FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS RED NACIONAL UNIVERSITARIA UNIDAD ACADÉMICA DE SANTA CRUZ FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Veterinaria y Zootecnia TERCER SEMESTRE SYLLABUS DE LA ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA Elaborado por: Lic. Shirley Ortiz Saucedo Gestión Académica I/2013 U N I V E R S I D A D 1 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS UDABOL UNIVERSIDAD DE AQUINO BOLIVIA Acreditada como PLENA mediante R.M. 288/01 VISION DE LA UNIVERSIDAD Ser la universidad líder en calidad educativa. MISION DE LA UNIVERSIDAD Desarrollar la educación superior universitaria con calidad y competitividad al servicio de la sociedad Estimado(a) estudiante: El Syllabus que ponemos en tus manos es el fruto del trabajo intelectual de tus docentes, quienes han puesto sus mejores empeños en la planificación de los procesos de enseñanza para brindarte una educación de la más alta calidad. Este documento te servirá de guía para que organices mejor tus procesos de aprendizaje y los hagas mucho más productivos. Esperamos que sepas apreciarlo y cuidarlo. Aprobado por: U N I V E Fecha: Marzo de 2013 R S I D A D 2 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS SYLLABUS Asignatura: Microbiología Código: VET-302 Requisito: Carga Horaria: Horas Teóricas: Horas Prácticas: Créditos: VET-202 80 horas 40 40 4 I. OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA. Describir los microorganismos (bacterias y hongos) y los grupos a los que pertenecen. Reconocer las bacterias más importantes y sus características relevantes, como ser: hábitat, características de celulares, de cultivo y bioquímicas, factores de resistencia y enfermedades producidas. Aplicar técnicas laboratoriales en la observación e identificación de los agentes etiológicos (bacterias y hongos). II. PROGRAMA ANALITICO DE LA ASIGNATURA. UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERAL. 1.1. Definición 1.2. Etiología 1.3. Subdivisión de la microbiología 1.4. Objeto de la microbiología 1.5. Historia 1.6. El microscopio 1.7. Relación con otras ciencias 1.8. Distribución de los microorganismos 1.9. Microorganismos saprofitos 1.10. Microorganismos patógenos. UNIDAD II: CLASIFICACIÓN Y NOMENCLATURA DE LAS BACTERIAS. 2.1. Generalidades 2.2. Reino de los hongos 2.3. Reino protista 2.4. Reino monera o procariota 2.5. Células eucarióticas y procarióticas. 2.6. Problemas de la clasificación UNIDAD III: MORFOLOGÍA Y ESTRUCTURA BACTERIANA. 3.1. Definiciones 3.2. Formas bacterianas 3.3. Citología de las bacterias 3.4. Estructuras facultativas UNIDAD IV: FISIOLOGÍA BACTERIANA I (NUTRICIÓN BACTERIANA). 4.1. Concepto e importancia 4.2. Requerimientos químicos 4.3. Aerobios obligados 4.4. Anaerobios obligados 4.5. Anaerobios facultativos 4.6. Anaerobios aerotolerantes U N I V E R S I D A D 3 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 4.7. Microaerofilos. 4.8. Requerimientos físicos. 4.9. Medios de cultivo UNIDAD V: FISIOLOGÍA BACTERIANA II (MULTIPLICACIÓN Y DESARROLLO). 5.1. Definiciones 5.2. Multiplicación 5.3. Desarrollo 5.4. Ciclo de crecimiento poblacional o desarrollo 5.5. Factores que afectan la multiplicación y desarrollo de las bacterias. 5.6. Características de las colonias UNIDAD VI: GENÉTICA MICROBIANA. 6.1. Bases de la herencia 6.2. Gen 6.3. Cromosoma procariótico 6.4. Mutación 6.5. Transferencia intercelular 6.6. Transformaciones. 6.7. Transducción 6.8. Conjugación 6.9. Recombinación UNIDAD VII: ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN. 7.1. Generalidades 7.2. Definiciones 7.3. Esterilización 7.4. Desinfección. 7.5. Asepsia 7.6. Antisepsia. 7.7. Higienización 7.8. Modo de acción (agentes químicos). 7.9. Agentes modificantes de grupos funcionales de proteínas y de ácidos Nucleicos 7.10. Métodos físicos de esterilización. 7.11. Filtración 7.12. Factores que afectan a la esterilización UNIDAD VIII: ACCIÓN DE LOS AGENTES QUIMIOTERAPEUTICOS. 8.1. Reseña histórica 8.2. Agentes quimioterapeúticos 8.3. Origen 8.4. Efecto 8.5. Espectro 8.6. Mecanismo de acción 8.7. Resistencia bacteriana. 8.8. Test de sensibilidad 8.9. Uso indiscriminado de antibióticos 8.10. Sensibilización 8.11. Toxicidad 8.12. Enmascaramiento de infecciones. UNIDAD IX: BACTERIAS DE INTERES VETERINARIO. 9.1. Cocos aerobios Gram positivos 9.2. Bacilos aerobios Gram positivos. 9.3. Bacilos anaerobios Gram positivos. 9.4. Bacilos anaerobios Gram negativos 9.5 Cocobacilos aerobios Gram negativos U N I V E R S I D A D 4 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 9.6. Bacterias pleomórficas aerobias Gram negativos-carentes de membrana Citoplasmática. 9.7. Bacterias intracelulares obligadas aerobias y asociadas a células. UNIDAD X: MICROBIOLOGÍA APLICADA. 10.1. Microbiología del suelo 10.2. Ciclos biogeoquímicos 10.3. Microbiología del aire 10.4. Microbiología del agua 10.5. Agua de consumo humano 10.6. Microbiología de los alimentos 10.7. Alteración de los alimentos 10.8. Enfermedades de origen microbiano 10.9. Alimentos producidos por microorganismos 10.10. Microbiología industrial. III. EVALUACIÓN DE LA ASIGNATURA. ● PROCESUAL O FORMATIVA. A lo largo del semestre se realizarán 2 tipos de actividades formativas: Las primeras serán de aula, que consistirán en clases teóricas, exposiciones individuales y grupales, repasos cortos semanales, trabajos prácticos como Work Paper´s y Dif´s. Las segundas serán actividades de “aula abierta” que consistirán en la participación del alumnado en actividades teórico - prácticas propias de la asignatura a realizarse fuera del recinto universitario y de trabajo social mediante als Brigadas d ela carrera. Vinculando los contenidos de la asignatura de forma directa e indirecta. La participación y la calidad de los trabajos resultantes de estos dos tipos de actividades se tomarán como evaluación procesual (sobre 50 puntos) independientemente de la cantidad de actividades realizadas por cada alumno. Bajo la siguiente ponderación. Participación. 10% Calidad del trabajo y/o contenido. 20% Instrumentos y/o medios utilizados. 20% ● DE RESULTADOS DE LOS PROCESOS DE APRENDIZAJE O SUMATIVA (examen parcial o final) Se realizarán 2 evaluaciones parciales con contenido teórico sobre 50 puntos cada una. El examen final consistirá en un examen escrito con un valor del 30% de la nota, la presentación de los informes y documentos del proyecto con el restante 20%. IV. BIBLIOGRAFÍA BÁSICA. Angulo, Manuel: Microbiología práctica. Ed. UAGRM. Santa Cruz. 2003. (576An47) Merck & co: Manual de Veterinaria Merck & co. 2004. Ed. Océano. 6ta. Edición. BogotaColombia. (636.089 Ai27) Nicolet, Jackes: Compendio de Bacteriología Veterinaria. Ed. Acribia. España. 1986. (589.9 N54) U N I V E R S I D A D 5 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS BIBLIOGRAFÍA COMPLEMENTARIA. Freeman, B. A: Microbiología de Burrow. Editorial Interamericana. Madrid-España. 1986. Madigan, T.M., Martincko, M. J., Parker, J: Biología de los Microorganismos. Octava Edic. España. 1997. Pelczar, M.J., & E.C.S. Chan: Elementos de Microbiología. Mc Graw- Hill, Madrid. 1984 Senasac: Manual de Procedimiento de Diagnostico de Brucelosis. Buenos Aires - Argentina. 1999 Stanier, r. Y., AAdelberg & J.L. Ingraham: Microbiología. De. Reverté S.A. Barcelona-España. 1984 T.D.D.W. Smith S. T. Madigan.: Biología de los microorganismos. 1994 V. PLAN CALENDARIO SEMANA 1ra. 2da. 3ra. 4ta. 5ta. 6ta. ACTIVIDADES ACADÉMICAS Avance de materia Avance de materia Avance de materia Avance de materia Avance de materia Avance de materia Presentación de la materia. UNIDAD I: 1.1 - 1.2 - 1.3 - 1.4 - 1.5 - 1.6 - 1.7 1.8 - 1.9 - 1.10 UNIDAD II: 2.1 - 2.2 - 2.3 - 2.4 2.5 - 2.6 UNIDAD III: 3.1 - 3.2 - 3.3 3.4 UNIDAD IV: 4.1 - 4.2 4.10 - 4.11 - 4.12 - 4.13 - 4.14 - 4.15 - 4.16 - 4.17 - 4.18 Primera Evaluación Primera Evaluación Avance de materia UNIDAD V: 5.1 - 5.2 - 5.3 - 5.4 - 5.5 - 5.6 - 5.7 - 5.8 - 5.9 - 5.10 8va. Avance de materia 5.11 - 5.12 - 5.13 - 5.14 UNIDAD VI: 6.1 - 6.2 - 6.3 - 6.4 - 6.5 - 6.6 - 6.7 - 6.8 - 9na. Avance de materia UNIDAD VII: 7.1 - 7.2 - 7.3 - 7.4 - 7.5 - 7.6 - 7.7 - 7.8 10ma. Avance de materia Avance de materia Avance de 12da. materia Avance de 13ra. materia 14ta. Avance de materia Avance de materia Avance de 16ta. materia 15ta. 17ma. U N 7.9 - 7.10 - 7.11 - 7.12 UNIDAD VIII: 8.1 - 8.2 - 8.3 - 8.4 8.5 8.6 – 8.7 8.8 - 8.9 - 8.10 - 8.11 - 8.12 UNIDAD IX: 9.1 - 9.2 9.3 - 9.4 - 9.5 - 9.6 Segunda Evaluación 9.7 - 9.8 - 9.9 - 9.10 Segunda Evaluación UNIDAD X: 10.1 - 10.2 - 10.3 - 10.3 10.4 - 10.5 - 10.6 10.7 - 10.8 - 10.9 Avance de materia 10.10 I V E I D A D R S Actividad del proyecto 4.3 - 4.4 - 4.5 - 4.6 - 4.7 - 4.8 - 4.9 7ma. 11ra. OBSERVACIONES 6 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Avance de materia Avance de 19na materia Elaboración de productos (Queso, vino, etc.) Examen Final Elaboración de productos (Queso, vino, etc.) Examen Final 18va. 20va Entrega de Notas y Cierre de Gestiópn Segunda Instancia VI. WORK PAPER´s. