existe alguna evidencia de interferencia? 55. En la planta Arabidopsis, los loci para el tamaño de la vaina (L, larga; l, corta) y pelos en el fruto (H, con pelos; h, lisa) están ligados y separados 16 unidades de mapa en el mismo cromosoma. Se realizaron los siguientes cruzamientos: (i) L H / L H × l h / l h → F1 (ii) L h / L h × l H / l H → F1 Si se cruza la F1 del cruzamiento (i) con la F1 del cruzamiento (ii): a. ¿Qué proporción de la progenie se espera que sea de genotipo l h/l h? b. ¿Qué proporción de la progenie se espera que sea de genotipo L h/l h? 56. En maíz (Zea mays), el mapa genético de una parte del cromosoma 4 es como se muestra abajo, donde w, s y e representan alelos mutantes recesivos que afectan el color y la forma del polen: 110 AQUÍ HAY UN GRÁFICO Si se realiza el siguiente cruzamiento: / × wse/wse y se realiza un cruzamiento prueba entre la F1 e individuos prueba w s e / w s e. Si supone que no hay interferencia en esta región del cromosoma. ¿qué proporción de la progenie tendrá los siguientes genotipos? a. b. c. d. e. f. g. h. wse se w e ws w e s 57. Cada viernes por la noche, la estudiante de genética Lucía Alelo, exhausta de estudiar, va a la bolera de la asociación de estudiantes para distraerse. Pero sigue obsesionada por sus estudios de genética. Un carril de la bolera sólo tiene cuatro bolas: dos rojas y dos azules. Se lanzan contra los bolos, tras lo cual se recogen y devuelven aleatoriamente al extremo del carril. Conforme pasa la tarde, Lucía observa un patrón familiar en el modo como se devuelven las cuatro bolas. Compulsivamente, contó los diferentes patrones. ¿Qué patrones cree que observó? ¿Cuáles eran sus frecuencias? y ¿Qué relevancia tiene este tema para la genética? 58. En análisis de tétradas, el orden de ligamiento de los loci p y q es el siguiente: AQUÍ HAY UN GRÁFICO Suponga que en la región i, no hay entrecruzamiento en el 88% de las meiosis y existe un entrecruzamiento simple en el 12% de las meiosis; 111 en la región ii, no hay entrecruzamiento en el 80% de las meiosis y existe un entrecruzamiento simple en el 20% de las meiosis; y no hay interferencia (en otras palabras, lo que pasa en una región no afecta a lo que pueda suceder en la otra región). ¿Qué proporciones de tétradas serán de los siguientes tipos? (a) MIMI, PD; (b) MIMI, NPD; (c) MIMII, T; (d) MIIMI, T; (e) MIIMII, PD; (f) MIIMII, NPD; (g) MIIMII, T. (Nota: El patrón M que se escribe primero es el que pertenece al locus p) Pista: La forma más fácil de resolver este problema es comenzando por el cálculo de las frecuencias de las ascas con entrecruzamientos en ambas regiones, en la región i, en la región ii, y en ninguna de las regiones. Entonces determine el resultado de los patrones MI y MII. 59. En un experimento con levaduras haploides, se tienen dos cultivos diferentes. Cada uno crecerá en medio mínimo al que se le añade arginina, pero ninguno lo hará con medio mínimo solamente. (Un medio mínimo está formado por sales inorgánicas y azúcar.) Empleando los métodos apropiados, se inducen el apareamiento de ambos cultivos. Las células diploides se dividen meióticamente y forman tétradas no ordenadas. Alguna de estas ascosporas crecerán en medio mínimo. Se clasifican un número grande de las tétradas para el fenotipo ARG– PAGINA 179 PÁGINA 180 (que requiere arginina) y ARG+ (independiente de arginina) y se registran los siguientes datos: Segregación de ARG– : ARG+ 112 Frecuencia (%) 4:0 3:1 2:2 40 20 40 a. Utilizando símbolos de su propia elección, asigne genotipos a los dos cultivos parentales. Describa los genotipos de los segregantes para cada uno de los tres tipos de segregación. b. Si hay más de un locus que controla los requerimientos de arginina, ¿están ligados estos loci? 60. Un análisis de RFLP de dos líneas puras A/A · B/B y a/a · b/b muestra que la primera era homocigótica para un alelo largo de RFLP (l) y la segunda para el alelo pequeño (s). Se cruzaron las dos líneas puras para formar la F1 que se retrocruzó con la segunda línea pura. Se obtuvo una progenie de mil individuos con los siguientes genotipos: Aa Bb ss Aa Bb ls aa bb ls aa bb ss Aa bb ss Aa bb ls aa Bb ls aa Bb ss 9 362 11 358 43 93 37 87 a. ¿Qué sugieren estos resultados respecto al ligamiento? b. Si es pertinente, dibuje un mapa. c. Incorpore los fragmentos de RFLP en su mapa de la manera como se muestra en la Figura 4-15. 