distill slops report

Informe proyecto PNUD-PEREZ GUERRERO: octubre de 2014
Use of Distillery slops for Biodiesel Production by Oil-Bearing Yeast
(Yeast Biodiesel)
De acuerdo a las actividades previstas en el plan de proyecto se han cumplido las
instancias:
Project Managment
Se realizó el curso “Introducción a la Microbiología Industrial” entre los días 6 y 10
de mayo del año 2013.
La temática del curso abarcó desde el metabolismo de las células microbianas
(sustratos, etc), variables cinéticas de crecimiento, Parámetros y modos de operación,
Potencialidades de las proteínas Microbianas en la industria de Alimentos, Cosmética y
Farmacéutica.
El curso contó con la participación como docentes de profesionales de primer nivel
quienes, además de su presentación participaron en las distintas mesas de discusión:
Dr. Miguel Otero Rambla – ICIDCA-Cuba
Dr. Amaury Álvarez Delgado – ICIDCA-Cuba
Dr. Miguel Galvagno -CONICET- Fac. Ingeniería-UBA
Dr. Jorge Wagner –CONICET- Universidad Nacional de Quilmes
Dr. Marcelo Cerdán – Fermentis SA
A continuación se presentan en más detalle los temas tratados:
1. MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL: definiciones y áreas de aplicación caso de estudio:
etanol de lignocelulosa. Desafíos y perspectivas
2. COORDINACIÓN DEL METABOLISMO MICROBIANO. Caso de estudio: tratamiento de
vinazas de destilación de alcohol
3. MEDIOS DE FERMENTACIÓN. Esterilización. Caso de estudio: deterioro de melazas
durante el almacenamiento
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4. CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS. Caso de estudio: producción de etanol (cultivo
batch). Etanol de maíz vs etanol de caña
5. SISTEMAS DE CULTIVO.
6. AISLAMIENTO DE PRODUCTOS: PROTEÍNAS. Caso de estudio: derivados de levadura.
Propiedades funcionales de proteínas
Este curso contó con la asistencia de más de 50 participantes, en su mayoría
estudiantes y profesionales de distintos sectores de la ciencia y la industria.
Bibliography Updating and Procedure development
Durante los años 2012 y 2013 nuestro centro se halló fuertemente vinculado con el
ICIDCA (Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar).
Durante este período, investigadores de ambos institutos interrelacionaron tanto en Cuba
como en Argentina. En los viajes realizados, se avanzó sobre la trasferencia de tecnologías
obteniéndose información de primera mano a cerca de los procesos, requerimientos y
habilidades de cada grupo de trabajo.
En este período se realizaron los principales avances experimentales:
- Caracterización de los distintos sustratos a evaluar (Glicerol, Vinaza, Melaza de
caña)
- Almacenamiento y Caracterización de las cepas gentilmente provistas por el
grupo de ICIDCA (primer semestre de 2012)
- Ensayos de crecimiento a escala Erlenmeyer (segundo semestre de 2012)
- Ensayos de crecimiento a escala 5L en fermentador (Primer semestre de 2013)
- Ensayos de crecimiento a escala 75 L en fermentador (Segundo semestre de
2013)
Durante este período se estableció también contacto con otros Institutos
especializados de Argentina, en este caso la Estación Experimental Agroindustrial Obispo
Colombres (EEAOC), quienes nos facilitaron la tarea de la adquisición de las distintas
fuentes de subproductos en la provincia de Tucumán, así como la realización de análisis
específicos.
A continuación se indica el esquema de trabajo seguido para el cumplimiento del
proyecto:
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 Caracterización de los distintos sustratos a evaluar (primer semestre de 2012)
Los sustratos evaluados fueron: Glicerol, Vinaza, Melaza de Caña. Los sustratos
fueron provistos por ICIDCA, las cuales fueron usadas como control, y por la EEAOC quien
proveyó vinazas de distintos Ingenios Tucumanos.
La caracterización de los sustratos fue realizada parcialmente por la EEAOC y de
manera particular por INTI, encontrándose características fisicoquímicas variables entre
todos los Ingenios evaluados (cubanos y argentinos). Una de las principales características
diferenciales observadas de manera directa en las vinazas Argentinas consistió en la
presencia de sólidos residuales (materia orgánica, cristales, “rocas”) que no se hallaban en
las vinazas cubanas.
Estas características permitieron evaluar pre-tratamientos (centrifugación,
filtración, etc) y posibles respuestas de crecimiento.
 Almacenamiento y Caracterización de las cepas “Yarrowia lipolítica” y “Candida vini”
(primer semestre de 2012)
Las cepas cedidas por ICIDCA fueron inicialmente sembradas en medio rico
agarizado e incubadas hasta la obtención de colonias aisladas de levadura.
A partir de una única colonia aislada se realizaron cultivos de 18 hs en medio rico
líquido, el cual se sembró por Triplicado en un nuevo volumen de medio fresco y se incubó
a 37°C en agitación continua de 200 RPM´s.
Sobre dos de los triplicados se realizaron ensayos de seguimiento de OD y masa
seca para realizar los cálculos iniciales de cinética de crecimiento basales. El cultivo
remanente fue acondicionado para la preparación de bancos celulares maestros (MCB) y
de trabajo (WCB). Las bancos fueron conservados en Nitrógeno líquido (N2) y Freezer a 80°C respectivamente.