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 1 UNIDAD O TEMA: UNIDAD I: Microbiología general TITULO: LUÍS PASTEUR FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Nació el 27 de diciembre de 1822 en Dole, departamento de Jura, Francia. Su padre había sido soldado de Napoleón, pero después de dejar el ejército puso una curtiduría, donde transcurrió la infancia del pequeño Louis. Éste no fue un alumno especialmente aplicado o brillante en la escuela ni en la Universidad. Tras licenciarse y asistir a las lecciones del gran químico francés Jean B. Dumas, comenzó a interesarse por la química. Fue profesor de química en Estrasburgo (1847-1853) y decano en Lille (1854). Además, en 1857 desempeñó el cargo de director de estudios científicos de la Escuela Normal de París, cuyo laboratorio dirigió a partir de 1867.Hizo grandes descubrimientos. Contribuciones en la química orgánica Descubrió el dimorfismo del ácido tartárico, al observar al microscopio que el ácido racémico presentaba dos tipos de cristal, con simetría especular. Fue por tanto el descubridor de las formas dextrógiras y levógiras. Y comprobó que desviaban el plano de polarización de la luz con el mismo ángulo pero en sentido contrario. Este hallazgo le valió al joven químico la concesión de la Legión de Honor Francesa, con sólo 26 años. En 1854 fue nombrado decano de la Facultad de Ciencias en la Universidad de Lille. Investigaciones en la microbiología A petición de viticultores y cerveceros de la región, comenzó a investigar la razón por la cual se agrian el vino y la cerveza. De nuevo gracias al microscopio consigue identificar la levadura responsable. Propuso eliminar el problema calentando la bebida lentamente hasta alcanzar 48 grados centígrados para matar las levaduras, y después encerrar el líquido en cubas bien selladas. Este proceso dio lugar a la actual técnica de pasteurización de los alimentos. Demostró que todo proceso de fermentación y descomposición orgánica se debe a la acción de organismos vivos y que el crecimiento de los microorganismos en caldos nutritivos no era debido a la generación espontánea. Para demostrarlo expuso caldos hervidos en matraces provistos de un filtro que evitaba el paso de partículas de polvo hasta el caldo de cultivo, simultáneamente expuso otros matraces que carecían de ese filtro pero que poseían un cuello muy alargado y tortuoso que dificultaba el paso del aire, y por ello de las partículas U N I V E R S I D A D 7 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS de polvo, hasta el caldo de cultivo. Al cabo de un tiempo observó que nada crecía en los caldos demostrando así que los organismos vivos que aparecían en los matraces sin filtro o sin cuellos largos provenían del exterior, probablemente del polvo o en forma de esporas. El propio Pasteur, en 1871 obligó a los médicos de los hospitales militares a hervir el instrumental y los vendajes. Describió un horno, llamado "horno Pasteur", útil para esterilizar instrumental quirúrgico y material de laboratorio. Utilizó un nuevo método para eliminar microorganismos pueden degradar al vino, la cerveza o leche, elevando su temperatura hasta los 55 grados durante un tiempo corto. Este procedimiento se denominó "pasteurización" y ha tenido una aplicación universal en la industria alimentaria. Desarrolló la metodología para atenuar la virulencia de microorganismos patógenos que pudieron ser entonces utilizados para la fabricación de vacunas. El mismo obtuvo vacunas eficaces contra el cólera de los pollos, el ántrax y la erisipela del cerdo. Posteriormente obtuvo la vacuna contra el virus de la rabia que fue probada con éxito por primera vez para tratar al joven Joseph Meister. Días finales y legado Expuso la "teoría germinal de las enfermedades infecciosas", según la cual toda enfermedad infecciosa tiene su causa (etiología) en un germen con capacidad para propagarse entre las personas. Esta sencilla idea representa el inicio de la medicina científica, al demostrar que la enfermedad es el efecto visible (signos y síntomas) de una causa que puede ser buscada y eliminada mediante un tratamiento específico. En el caso de las enfermedades infecciosas se debe buscar el germen causante de cada enfermedad para hallar un modo de combatirlo. Por sus trabajos es considerado el pionero de la microbiología moderna que inicia así la llamada "Edad de Oro de la Microbiología". “Te animo a que te intereses por esos dominios sagrados llamados expresivamente laboratorios. Ten en cuenta que son los templos del futuro, la salud y el bienestar. En ellos la humanidad crecerá, se fortalecerá y mejorará. Allí, la humanidad aprenderá a progresar entendiendo la armonía de la naturaleza, evitando así su tendencia hacia la barbarie, el fanatismo y la destrucción”. Louis Pasteur Murió el 28 de septiembre de 1895. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´S: 1. Investigue la biografía y logros en el campo de la bacteriología de: a) Hipócrates b) Francastorius c) Hooke d) Leeuwenhoek e) Redi f) Spallanzan g) Lister h) Kooch i) Tyndall PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 2 UNIDAD O TEMA: UNIDAD II: CLASIFICACIÓN DE LAS BACTERIAS U N I V E R S I D A D 8 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS TITULO: CÉLULAS PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: CÉLULAS PROCARIOTAS Las células procariontes no poseen un núcleo celular delimitado por una membrana. Los organismos procariontes son las células más simples que se conocen. En este grupo se incluyen las algas azul-verdosas y las bacterias. CÉLULA EUCARIOTA U N I V E R S I D A D 9 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Las células eucariontes poseen un núcleo celular delimitado por una membrana. Estas células forman parte de los tejidos de organismos multicelulares como nosotros. CÉLULA ANIMAL Las células de los integrantes del reino Animal pueden ser geométrica, como las células planas del epitelio; esféricas, como los glóbulos rojos; estrelladas, como las células nerviosas, o alargadas, como las células musculares. La diversidad también se extiende a los tamaños: varían entre los 7,5 micrómetros de un glóbulo rojo humano, hasta unos 50 centímetros, como ocurre con las células musculares. U N I V E R S I D A D 10 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS CÉLULA VEGETAL Estas células forman parte de los tejidos y órganos vegetales. La presencia de los cloroplastos, de grandes vacuolas y de una pared celular que protege la membrana celular son tres las características que diferencian una célula vegetal de una animal. La pared celular de las células vegetales es rígida, lo que determina las formas geométricas que encontramos en los tejidos vegetales, como el hexagonal observado en las células de la cubierta de las cebollas. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´S: 1. Dibuje los organismos pertenecientes a cada reino. 2. Realice un sinóptico de las diferencias encontradas. 3. Sintetice la biografía de Linneo. 4. Investigue una biografía de algún científico que contribuyó en la clasificación de las especies, bajo los criterios agrupadores y los disgregadores. 5. Clasifique a los hongos según el sistema taxonómico en sus diferentes rangos. 6. Encuentre la definición de las ss palabras: Cepas, autótrofo, heterótrofo, fototrofia, aerobio, anaerobio, mitosis, meiosis, clorofila, angiospermas, simbiosis, genealogía. 7. Defina que es la biología molecular 8. Investigue en que campo trabaja la ingeniería genética 9. ¿Qué son cultivos celulares? ¿Es lo mismo que cultivo de células madre? U N I V E R S I D A D 11 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 3. UNIDAD O TEMA: UNIDAD III: MORFOLOGÍA Y CITOLOGÍA BACTERIANA TITULO: MICROORGANISMOS GRAM POSITIVOS Y NEGATIVOS FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Morfología ultramicroscópica de las bacterias: estructuras internas Pared celular Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales. Constituyentes importantes de la pared celular son los amínoácidos, aminoazúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteínas, Hidratos de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular. Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que las gram-negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las gram-negativas que en las gram-positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram (ver las dos imágenes juntas). Bacteria Gram Positiva U N I V E R S I D A D 12 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la Pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano. El ácido Teicoico es el responsable del determinante antigénico del organismo. Bacteria Gram Negativa Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está embebida en el fosfolípido y el antígeno O polisacárido está en la superficie. El lípido se llama Lípido A y es tóxico, pero el lipopolisacárido entero se llama Endotoxina. La pared de la célula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplásmica y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte. También existen diferencias en la composición de la pared entre las células de las diversas especies. Membrana Citoplásmica (citoplasmática o protoplasmática) Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas periféricas empotradas. La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de desecho. Tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado Mesosoma. Citoplasma El material celular contenido dentro de Ia membrana citoplásmica puede dividirse en tres partes, región citoplásmica, de apariencia granular, la cual es rica en RNA, región nuclear o cromatínica, que es rica en DNA, y la parte líquida que mantiene disueltos los elementos nutritivos. El RNA, combinado con proteínas, forma partículas o corpúsculos macromoleculares, de unos 200 A de diámetro, que forman una masa densa y compacta en todo el citoplasma. Estas partículas de RNA-proteína se denominan ribosomas, y son el equivalente en las bacterias de los microsomas, o partículas que se encuentran en las células animales y vegetales. U N I V E R S I D A D 13 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Estructuras Citoplasmáticas Nucleoide (cuerpo cromatínico). Las células bacterianas no contienen el núcleo característico de las células de las pIantas y animales superiores. Sin embargo, contienen