113 FIGURAS FIGURA INICIAL En la izquierda se muestra el mapa de recombinación de uno de los cromosomas de Drosophila (el organismo de la imagen de la derecha), donde se muestran los loci génicos cuyas mutaciones producen fenotipos conocidos. (Dennis Kunkel Microscopy, Inc.) Dos mapas son mejores que uno Figura 4-1 Estos mapas de Londres ilustran el principio que a menudo se necesitan varios mapas para llegar al lugar que nos interesa. El mapa del metro londinense (“the Tube”) se utiliza para llegar a una dirección en una calle que se muestra en el plano de calles. En genética existen dos tipos de mapas genéticos que suelen ser útiles para situar un gen, lo que conduce la comprensión de su estructura y su función. (Harper Collins Publisher Ltd., a la izquierda, y Transport for London, a la derecha) Los alelos ligados tienden a heredarse juntos Figura 4-2 Herencia simple de dos genes localizados en el mismo par cromosómico. Los genes están juntos en un cromosoma tanto en los progenitores como en los descendientes. El entrecruzamiento produce nuevas combinaciones alélicas 114 Figura 4-3 El intercambio de partes de los cromosomas mediante el entrecruzamiento puede producir gametos cuyas combinaciones alélicas difieren de la combinación parental. Los quiasmas son los sitios de entrecruzamiento Figura 4-4 En la fotografía se ven varios quiasmas durante la meiosis en el testículo de un saltamontes (John Cabisco / Visuals Unlimited) El entrecruzamiento es entre cromátidas y no entre cromosomas Figura 4-5 Los entrecruzamientos se producen en el estado de cuatro cromátidas. El entrecruzamiento no puede producirse en el estado de dos hebras (antes de la replicación del DNA) puesto que en algunas tétradas puede verse más de dos productos diferentes a partir de una única meiosis. El círculo blanco indica la posición del centrómero. Cuando las cromátidas hermanas son visibles, el centrómero aparece sin replicar. Los entrecruzamientos múltiples pueden incluir más de dos cromátidas Figura 4-6 Los entrecruzamientos dobles pueden incluir (a) tres cromátidas o (b) cuatro cromátidas. Los entrecruzamientos producen recombinantes Figura 4-7 Los recombinantes se producen en las meiosis en las que se produce un entrecruzamiento entre cromátidas no hermanas. En genes ligados la frecuencia de recombinación es menor del 50% 115 Figura 4-8 Un cruzamiento prueba nos permite demostrar que la frecuencia de recombinación que produce un entrecruzamiento entre genes ligados es menor del 50%. Las distancias de mapa generalmente son aditivas Figura 4-9 Una región cromosómica que contiene tres genes ligados. Debido a que las distancias de mapa son aditivas, el cálculo de A–B y A–C, nos permite deducir dos posibles valores para la distancia B–C. Las regiones grandes tienen más entrecruzamientos, y por tanto una mayor frecuencia de recombinantes Figura 4-10 Los entrecruzamientos producen cromátidas recombinantes cuyas frecuencias pueden usarse para cartografiar los genes en un cromosoma. En las regiones mayores se producen más entrecruzamientos. El color marrón muestra los recombinantes de ese intervalo. Los recombinantes dobles surgen de dos entrecruzamientos Figura 4-11 Ejemplo de un doble entrecruzamiento entre dos cromátidas. Se observa que el entrecruzamiento doble produce cromátidas dobles recombinantes que tienen la combinación alélica parental (de los progenitores) en los loci externos. La posición del centrómero no se puede conocer a partir de la información presentada, y se ha añadido para completar. Distintas ordenaciones de genes dan lugar a distintos recombinantes dobles 116 Figura 4-12 Un doble entrecruzamiento en cada uno de los tres posibles órdenes de genes mostrados en el lado izquierdo dará lugar a los seis productos mostrado en el lado derecho. Únicamente el primero es compatible con los datos en el texto. Se puede observar que solamente las cromátidas no hermanas son mostradas en la figura, pues sólo éstas intervienen en los entrecruzamientos dobles. Mapa de los 12 cromosomas del tomate Figura 4-13 (a) Fotomicrofografía de la profase I (paquiteno) durante la meiosis en las anteras, donde se observan 12 pares cromosómicos. (b) Dibujo de los 12 cromosomas mostrados en la parte a. Los cromosomas son identificados mediante el sistema de numeración cromosómico. Los centrómeros se muestran en color naranja y las regiones adyacentes teñidas con más intensidad (heterocromatina) en verde. (c) El mapa de ligamiento de 1952. Cada locus está flanqueado por dibujos del fenotipo normal y de la variante. Las distancias entre los loci se muestran en unidades de mapa. ((a y b) De C. M. Rick, “The Tomato” Copyright 1978 por Scientific American, Inc. Derechos reservados (c) de L. A. Butler.) Las proporciones fenotípicas en la descendencia nos indican el tipo de cruzamiento Figura 4-14 Un RFLP ligado a un gen de una enfermedad de ratón Figura 4-15 Detección y herencia de un polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP). Una sonda P detecta dos formas de DNA cuando éste es cortado con una enzima de restricción (RE). El pedigrí del fenotipo dominante D de la enfermedad muestra ligamiento del locus D al RFLP; en la progenie solamente 8 117 individuos son recombinantes. Una