 Ensayos de crecimiento a escala Erlenmeyer (segundo semestre de 2012)
Durante el segundo semestre de 2012 se realizaron los ensayos tendientes a
determinar las características de crecimiento de los microorganismos en medios
formulados con subproductos del procesamiento de caña de azúcar.
Entre los ensayos realizados se analizaron lotes de crecimiento con las distintas
cepas de levadura y los subproductos caracterizadas previamente. En todos los ensayos se
obtuvo crecimiento celular, sin embargo se observaron claras diferencias entre las vinazas
Cubanas y las Argentinas. Algunas de las diferencias encontradas corresponden a una
prolongación de la fase lag del cultivo para las vinazas Argentinas. Del mismo modo, se
determinó que esta fase lag se reduce con el aumento de carga inicial del microorganismo
en el medio de cultivo. También se observó que los medios con vinaza resultaron más
difíciles de controlar debido principalmente a la presencia de material sólido no
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microbiano. Esta característica, tal lo previsto inicialmente, dificultó algunos de los
controles de proceso tal como la determinación de Densidad óptica y masa seca, ambos
parámetros de seguimiento de crecimiento del cultivo e indicadores vitales para los
cálculos de rendimiento posteriores. En algunos casos, se agregó un paso de
centrifugación previa del medio para reducir la presencia de estas sólidos y verificar si este
proceso afectaba de alguna forma el crecimiento de las levaduras. Dado que no se
observaron cambios en el crecimiento de biomasa, se descartó esta metodología para
cultivos a mayor escala por ser inviable en tiempo y agregar un paso intermedio de
proceso sin mayores beneficios para el rendimiento celular.
Estos inconvenientes no se sufrieron cuando el aditivo utilizado fue glicerol.
En esta etapa se realizaron también ensayos de evaluación utilizando en la
formulación del medio glicerol industrial y comparándolo con glicerol analítico. En este
caso se obtuvo un mejor desempeño para aquellos cultivos formulados con glicerol
industrial.
Finalmente se evaluaron medios formulados con mezclas vinaza/melaza/glicerol
acorde a datos previos obtenidos por el grupo de ICIDCA.
En todos los casos, el mayor rendimiento se obtuvo con la cepa C. vini, con la cual
se prosiguió en los ensayos posteriores.
 Ensayos de crecimiento a escala 5L (primer semestre de 2013)
Durante esta etapa se realizaron estudios de fermentación a escala 5L en
fermentadores. Estos ensayos consistieron en realizar un primer paso de escalado de
aquellos cultivos evaluados a escala Erlenmeyer. En este caso, se ensayaron medios
formulados con Vinaza y/ o Glicerol.
En ambos casos se evidenció la producción de lípidos por microscopía directa a
través de la presencia de vacuolas lipídicas.
Estos cultivos, fueron posteriormente tratados para la extracción de estos lípidos y
su posterior análisis por cromatografía gas –líquido de las ésteres metílicos de los ácidos
grasos totales. Este análisis arrojó la presencia de tan solo 0.03 g de lípido cada 100 gs de
cultivo siendo mayoritarios los ácidos grasos Oleico (>36%), Linoleico (>36%) y Palmítico
(9%).
En esta etapa y la siguiente debe destacarse que una de las principales
complicaciones encontradas para la realización de estos ensayos fue contar con la materia
prima (vinaza o glicerol). Dado que esta “materia prima” es obtenida en la provincia de
Tucumán de manera estacional, la obtención de vinazas fue esporádica, sumándole
además, los habituales inconvenientes en el traslado a temperatura refrigerada de
grandes volúmenes por largas distancias.
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 Ensayos de crecimiento a escala 75L (segundo semestre de 2013)
Durante esta etapa se realizaron estudios de fermentación a escala 75L en
fermentador. Estos ensayos consistieron en realizar el segundo paso de escalado de
aquellos cultivos evaluados a escala 5L. En este caso, se ensayaron nuevamente medios
formulados con Vinaza y Glicerol. Para estos cultivos, se requirió un paso intermedio de
crecimiento por 24 hs en un fermentador de 5L; este cultivo se utilizó posteriormente
como inóculo del fermentador de 75L. Los cultivos ya escalados fueron seguidos al menos
por 50 hs para maximizar la obtención de biomasa y el aprovechamiento de los sustratos
del medio.
Nuevamente se evidenció la producción de lípidos por microscopía directa a través
de la presencia de vacuolas lipídicas.
Estos cultivos, fueron nuevamente tratados para la extracción de estos lípidos y su
posterior análisis por cromatografía gas –líquido de las ésteres metílicos de los ácidos
grasos totales. En este caso, el rendimiento de lípidos obtenido fue de 10 gs cada 100 gs
de cultivo de levadura. Este análisis arrojó la presencia mayoritaria de los ácidos grasos
Oleico (>35%), Linoléico (>50%) y Palmítico (5%).
Estos ensayos fueron realizados con fondos de INTI por no contar hasta el
momento con los correspondientes a los de PNUD.
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