en el citoplasma "cuerpos" que se consideran como una estructura nuclear, el ADN de la célula bacteriana se encuentra confinado en este espacio, es único y circular, doble hélice sin proteínas. Como no se trata de un núcleo discreto, se ha sugerido que se dé a estas estructuras las denominaciones de cuerpo cromatínico, nucleoides, equivalentes nucleares, y aun cromosomas bacterianos. Se demuestra con el método de tinción de Feulgen, específico para el DNA, y por microscopia electrónica, porque la sustancia nuclear es menos densa que el citoplasma cincundante. Ribosomas. Tienen estrecha relación con la síntesis de proteínas (30S y 50S para formar un complejo 70S). Plásmidos. Lazos extracromosómicos de ADN, algún código para la resistencia a drogas, toxinas y otros factores. Endosporas. Algunas bacterias pueden transformarse en pequeños ovoides o esferas, que son formas celulares muy resistentes, denominadas esporas, o endosporas, porque se producen intracelularmente. Todos los organismos de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan, en parte, por su propiedad de producir esporas. También tienen esta propiedad otros géneros de bacterias verdaderas, pero sólo en casos aislados. Las bacterias capaces de esporular pueden crecer y reproducirse en forma de células vegetativas durante muchas generaciones. Sin embargo, en cierto período del desarrollo del cultivo en medio nutritivo apropiado, se produce, dentro del citoplasma, la síntesis de nuevo protoplasma destinado a transformarse en espora. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´s: 1. Vocabulario. Autoduplicación, polímero, hipertónico, isotónico, hipotónico, dúctil. 2. Dibujo de las formas 3. Esquematice las agrupaciones bacterianas. 4. Realice un resumen de la morfología de las estructuras externas de la célula bacteriana. 5. ¿Qué caracteriza a una célula alcohol ácido resistente? 6. ¿Cuál es el fundamento de la coloración de esporas? 7. ¿Qué géneros poseen esporas? 8. ¿Cuáles son los géneros bacterianos que no poseen pared celular? 9. Clasifique a las bacterias según la presencia o no de flagelos 10. Dentro de las estructuras citoplasmáticas la bacterias posen vacuolas o inclusiones, ¿Qué sustancias se encuentran en estas? PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 4. UNIDAD O TEMA: UNIDAD IV: Fisiología bacteriana TITULO: NUTRICIÓN FECHA DE ENTREGA: U N I V E R S I D A D 14 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS PERIODO DE EVALUACIÓN: INTRODUCCIÓN: CONCEPTO E IMPORTANCIA - Una característica clave de un sistema vivo es la capacidad de dirigir las reacciones químicas y organizar las moléculas en estructuras específicas→ crecimiento. - Las células microbianas están constituidas de sustancias químicas de una amplia diversidad de tipos y, cuando una célula crece, todos sus constituyentes químicos aumentan en cantidad apropiada - Los elementos químicos básicos de una célula, viene del exterior, pero estos elementos químicos son transformados por la propia célula en los constituyentes característicos Nutrientes.- Se llama así a los productos químicos exteriores a partir de los cuales se construye una célula. Los nutrientes son tomados por la célula y transformados en constituyentes celulares. El proceso por el que una célula se construye a partir de nutrientes simples tomados del medio exterior se denomina ANABOLISMO (Proceso de Biosíntesis). El anabolismo es un proceso que requiere energía. Las células también necesitan de energía para otras funciones tales como movimiento celular (motilidad) y transporte de nutrientes. Como otros nutrientes, la energía se obtiene también del medio exterior celular de tal manera que se pueden usar dos fuentes de energía: - Luz - Compuestos químicos Un determinado grupo de organismos obtienen su energía de la luz, la mayor parte lo hacen por oxidación de compuestos químicos. Los productos químicos utilizados como fuente de energía son rotos en constituyentes más simples → se libera energía: A este proceso se denomina catabolismo Tipos nutricionales.- Tradicionalmente, se agrupan a los microorganismos en clases metabólicas dependiendo de la fuente de energía que utilicen. Todos los términos utilizados para describir estas clases emplean la terminación “trofo” que deriva del griego y significa alimentarse. Los microorganismos pueden ser agrupados en clases nutricionales de acuerdo a cómo satisfacen sus requerimientos de: energía, H+ / e- y carbono. Existen sólo dos fuentes de energía disponible para los microorganismos y también dos fuentes de átomos de H+ / eFuente energía Luz Oxidación de compuestos Químicos (Comp. orgánicos e inorgánicos) Donador de e- / H+ Moléculas inorgánicas reducidas Moléculas orgánicas Fuente de carbono CO2 Moléculas orgánicas reducidas, preformadas, de otros organismos Tipo Fotótrofo Quimiótrofos Tipo Litótrofos Organótrofos Tipo Autótrofo Heterótrofo Pese a la gran diversidad metabólica mostrada por los microorganismos, la mayoría de ellos puede ser considerado en uno de los cuatro tipos nutricionales de acuerdo a su fuente primaria de obtención de energía, fuente carbonada y de e- / H+ U N I V E R S I D A D 15 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Características Tipos nutricionales FOTOLITOTRÓFICO AUTÓTROFO También llamado fotoautótrofo, usa energía luminosa como fuente de energía y CO2 como fuente de carbono. Las algas y las cianobacterias emplean H2O como donadores de Energia y liberan O2. Las bacterias púrpuras y verdes del azufre no pueden oxidar el agua, pero extraen e- de donadores inorgánicos como H+, H2S y azufre elemental Grupo menos abundante Utiliza la luz como fuente de energía, donadores de e- inorgánicos y moléculas orgánicas simples como fuente de carbono Ej. Bacterias fotosintéticas púrpuras no sulfúreas y algunas verdes del azufre que normalmente habitan en lagos contaminados y afloramientos naturales del agua. Grupo que oxida compuestos inorgánicos reducidos como fierro, nitrógeno o moléculas de S para obtener energía y e- para biosíntesis El CO2 es la fuente de carbono Sus representantes cumplen un rol ecológico de importancia y son las bacterias azufre-oxidantes, las bacterias del hidrógeno, las del hierro y nitrificantes FOTOLITOTRÓFICO HETERÓTROFO QUIMIOLITOTRÓFICO AUTÓTROFO También llamado quimioheterótrofo, es el grupo nutricional más numeroso en representantes Utilizan compuestos orgánicos como fuente de energía, de carbono, de hidrógeno y de energía Por lo general, el mismo nutriente orgánico satisface todos estos requerimientos Sus representantes son la mayoría de bacterias no fotosintéticas y los hongos Todos los microorganismos patógenos pertenecen a este grupo QUIMIOLITOTRÓFICO HETERÓTROFO Un microorganismo puede pertenecer a uno de los cuatro grupos metabólicos, sin embargo, algunas presentan una flexibilidad metabólica, como respuesta a cambios medioambientales marcados. Ejemplo: Muchas bacterias púrpuras no sulfúreas actúan como fotolitótrofas heterótrofas en ausencia de O2, pero oxidan compuestos orgánicos como quimiótrofos en niveles normales de oxígeno MIXOTRÓFICAS (Combinación de metabolismo autótrofo y heterótrofo). Requerimientos nutricionales.- Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: 1) Macronutrientes.- Requeridos en grandes cantidades 2) Micronutrientes.- Requeridos en pequeñas cantidades CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´s: 1. Realice un cuadro de las funciones de los macronutrientes 2. Esquematice las funciones de los micronutrientes 3. Investigue la composición química de al menos tres medios de cultivo. U N I V E R S I D A D 16 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 4. Averigüe que géneros bacterianos se clasifican dentro de los grupos: mesofilos, psicrófilos y termófilos. 5. Dé ejemplos de los géneros bacterianos clasificados según sus requerimientos de oxígeno. 6. Puntualice los géneros bacterianos clasificados dentro de los rangos de pH. 7. ¿Cómo afecta al crecimiento de las bacterias la carencia de alguno de los nutrientes mencionados? 8. Investigue las características físicas de las colonias bacterianas. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 5. UNIDAD O TEMA: UNIDAD VI: GENÉTICA MICROBIANA TITULO: Conceptos básicos FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Un pequeño diccionario con los términos más usuales utilizados en Genética mendeliana. Gen. Unidad hereditaria que controla cada carácter en los seres vivos. A nivel molecular corresponde a una sección de ADN, que contiene información para la síntesis de una cadena proteínica. Alelo. Cada una de las alternativas que puede tener un gen de un carácter. Por ejemplo el gen que regula el color de la semilla del guisante, presenta dos alelos, uno que determina color verde y otro que determina color amarillo. Por regla general se conocen varias formas alélicas de cada gen; el alelo más extendido de una población se denomina "alelo normal o salvaje", mientras que los otros más escasos, se conocen como "alelos mutados". Carácter cualitativo. Es aquel que presenta dos alternativas claras, fáciles de observar: blanco-rojo; liso-rugoso; alas largas-alas cortas; etc. Estos caracteres están regulados por un único gen que presenta dos formas alélicas (excepto en el caso de las series de alelos múltiples). Por ejemplo, el carácter color de la piel del guisante está regulado por un gen cuyas formas alélicas se pueden representar por dos letras, una mayúscula (A) y otra minúscula (a). Carácter cuantitativo. El que tiene diferentes graduaciones entre dos valores extremos. Por ejemplo la variación de estaturas, el color de la piel; la complexión física. Estos caracteres dependen de la acción acumulativa de muchos genes, cada uno de los cuales produce un efecto pequeño. En la expresión de estos caracteres influyen mucho los factores ambientales. Genotipo. Es el conjunto de genes que contiene un organismo heredado de sus progenitores. En organismos diploides, la mitad de los genes se heredan del padre y la otra mitad de la madre. Fenotipo. Es la manifestación externa del genotipo, es decir, la suma de los caracteres observables en un individuo. El fenotipo es el resultado de la interacción entre el genotipo y el ambiente. El ambiente de un gen lo constituyen los otros genes, el citoplasma celular y el medio externo donde se desarrolla el individuo. U N I V E R S I D A D 17 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Locus. Es el lugar que ocupa cada gen a lo largo de un cromosoma (el plural es loci). Homocigoto. Individuo que para un gen dado tiene en cada cromosoma homólogo el mismo tipo de alelo, por ejemplo, AA o aa. Heterocigoto. Individuo que para un gen dado tiene en cada cromosoma homólogo un alelo distinto, por ejemplo, Aa. CUESTIONARIO EL WORK PAPER´s: 1. Haga un breve resumen de la biografía de Mendel 2. Enuncie la 1° Ley de Mendel 3. Interprete en experimento de Mendel de la 1° ley 4. Enuncie la 2° Ley de Mendel 5. Interprete en experimento de Mendel de la 2° ley 6. ¿Qué se entiende por retrocruce? 