mayor exactitud cartográfica requiere una progenie mayor o información acumulativa de varios cruzamientos similares. Uso de haplotipos para deducir la posición de los genes Figura 4-16 Los alelos mutantes permanecen en desequilibrio de ligamiento sólo con los SNPs 4 y 5. Por lo tanto, el gen debe estar en la vecindad de 4 y 5. Producción de líneas para la identificación y cartografía de QTL Figura 4-17 Dos líneas puras que se diferencias significativamente en algún carácter cuantitativo se cruzan y tras cruces endogámicos se producen líneas recombinantes puras. La comparación de los fenotipos de estas líneas permite identificar segmentos cromosómicos específicos que contribuyen consistentemente a la diferencias entre los parentales. Estas regiones contienen presuntos QTLs. (Basado en W. N. Frankel, “Taking Stock of Complex Trait Genetics in Mice.” Trends Genet. 12, 1995, Fig 1.) Algunas bandas de la huella digital de DNA muestran ligamiento Figura 4-18 Cada banda contiene una región minisatélite con sitios de restricción en las regiones flanqueantes. Las bandas I y C siempre aparecen en la huella digital de los individuos que llevan el alelo dominante P, lo que sugiere ligamiento. (Nota: Este apareamiento no es un cruzamiento prueba, pero sin embargo revela evidencia de ligamiento.) Un locus microsatélite puede mostrar ligamiento al gen de una enfermedad Figura 4-19 Un patrón de bandas generado por PCR de una familia con seis niños; este patrón se interpreta en la parte superior de la figura mediante el uso de cuatro “alelos” 118 de microsatélites de distinto tamaño, desde M' hasta M''''. Uno de estos marcadores (M'') probablemente está ligado en configuración cis con el alelo P de la enfermedad. (Nota: Este apareamiento tampoco es un cruzamiento prueba, pero sí es informativo respecto al ligamiento). Marcadores fenotípicos y moleculares cartografiados en el cromosoma 1 Figura 4-20 El diagrama muestra la distribución de todas las diferencias genéticas que se habían cartografiado en el cromosoma 1 cuando este diagrama fue dibujado. Algunos marcadores son genes de fenotipo conocido (sus números están sombreados en color verde), pero la mayor parte son marcadores polimórficos de DNA (los números sombreados en colores azul y malva representan dos clases distintas de marcadores moleculares). En el centro de la ilustración, un mapa de ligamiento muestra un conjunto ampliamente distribuido de estos marcadores, basado en el análisis de la frecuencia de recombinación del tipo descrito en este capítulo. Las distancias de mapa se expresan en centimorgans (cM). El cromosoma 1 es el más grande de los cromosomas humanos con un tamaño total de 356 cM. Algunos marcadores han sido situados sobre el mapa citogenético del cromosoma 1 (en el lado derecho del mapa, conocido como ideograma), mediante el uso de técnicas descritas más adelante en este mismo capítulo. Los marcadores genéticos de referencia en diferentes mapas genéticos permiten estimar la localización de otros genes de interés y otros marcadores moleculares. La mayoría de los marcadores presentados en el mapa de ligamiento son moleculares, pero también se incluyen algunos genes (resaltados in verde claro). (B. R. Jasney et. al. Science, September 30, 1994.) Una patrón de segregación en la segunda división en una octada de un hongo 119 Figura 4-21 Cuando hay un entrecruzamiento entre el centrómero y el locus A, los alelos A y a segregan hacia núcleos diferentes en la segunda división meiótica Cuatro uniones distintas al huso acromático producen cuatro patrones de segregación de segunda división MII Figura 4-22 En la segunda división meiótica, los centrómero se unen aleatoriamente al huso, dando lugar a los cuatro patrones que se presentan en la figura. Los cuatro se producen con la misma frecuencia. ¿Hay evidencia de ligamiento en esta genealogía? Figura 4-23 La genealogía es de hecho un cruzamiento prueba. D/d son alelos de un gen que determina una enfermedad; M1 y M2 son “alelos” moleculares, como por ejemplo las dos formas de un RFLP. P, parental (no recombinante); R, recombinante. Figura 4-24 Cualquier número de entrecruzamientos produce un 50% de recombinantes Demostración de que la FR promedio es 50% en meiosis en las que el número de entrecruzamientos es distinto de cero. Las cromátidas recombinantes son marrones. Los dobles entrecruzamientos de dos cadenas producen sólo tipos parentales; por lo que todas las cromátidas son naranjas. Obsérvese que todos los entrecruzamientos se producen entre cromátidas no hermanas. Pruebe con el triple entrecruzamiento en clase. Figura 4-25 Alineamiento de mapas físicos y de recombinación La comparación entre las posiciones relativas en los mapas físicos y de recombinación puede relacionar el fenotipo con un gen de función desconocida. 120