7. Enuncie la 3° Ley de Mendel 8. Interprete en experimento de Mendel de la 3° ley 9. Nombre al menos 3 tipos de cruce industrial que se logran en ganadería de corte y, determine las proporciones de las razas participantes. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 6. UNIDAD O TEMA: UNIDAD VII: ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES TITULO: Antisépticos FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Se definen como sustancias que inhiben o destruyen la flora bacteriana cuando se aplican en piel, heridas infectadas, instrumental y equipos quirúrgicos, equipos odontológicos, medio ambiente de las salas quirúrgicas y excretas. Estos compuestos químicos presentan alguna toxicidad sobre gérmenes y organismos patógenos, y son responsables de algunas de las manifestaciones terapéuticas en un ser vivo. La actividad antibacteriana está relacionada con: - El tiempo de exposición. - La temperatura. - La concentración de la solución. El mecanismo de acción depende de 3 mecanismos básicos (que a su vez dependen del grupo químico) 1. Capacidad de coagular o precipitar proteínas. 2. Alterando las características de permeabilidad celular 3. Toxicidad (envenenamiento) de los sistemas enzimáticos de las bacterias. U N I V E R S I D A D 18 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Definición de conceptos: Las palabras desinfectante, antiséptico, germicida, bactericida, etc, se usan frecuentemente de manera indistinta. Aunque todos esos términos denotan compuestos con características similares, es necesario definirlos para establecer las diferencias y similitudes: 1. Desinfectante: Son sustancias usadas en objetos inanimados (como equipos y material quirúrgico) 2. Para destruir los microorganismos y prevenir infecciones. Algunos de estos compuestos se utilizan de forma diluida en tejidos (ya que a la concentración que se utilizan como desinfectantes, destruirían los tejidos). Algunos compuestos de este grupo son el Hipoclorito, algunos Fenoles y Aldehídos. 3. Antiséptico: Es un compuesto que es capaz de inhibir o impedir el desarrollo bacteriano o de destruir a microorganismos en tejidos vivos. A diferencia de los desinfectantes que son para objetos inanimados, los antisépticos se aplican en seres vivos. Como mencionábamos anteriormente, algunos compuestos pueden usarse como desinfectantes o antisépticos según la concentración que se utilice (uno de estos compuestos es el Benzalconio de Hidrógeno). 4. Germicida: Es una sustancia que destruye microorganismos (pero no esporas). Este tipo de compuestos reciben el nombre axiomático de bactericidas, fungicidas, viricidas, amebicidas, etc, según el tipo de microorganismo sobre el cual actúen. Los Germicidas pueden ser antisépticos o desinfectantes. 5. Esterilizantes: Son compuestos que eliminan tanto las células vegetativas como las esporas cuando son aplicados en diversos materiales durante un tiempo y a una temperatura específicos. 6. Agentes de Saneamiento: Son compuestos usados por las organizaciones de salud para la desinfección de excretas y pantanos. Dentro de este grupo están: Fenoles, Alcalis, Hipoclorito y Aldehidos). Por ejemplo el DTT es un agente halogenado que se utiliza para la desinfección de pantanos. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´S: 1. ¿Cuáles son los modos de acción de los desinfectantes? 2. Detalle los agentes que dañan la membrana citoplasmática 3. Resuma los agentes que destruyen las proteínas o inhiben su síntesis 4. ¿Cuáles son los factores que afectan la potencia de un desinfectante? 5. Describa el proceso de Pasteurización 6. Describa los pasos de la Tyndalización 7. Nombre y explique al menos dos tipos de desinfección o esterilización utilizando medios físicos. 8. ¿Qué es un viricida? ¿Nombre alguno de uso en MV? 9. ¿Quë antiprotozooarico conoce? 10. Defina qué es un agente funguicida. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 7. UNIDAD O TEMA: UNIDAD VIII: ANTIBIÓTICOS TITULO: Antibióticos U N I V E R S I D A D 19 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Introducción En el uso común, un antibiótico es un medicamento que mata o inhibe el crecimiento de ciertas clases de bacterias, pero que normalmente es inofensivo (aunque véase reacción adversa a medicamento) para el huésped y que se utiliza para tratar una infección. El término fue utilizado por primera vez para describir solamente las formulaciones antibacterianas derivadas de los organismos vivos, pero en la actualidad está siendo usada para referirse a los antimicrobianos sintéticos como las quinolonas, sulfamidas y otros. En términos estrictos, un antibiótico es una sustancia secretada por un microorganismo y que tiene la capacidad de afectar a otros microorganismos como bacterias y hongos. De ahí que los antibióticos no sean efectivos en las enfermedades víricas. Historia El primer antibiótico descubierto fue la penicilina. Alexander Fleming estaba cultivando una bacteria (Staphylococcus aureus) en un plato de agar, el cual fue contaminado accidentalmente por hongos. Luego él advirtió que el medio de cultivo alrededor del moho estaba libre de bacterias. Él había trabajado previamente en las propiedades antibacterianas de la lisozima, y por ello pudo hacer una interpretación correcta de lo que vio: que el hongo estaba secretando algo que inhibía el crecimiento de la bacteria. Aunque no pudo purificar el material obtenido (el anillo príncipal de la molécula no era estable frente a los métodos de purificación que utilizó), informó del descubrimiento en la literatura científica. Debido a que el hongo era del género Penicillium (Penicillium notatum), denominó al producto penicilina. Debido a la necesidad imperiosa de tratar las infecciones provocadas por heridas durante la II Guerra Mundial, se invirtieron muchos recursos en investigar y purificar la penicilina, y un equipo liderado por Howard Walter Florey tuvo éxito en producir grandes cantidades del principio activo puro en 1940. Los antibióticos pronto se hicieron de uso generalizado desde el año 1943. El descubrimiento de los antibióticos, así como de la anestesia y la adopción de prácticas higiénicas por el personal sanitario (por ejemplo, el lavado de manos y utilización de instrumentos estériles) revolucionó la sanidad y se ha llegado a decir que es el gran avance en materia de salud desde la adopción de la desinfección. Se les denomina frecuentemente a los antibióticos, "balas mágicas", por hacer blanco en los microorganismos sin perjudicar al huésped. Abuso de los antibióticos Las formas usuales de abuso de los antibióticos incluyen la toma de antibióticos para una enfermedad no infecciosa o infección no bacteriana, en particular el uso de antibióticos para las infecciones víricas, como un catarro o una gripe; y la administración incompleta del antibiótico, generalmente debido a que el paciente se siente mejor una vez que la infección comienza a ceder. En algunas ocasiones, los antibióticos son recetados innecesariamente por los propios médicos, a veces por presión del paciente y otras veces, incluso, sin que el paciente lo solicite. Existe un debate sobre la conveniencia de incluir los antibióticos en la dieta de los animales de granja sanos. Los opositores de esta práctica indican que conduce a la resistencia a los antibióticos, incluyendo a las bacterias que infectan a los humanos. La práctica continúa en muchos lugares, no obstante, debido a que los antibióticos en la alimentación del ganado proporcionan un aumento de peso y porque tiene sentido económico para las granjas o ranchos individuales. Resistencia a los antibióticos U N I V E R S I D A D 20 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Uno de los efectos colaterales del mal uso o abuso de los antibióticos es que la bacteria se vuelva resistente a los antibióticos. En 1984 la mitad de las personas con tuberculosis activa en los Estados Unidos tenía una variedad que resistía al menos a un antibiótico. Entre 1985 y 1991 la tuberculosis aumentó en un 12% en los Estados Unidos y un 300% en África donde el VIH y la tuberculosis se suelen encontrar conjuntamente. El Staphylococcus aureus resistente a meticilina es un microorganismo particularmente nocivo, que es muy común en hospitales. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´s: 1. Investigue la biografía de Alexander Fleming. 2. Realice un esquema en el que muestre los antibióticos y los agentes sensibles a los mismos. 3. La resistencia a los antibióticos puede ser de varias formas. Explique 4. Procure la posología de los antibióticos mas usados en MV. 5. ¿Cuáles son las vías de administración de los antibióticos más usadas? 6. Explique la técnica a seguir para realizar un antibiograma. 7. ¿Cuáles son las consideraciones para escoger un antibiótico? 8. ¿Por qué las bacterias se hacen resistentes a los antibióticos? 9. ¿Qué alternativas existen para reemplazar a los antibióticos como promotores de crecimiento? 10. ¿Qué bacterias se utilizan para la elaboración de probióticos? PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 8. UNIDAD O TEMA: UNIDAD IX: BACTERIAS DE INTERES VETERINARIO TITULO: Antisépticos FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Una molécula impide la destrucción de la bacteria 'Brucella' Una investigación con participación de la Universidad de Navarra demuestra cómo una determinada molécula contribuye a que un gran patógeno, la Brucella abortus, escape a la destrucción dentro de las células que se encargan de eliminar agentes infecciosos (macrófagos). Dicha investigación ha sido publicada en la revista científica 'Nature Immunology'. La Brucella es un modelo de parásito intracelular, una categoría que incluye otras bacterias importantes, como las de la tuberculosis o la legionelosis. La Brucella penetra en los macrófagos dentro de vesículas membranosas, que no son fusionadas con los lisosomas (estructuras que contienen los productos celulares necesarios para destruir bacterias) como ocurre con otros microorganismos. Por el contrario, alcanzan determinados compartimentos dentro del macrófago. Allí las bacterias se multiplican y establecen una cadena de sucesos que determina la enfermedad. La brucelosis, enfermedad causada por esta bacteria, es de gran importancia mundial, con millones de seres humanos y de animales domésticos afectados. Este descubrimiento supone no sólo nuevas ideas U N I V E R S I D A D 21 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS útiles para otros investigadores, sino también un mejor conocimiento de un patógeno muy importante. De este conocimiento se pueden derivar productos útiles, como nuevas vacunas. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´s: 1. De cada uno de los géneros estudiados escoja la especie bacteriana que más llame su atención, y presente un artículo similar de la misma. Este puede incluir todo lo referente a la enfermedad que produce (etiología, especies susceptibles, sintomatología, patogenia) y al posible tratamiento. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD WORK PAPER # 9. UNIDAD O TEMA: UNIDAD X: MICROBIOLOGÍA APLICADA TITULO: Microbiología del Agua de uso Doméstico y de las Aguas Negras FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Los microorganismos patógenos más frecuentes transmitidos por el agua producen infecciones del aparato digestivo – fiebre tifoidea, paratifoidea, disentería (bacilar y amebiana) y cólera. Los agentes etiológicos de ésta se encuentra en las materias fecales y la orina de los infectados y cuando son eliminadas pueden llegar a un depósito que desemboque en una fuente de agua para beber. Virales o Virus. Constituyen un orden de microorganismos pequeños, filtrables y no visibles con el microscopio común, que provocan enfermedades en el hombre, los animales superiores y en vegetales (incluso en las bacterias). Provocan enfermedades como la poliomielitis, la viruela, la fiebre amarilla, etc. Pueden ser transmitidos por insectos y ácaros. Microorganismos Patógenos Banales y Útiles. Microorganismos patógenos; originan enfermedad en el ser vivo que parasitan o lo intoxican con sus toxinas. Microorganismos banales; no producen enfermedad, pero pueden actuar por ejemplo sobre alimentos, alterando su composición. Microorganismos Útiles. Aquellos cuya actividad sobre ciertos sustratos producen sustancias útiles al hombre. Enzimas. Sustancias de naturaleza orgánica, producidas por las células vivas, capaces de actuar como catalizadores, en y fuera de aquellas, sobre diversas sustancias, provocando su transformación química. Las enzimas se clasifican en: a.-) Hidrolasas; provoca el desdoblamiento del producto. b.-) Desmolasas; actúan en la degradación de los sustratos U N I V E R S I D A D 22 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Toxinas. Son sustancias de naturaleza proteica que dan origen a lesiones o síntomas de su acción características, al invadir un organismo vivo. Las exotoxinas: actúan fuera de la célula bacteriana, esparciéndose en el medio rápidamente. Las endotoxinas; permanecen dentro del microorganismo en tanto esté vivo y actúa cuando es alisado y se libera el contenido celular. Inmunología. Rama de la microbiología que ha adquirido una gran importancia para la prevención o la curación de enfermedades o intoxicaciones microbianas, a través de la preparación de vacunas y sueros. (Formación de anticuerpos en la fracción globulínica de las proteínas de la sangre) Principales Intoxicaciones Bacteriales. Botulismo; síntomas: dificultad para respirar y hablar, doble visión, muerte por parálisis Estafilococia; síntomas: Náuseas, vómitos, diarrea, dolores abdominales. Salmonelosis; síntomas: Diarrea con fiebre. Cl. Welchii; síntomas: náuseas, vómitos a veces, dolores abdominales y diarrea, dura 12 horas. Bacillus Cereus; síntomas: disturbios intestinales sin fiebre. Problemas Causados por la Actividad Microbiana. Aleas: Taponamiento de distribuidores y equipos, producción de oxígeno y protección y alimento a algunas bacterias. Hongos: Deterioro de la madera, taponamiento de equipos y alimentos y protección a algunas bacterias Bacterias. Las aeróbicas formadoras de lino causan taponamiento, corrosión por celdas de concentración, protegen a las anaeróbicas corrosivas. Prevención. Selección higiénica de materias primas empleadas en la elaboración de alimentos, deberán estar libres de microorganismos patógenos y en número muy bajo de microorganismos banales. Usar recipientes libres de microorganismos, tanto para la materia prima como para los productos de elaborados. Controlar los ambientes de las fábricas y controlar la salud e higiene de todo el personal que labora. Microbiología Industrial. Los antibióticos son únicamente uno de los muchos productos de los microorganismos que tienen importancia industrial. La buena marcha de las industrias de bebidas y del vino dependen de la capacidad de las levaduras para producir alcohol. Vitaminas, aminoácidos y otras sustancias químicas son producidas mediante procesos microbiológicos. La industria petrolera usa microorganismo como indicadores durante la exploración en busca de yacimientos. CUESTIONARIO DEL WORK PAPER´s: 1. Esquematices los ciclos biogeoquímicos más importantes. 2. Investigue acerca de los microorganismos habitantes del suelo. 3. Esquematice de forma breve la microbiología del aire y las enfermedades que se transmiten a través de este. 4. ¿Cuáles son las bacterias comprometidas dentro del ciclo del agua? 5. ¿Qué enfermedades pueden ser transmitidas por el agua? 6. Haga un sinóptico de las fases por las que atraviesan las aguas negras y de cuales son las bacterias que intervienen en las mismas. 7. Sintetice los pasos o procesos por los que atraviesan los RSU de la ciudad de SC. 8. Busque cuáles son los procesos de fabricación de alimentos en los que intervienen las bacterias. 9. Prepare productos derivados de la leche bajo las pautas indicadas en la Guía de Laboratorio. 10. Describa el proceso de la fermentación de la uva para la fabricación del vino. U N I V E R S I D A D 23 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS VII. DIF´s: PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DIF´s # 1. UNIDAD O TEMA: UNIDAD X: MIICROBIOLOGÍA APLICADA TITULO: MICROBIOLOGÍA DEL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Introducción. El tratamiento de aguas residuales se inició en Inglaterra a finales del siglo XIX y principios del XX para controlar los brotes infecciosos en las ciudades. Históricamente, el primer objetivo del tratamiento de aguas era reducir el contenido en materia en suspensión del agua a menos de 30 mgl -1 y la demanda biológica de oxígeno (ver más adelante) a menos de 20 mgl-1. La aguas a tratar pueden ser domésticas (compuestas de aguas negras, restos de alimentos, patógenos y parásitos), y aguas industriales (contaminadas principalmente por compuestos xenobióticos y metales pesados). Los objetivos del tratamiento biológico son tres: (1º) reducir el contenido en materia orgánica de las aguas, (2º) reducir su contenido en nutrientes, y (3º) eliminar los patógenos y parásitos. Composición de las aguas residuales domésticas. Están contaminadas con materia orgánica fácilmente biodegradable (40-60% de proteínas, 25-50% de carbohidratos y 10% de lípidos, con trazas de otros compuestos). La materia orgánica puede encontrarse como carbono disuelto (Carbono Orgánico Disuelto, COD) o en forma particula (Carbono Orgánico Particula, COP). Este último puede separarse del disuelto por decantación o por floculación. Existen tres método principales para medir la cantidad de materia orgánica en el agua: 1.-) la medida de la demanda biológica de oxígeno, 2.-) la de la cantidad total de carbono y 3.-) la de la demanda química de oxígeno. Todos los métodos se basan en la valoración de la cantidad de oxígeno necesaria para oxidar diferentes fracciones de la materia orgánica presente en el agua. Demanda biológica de oxígeno: (DBO), es la concentración de oxigeno disuelto consumido por los microorganismos, presentes en el agua o añadidos a ella para efectuar la medida de este parámetro, en la oxidación de toda la materia orgánica presente en la muestra de agua. Su valor debe ser inferior a 8 mgl-1. La DBO puede descomponerse en dos factores: 1.-) la demanda de oxígeno para la oxidación realizada por los microorganismos quimioheterotrofos (DOH) y 2.-) el oxígeno consumido en las oxidaciones de los quimioautotrofos nitrificantes (bacterias que oxidan el NH4 para obtener energía, DON). La DOH se mide añadiendo la muestra de agua a analizar a una solución tampón que contiene las sales inorgánicas necesarias para el crecimiento de los microorganismos y que está saturada de O2. La muestra se incuba en estas condiciones durante cinco días a 20ºC en la oscuridad. Las concentraciones de oxígeno se miden utilizando un electrodo de oxígeno. Es necesario añadir al experimento un inhibidor de la nitrificación (ver más adelante). El cálculo de la DOH se hace según la fórmula: COH (mgl-1) = (D1-D5)/P U N I V E R S I D A D 24 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS donde D1 y D5 son las concentraciones de oxígeno en la muestra el primero y el quinto día y P el coeficiente de dilución de la muestra. Para realizar esta medida se necesita una población mixta de microorganismos; si esta no es muy abundante puede suplementarse con un inóculo destinado a la degradación del material orgánico en el tiempo requerido. El valor de la DOH comprende todas las transformaciones oxidativas de la materia orgánica biodegradable: comp. Orgánicos + O2 + bacterias ® biomasa bacteriana + CO2 + NH4 + H2O Biomasa bacteriana + O2 + protozoos ® biomasa de protozoos + CO2 El rendimiento de la conversión de la biomasa bacteriana en la de protozoos es de 0,78 mg protozoos / mg bacterias. La DON es la cantidad de oxígeno consumida por los microorganismos nitrificantes que oxidan el NH 4 como fuente de energía. En general, el consumo viene a ser de unos 4.57 gr O 2 por gr de NH4 consumido; pero parte de este nitrógeno no se oxida a NO2- o a NO3- sino que se incorpora a las bacterias, por lo que el factor de corrección para los cálculos es de 4.33: DON = (Ndisponible - Nasimilado)x4.33 La DON es la causante de muchos altos valores de demanda de oxígeno en aguas con bajo contenido de materia orgánica: en aguas ricas en NH4 la actividad de las bacterias nitrificantes puede consumir entre el 25 y el 85% del total del oxígeno consumido. Para distinguir entre la DOH y la DON se emplean inhibidores de la nitrificación que no afectan al consumo heterótrofo de materia orgánica. Un inhibidor de este tipo de la 2-cloro-6(tricloro-metil)-piridina. Demanda química de oxígeno: (DQO) es la cantidad de oxígeno requerida para oxidar completamente la materia orgánica utilizando oxidantes químicos como el dicromato potásico (K2Cr2O7) con ácido sulfúrico. Los valores de la DQO han de estar en relación con los de la DBO; si la DQO es mucho mayor que la DBO una parte importante de la materia orgánica presente en el agua no será fácilmente biodegradable. Para las aguas domésticas, la DQO es del orden de 250 a 1000 mgO2 por litro,y la relación DBO/DQO oscila entre 0.4 y 0.8. Las aguas estabilizadas biológicamente tienen una relación DBO/DQO=0.12. Carbono orgánico total: (COT) se mide mediante la oxidación de la materia orgánica mediante calor y oxígeno o mediante oxidantes químicos y se detecta mediante análisis de infrarrojo la producción de CO2. Los valores deben ser comparables con los de la DQO. Pasos del tratamiento de aguas residuales En el tratamiento de aguas residuales se pueden distinguir hasta cuatro etapas que comprenden procesos químicos, físicos y biológicos: (1º) Tratamiento preliminar, destinado a la eliminación de residuos fácilmente separables. (2º) Tratamiento primario que comprende procesos de sedimentación. (3º) Tratamiento secundario que comprende procesos biológicos (lodos activados) y químicos (desinfección) y (4º) Tratamiento terciario o avanzado que está dirigido a la reducción final de la DBO, la disminución de nutrientes y la eliminación de patógenos y parásitos. Procesos de lodos activados Descripción del sistema básico: Tratamiento iniciado en Inglaterra a principios de este siglo y que se ha difundido mucho. Consiste en un tratamiento aerobio que oxida la materia orgánica a CO2 y agua y NH4+ y nueva biomasa. El aire necesario para el tratamiento se proporciona mediante difusión o por tratamiento mecánico. Durante el tratamiento los microorganismos forman flóculos que, posteriormente, se dejan sedimentar en un tanque ad hoc denominado tanque de clarificación. El sistema básico comprende, pues, un tanque de aireación y un tanque de clarificación por los que se hace pasar los lodos varias veces. U N I V E R S I D A D 25 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Los dos objetivos principales del sistema de lodos activados son (1º) la oxidación de la materia biodegradable en el tanque de aireación y (2º) la floculación que permite la separación de la biomasa nueva del efluente tratado. Microorganismos presentes en los flóculos: Los flóculos de lodo activado contienen partículas orgánicas, inorgánicas y bacterias. El tamaño de las partículas varía entre 1 m m y 1000 m m. Las células vivas del flóculo representan entre el 5 y el 20% del total de bacterias. Los microorganismos presentes en los flóculos son bacterias, hongos, protozoos y rotíferos. 1.-) Bacterias: constituyen el principal componente. Los géneros principales son Zooglea, Pseudomonas, Flavobacterium, Alcaligenes, Bacillus, Achromobacter, Corynebacterium y Acinetobacter; también hay formas filamentosas como Beggiatoa. Estas bacterias oxidan la materia orgánica y producen polisacártidos y otros polímeros extracelulares que facilitan la floculación. Los microorganismos aerobios representan una fracción importante cuyo número varía inversamente al tamaño del flóculo puesto que la difusión de O2 al interior se va viendo más dificultada. En los flóculos de gran tamaño el interior es anaerobio y permite el crecimiento de anaerobios estrictos (tales como metanógenos) que han sobrevivido fases de mayor aerobiosis en pequeñas bolsas anaerobias internas en flóculos de menor tamaño. Su número en los lodos activados llega a 108 ufcml-1 y entre ellas el grupo más importante numéricamente es el de Pseudomonas. En los lodos activados también hay bacterias autotrofas tales como las nitrificantes (Nitrosomonas y Nitrobacter responsables de la DON) e incluso algunas bacterias fotosintéticas. 2.-) Hongos: Normalmente no están presentes. Sólo en condiciones ambientales muy especiales (bajo pH, deficiencia de nitrógeno, presencia de productos tóxicos) pueden aparecer ciertos hongos de los géneros Penicillium y Cephalosporium, entre otros. 3.-) Protozoos: Están presentes como depredadores de las bacterias. Pertenecen a los tres grupos (ciliados, flagelados y rizópodos). La actividad de los protozoos contribuye significativamente a la reducción de la DBO. 4.-) Rotíferos: Son metazoos de tamaño entre 100 y 500 m m. Son organismos que se unen al flóculo y desarrollan dos importantes funciones en él: (a) eliminan las bacterias libres que no se han agregado al flóculo, y (b) contribuyen a la formación del flóculo mediante la producción de materia fecal rodeada de capas de mucus. Aspectos nutricionales del proceso: Las aguas residuales domésticas tienen una relación C:N:P de 100:5:1 lo que satisface las necesidades nutritivas de muchos microorganismos que digieren la matera orgánica en pocas horas transformando la DBO en biomasa. La aireación en este tanque permite 1.-) mantener las condiciones de aerobiosis que dirigen el proceso, y, 2.-) mantener en suspensión los flóculos para que puedan acceder a todo el volumen de líquido en tratamiento. Cuando los microorganismos han reducido la cantidad de nutrientes de forma significativa entran en una fase metabólica similar a la estacionaria y en ella producen gran cantidad de polímeros extracelulares (por ejemplo Zooglea) que permiten la agregación del material del flóculo. Los heteropolisacáridos que forman el núcleo del flóculo son refractarios a la biodegradación. Digestión anaerobia de aguas residuales Consiste en una serie de procesos microbiológicos dirigidos a la digestión de la materia orgánica con producción de metano. Es un proceso en el que pueden intervenir diferentes tipos de microorganismos pero que está dirigido principalmente por bacterias. Presenta una serie de ventajas frente a la digestión aerobia: (1º) muchas bacterias anaerobias pueden usar CO 2 como aceptor de electrones y, por tanto, no hay necesidad de suministrar oxígeno por lo que el proceso es más barato. (2º) Se produce menos cantidad de lodo porque la eficiencia energética de las bacterias anaerobias es menor: el 50% del U N I V E R S I D A D 26 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS carbono es convertido en biomasa en condiciones aerobias y sólo el 5% en condiciones anaerobias. (3º) Se produce un gas útil. (4º) El requerimiento energético es menor (5º) Se pueden degradar compuestos xenobióticos. Sin embargo, se pueden citar algunos inconvenientes: (1º) Es un proceso lento, (2º) Muy sensible a agentes tóxicos. TAREA DEL DIF´s: El equipo de trabajo revisará la literatura existente y por medio de la discusión grupal realizarán un esquema de los procesos aplicados para el tratamiento de las aguas servidas en la Ciudad de Santa Cruz. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DIF´s # 2. UNIDAD O TEMA: MIICROBIOLOGÍA APLICADA TITULO: TRATAMIENTO DE RESIDUOS SOLIDOS FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Introducción. Los residuos sólidos urbanos (RSU, en inglés Municipal Solid Waste, MSW) es un tipo de contaminación muy heterogéneo en composición (madera, tela, plástico, metal, restos de alimentos, papel, etc.) muy concentrada en su producción (los grandes núcleos urbanos producen más RSU que los pueblos pequeños) y a la que contribuimos todos de forma significativa. La composición de los RSU varía históricamente, estacionalmente y según el nivel económico del núcleo urbano que los produce. Tratamiento de los RSU. Las soluciones para el tratamiento de los RSU son variadas: 1.-) La más clásica es el vertedero en el que no se selecciona el material. Este procedimiento ha venido siendo poco costoso económicamente aunque no ecológicamente. Actualmente plantea dos problemas: (a) no existe seguridad de que no se produzcan filtraciones del material vertido a las aguas subterráneas; y (b) es muy difícil encontrar nuevos emplazamientos para los vertederos cerca de los núcleos urbanos, lo que incrementa el coste del vertido. La tendencia actual es hacia la reducción del número y la capacidad total de los vertederos; aunque seguirán existiendo como vertederos selectivos para el material biológicamente inactivo que no sea recuperable mediante reciclaje o compostaje. 2.-) Incineración que presenta problemas económicos (las instalaciones son muy costosas) y ecológicos (problemas relacionados con la seguridad y toxicidad de los humos y cenizas). Sin embargo, la incineración permite una gran reducción del volumen (85%) y del peso (75%) del material destinado a los vertederos. 3.-) Reciclado y compostaje. El reciclado consiste en la de restos de papel, metal o cristal en materias primas para nuevos productos en los que no cambia el material (el papel se convierte en nuevo papel). Compostaje es el proceso en el que los residuos no reciclables pero biodegradables se convierten por un proceso microbiológico en residuos orgánicos estables con menos peso y volumen, inocuos desde el punto de vista sanitario, fácilmente transportables y almacenables y útiles como aditivos en el tratamiento de suelos. Para un tratamiento correcto de los RSU es necesaria su clasificación por los consumidores (que son sus principales generadores) mediante la separación de los residuos siguiendo una de dos estrategias U N I V E R S I D A D 27 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS alternativas: 1.-) Históricamente se ha prestado más atención al reciclado por lo que la separación de los residuos en dos fracciones se hacía en reciclable/no reciclable más compostable. 2.-) Alternativamente se puede hacer la clasificación en base al compostaje en dos fracciones: compostable/no compostable más reciclable. Esta última alternativa permite un compostaje más permite obtener un compost de más calidad que en el caso anterior puesto que la separación de los residuos no compostables se realiza por el consumidor y, por lo tanto, se realiza en el origen. La separación del material reciclable del no reciclable, en este caso, se hace en la factoría de tratamiento de los RSU. La factoría de tratamiento de los RSU ha de realizar en cualquiera de los dos casos, una clasificación final de los residuos, y un tratamiento inicial previo al compostaje que suele consistir en la disgregación y fractura del material en trozos pequeños y en humedecerlo para que tenga la cantidad de agua adecuada para el proceso microbiológico. Compostaje. Definición. El compostaje es un proceso de fermentación sólida espontánea basado en el aumento de la temperatura producido por la actividad de los microorganismos. El material a comportar es el medio de cultivo, la fuente de nutrientes, el inóculo, la fuente de agua y el producto final. El propio material retiene el calor producido por los microorganismos y esto causa el aumento en la temperatura del proceso. Para esto es necesario que la cantidad de material a comportar supere un mínimo crítico. Generación de calor durante el compostaje. El aumento de la temperatura durante el proceso de compostaje se debe al catabolismo aerobio del material compostable por los microorganismos que forman su flora natural. Como consecuencia de este metabolismo aerobio se utilizan los carbohidratos, lípidos y proteínas del substrato como fuente de carbono y de energía por los microorganismos quimioheterotrofos; estos nutrientes son metabolizados por rutas diferentes que convergen en ciclos productores de gran cantidad de energía (ciclo de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos) tanto directamente utilizable (una molécula de ATP por ciclo completo) como obtenible mediante la cadena transportadora de electrones (cadena respiratoria, 2 moléculas de NADH+H+, una de NADPH+H+ y una de FADH2 por vuelta de ciclo). Parte de esta energía la disipan los microorganismos como calor, necesario para elevar la temperatura ambiental de forma que puedan funcionar metabólicamente de forma más eficiente. Cuando, debido al apilamiento de material compostable, parte del calor producido queda atrapado en el mismo material en proceso de compostaje, se produce un efecto de retroalimentación de la generación de calor. Ejemplo de proceso de compostaje. El proceso de compostaje puede ejemplificarse con el tratamiento de las hojas en producidas en otoño: al caer las hojas están cubiertas por muchos microorganismos. Por separado no muestran variaciones de temperatura como resultado del metabolismo microbiano; pero si se apilan para que contengan la temperatura, ésta sube y se produce un proceso de selección de los microorganismos: 1.-) las bacterias y hongos mesófilos, mediante un proceso de retroalimentación positiva incrementan su número y la temperatura hasta que ésta se hace limitante y mueren (hacia 45ºC-55ºC); (2º) a esta temperatura los microorganismos más importantes son los termófilos que, mediante un segundo proceso de retroalimentación positiva-neutra-negativa, incrementan número y temperatura hasta alcanzar los 80ºC; (3º) a esta temperatura se produce un cierto proceso de autoesterilización del producto y la temperatura desciende progresiva e irreversiblemente. Si el material de partida está muy compactado o con mucha humedad, no se puede producir un intercambio efectivo de oxígeno y se desarrollan procesos fermentativos que retrasan o impiden el aumento de temperatura. El proceso espontáneo de compostaje es relativamente lento debido al efecto inhibidor de la alta temperatura y a la disminución del oxígeno interno. Esto no es importante para procesos pequeños; pero es muy problemático en los procesos industriales debido al incremento del coste que supone. Manipulación del proceso de compostaje. Industrialmente es necesario agilizar el proceso de compostaje para que se produzca totalmente con la máxima rapidez. Para esto hay que manipular las variables del proceso de fermentación para conseguir las condiciones óptimas para el proceso. Los aspectos manipulables del proceso son el tamaño y la U N I V E R S I D A D 28 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS forma de la pila de compostaje, la agitación mecánica del material y la ventilación del proceso. Vamos a estudiar varios casos en los que se alteran estas variables para estudiar su efecto en la velocidad del proceso. (1) Efecto del tamaño y forma de la pila. Como ejemplo estudiaremos con más detalle el compostaje urbano de las hojas de árboles. Este material se produce sólo durante un periodo concreto del año (dos meses en otoño) lo que permite disponer de nueve meses para su procesado y, por consiguiente, un compostaje lento. El diseño de la pila ha de hacerse en función de los requerimientos del proceso y de las condiciones ambientales: (a) al inicio es necesario una buena aireación del material para que se inicie el proceso de incremento de la temperatura evitando la anoxia; al mismo tiempo, es necesario evitar un excesivo incremento de la temperatura en esta primera etapa que conduzca a una autoesterilización del material antes de que sea biológicamente estable. Por consiguiente, esta primera pila será de dimensiones reducidas. (b) En invierno, el descenso acusado de la temperatura ambiental hace de este el factor limitante que hay que prevenir, y esto se logra combinando dos pilas de compostaje de otoño en una mayor de invierno. (c) En primavera es necesario, de nuevo, prevenir la anoxia por lo que el cultivo es agitado mecánicamente al principio de la estación permitiendo su evolución espontánea a continuación. (2) Agitación mecánica. Si se agita periódicamente el material conpostando para obtener un control de la temperatura y un aumento del nivel interno de oxígeno puede comprobarse que el proceso mecánico no supone una reducción de la temperatura significativa (45ºC-55ºC-79ºC a las 0, 10 y 35 horas tras la agitación) mientras que los niveles de oxígeno no se hacen limitantes durante un periodo en el que la temperatura lo es (20%, 2,5%, 10% durante el mismo periodo, indicando el último incremento el resultado de la autoesterilización del cultivo). Por consiguiente, la agitación mecánica no es un procedimiento realista de control de la temperatura durante el proceso de compostaje, y no tiene un efecto significativo sobre la disponibilidad de oxígeno. Tiempo Temperatura Oxígeno 0 45ºC 20% 10 h 55ºC 2.5% 35h 79ºC 10% La tabla indica la variación de la temperatura y del porcentaje de oxígeno en la masa en fermentación a diferentes tiempos (medidos en horas) después de un volteo mecánico. El aumento de la cantidad de oxígeno a las 35h se debe al proceso de autoesterilización por alta temperatura que detiene su consumo por los microorganismos presentes en la mezcla. (3) Ventilación. La ventilación forzada de la pila de compostaje permite proporcionar oxígeno, eliminar CO 2 y descender la temperatura del proceso. La mayor parte del calor que se genera procede de la respiración aerobia de los microorganismos, y este calor se emplea, en su mayor parte (80%), en la vaporización del agua, de forma que es necesario mucho más aire para eliminar el calor generado que para proporcionar el O2 necesario (relación 9:1). El calor eliminado por ventilación puede calcularse como Q v=m(hsalida-hentrada) donde m es el flujo de aire (masa por unidad de tiempo), h entrada es la entalpía del aire de entrada (energía por unidad de masa de aire), hsalida la del aire de salida y Qv la energía por unidad de tiempo eliminada. Los valores de h dependen de la humedad relativa del aire que en salida es del orden del 100%. Los valores de Qv vienen limitados por las condiciones biológicas de los microorganismos. Procesos basados en el flujo libre de aire Cuando la ventilación se diseña para proporcionar O 2 se hace pasar aire a través de la pila controlando el flujo con un programador de tiempo que está activo durante poco tiempo y es capaz de mover U N I V E R S I D A D 29 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS decenas de metros cúbicos de aire seco por tonelada y hora de material. En estas condiciones, para mantener una concentración de O2 del orden del 10-15% el flujo de aire necesario (m) es demasiado pequeño para evitar que se produzca el suicidio por elevación de la temperatura de la población microbiana. Esto enlentece excesivamente la duración del compostaje. El mayor inconveniente de este sistema es que se produce un gradiente de temperatura muy acusado entre la parte inferior y la superior de la pila de compostaje, lo que genera diferencias en la velocidad del proceso y, finalmente, una desecación del material que puede comprometer la velocidad de crecimiento de los microorganismos. De hecho, como la humedad generada deriva únicamente del calor producido por la actividad biológica, una manera de seguir el proceso de compostaje es el seguimiento de la humedad del aire de salida. Procesos basados en la recirculación de aire. El proceso denominado de «túnel holandés» se utiliza para producir compost destinado a la producción de champiñón. Consiste en la construcción de pilas de 3x3x33m cerradas en salas especiales. El suelo es falso y permite que se insufle el aire desde la parte inferior del compost, este aire sale por la parte superior y es recogido en la bóveda de la cámara. El aire se hace recircular pasando bien por un compresor que lo refrigera y descarga de humedad o bien directamente a la parte inferior de la cámara; la elección de uno u otro circuito depende de la necesidad de humedad de la mezcla. Se permite la entrada de aire nuevo del exterior dependiendo de la necesidad de oxígeno para el proceso, el volumen de aire del exterior que entra es compensado por liberación al exterior de aire del circuito. Con este sistema se puede lograr, mediante un control computerizado del proceso, que no se genere un gran gradiente de temperatura en la cámara de fermentación, lo que hace que el proceso, y el producto final, sean más homogéneos. Así mismo, permite un control muy fino de la temperatura y de la humedad. El sistema requiere menos consumo de aire ambiental y un aislamiento de una zona más pequeña que en los casos anteriores, lo que facilita la ventilación de las instalaciones y el manejo de los gases de salida. TAREAS DEL DIF´s: El equipo de trabajo revisará la literatura existente y realizará los siguientes trabajos: 1.- Investigue que tipo de tratamiento y defina cada una de las etapas, por las que atraviesas los RSU de la Ciudad de Santa Cruz. y cuales son las instituciones involucradas 2.- Analice los problemas administrativos y operacionales del manejo del Vertedero Municipal. 3.- Proponga soluciones para el tratamiento de los RSU, que comiencen desde nuestras propias casas. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DIF´s # 3. UNIDAD O TEMA: MIICROBIOLOGÍA APLICADA TITULO: CICLOS BIOGEOQUÍMICOS FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: U N I V E R S I D A D 30 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS La integración de las actividades metabólicas de todos los microorganismos de un ecosistema es la causa de una gran parte de los cambios que se producen tanto en sus componentes bióticos como en los abióticos. Definiciones Ecología microbiana: examen de las interacciones dinámicas de los microorganismos con su ambiente, tanto con el vivo (biótico) como con el abiótico. Las interacciones son dinámicas porque cambian con el tiempo mientras las diferentes poblaciones se van adaptando al ambiente (en sentido amplio) para lograr un equilibrio en el conjunto. Ecosistema: unidad ecológica básica, funcionalmente autosuficiente, autorregulable y estructurada, en la que cada población ocupa un nicho ecológico. Nicho: papel que desempeña una comunidad de organismos (población) en un ecosistema. Hábitat: lugar ocupado por un ecosistema Biosfera: porción de la tierra ocupada por los seres vivos. En ella se integran todos los ecosistemas en los que los microorganismos desempeñan funciones diversas. Ciclo biogeoquímico: movimientos de materiales a través de reacciones químicas en toda la biosfera. Supone un cambio de materiales entre las partes bióticas y abióticas de la biosfera. Los microorganismos, a través de sus actividades metabólicas, desempeñan un papel importante en el intercambio de materiales entre los diversos apartados de la biosfera. Los principales elementos integrantes de la materia viva son los más intensamente ciclados por los microorganismos: el carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. La actividad humana que origina una liberación de elementos alterando los equilibrios de las etapas de los ciclos biogeoquímicos puede tener gran importancia en el desarrollo de las poblaciones microbianas, de plantas y de animales y en la productividad de los ecosistemas particulares. Ciclos biogeoquímicos representativos Ciclo del carbono El ciclo comprende la transferencia del bióxido de carbono y el carbono orgánico entre la atmósfera, donde está principalmente en forma de CO2, y la hidrosfera y litosfera donde está en forma de carbono orgánico e inorgánico. El proceso de fijación del carbono atmosférico se produce por microorganismos fotolitotrofos y quimiolitotrofos. El carbono fijado (reducido) vuelve a la atmósfera como resultado de la respiración. La formación de metano (CH4) por bacterias metanógenas es una desviación del ciclo llevada a cabo por arqueobacterias. El metano no es utilizable por otros organismos. La principal fuente de metano atmosférico es la biógena y, dentro de ella, la producción de este gas durante el proceso de fermentación que tiene lugar en el rumen de los herbívoros. Relaciones tróficas El carbono fijado por los productores primarios (producción primaria bruta) comienza a se consumida por los propios productores primarios y mineralizado por ellos a CO2. Sólo una parte de la producción primaria (producción primaria neta) sirve de alimento para los productores secundarios y así se forman las cadenas tróficas. La mayor parte del carbono se pierde de forma en forma de CO 2 por lo que conforme se asciende en la cadena trófica la cantidad de biomasa es menor. Por otra parte, el balance entre el carbono fijado por la fotosíntesis y el consumido durante la respiración da lugar a una acumulación o reducción de la biomasa U N I V E R S I D A D 31 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS total del ecosistema. Normalmente, entre el 85% y el 90% de la energía acumulada en forma de carbono orgánico en un nivel trófico es consumida por la respiración durante la transferencia al siguiente nivel. Por esto, la cantidad de biomasa en niveles tróficos superiores es cada vez menor. Se pueden establecer cadenas tróficas de materia viva (organismos depredadores) y cadenas tróficas de materia muerta (detritus) en la que la actividad de los microorganismos conduce a la mineralización (producción de CO2) o la reinserción en el ciclo (formación de biomasa por los microorganismos consumidores de detritus) biológico del material inutilizable. Los microorganismos son los principales responsables de la mineralización de la materia orgánica de los detritus. Los distintos productos orgánicos tienen diferentes tasas de mineralización por los microorganismos. Así mismo, en la velocidad de mineralización microbiana tiene una gran influencia el pH, temperatura, humedad y grado de aireación del suelo; factores que influyen también el los tipos de poblaciones microbianas que van a desarrollar los respectivos procesos. Movilización e inmovilización microbiana del carbono La actividad microbiana puede hacer el carbono inaccesible a los consumidores mediante transformaciones que lleven a la formación de humus (restos de material vegetal difícilmente metabolizable) o a la producción de metano. Así mismo, la conversión de formas de carbono no digestibles (celulosa, materia fecal) en biomasa utilizable es resultado de la actividad microbiana. Ciclo del hidrógeno y del oxígeno Son ciclos íntimamente relacionados con el del carbono. El sitio de reserva principal de ambos elementos es el agua y el ciclo comprende reacciones de oxidorreducción componentes de los procesos respiratorios y de fotolisis del agua. Actividades microbianas y oxígeno El metabolismo microbiano está condicionado por la disponibilidad y tolerancia al oxígeno. El nivel de oxígeno en un ambiente puede medirse por el potencial de oxidorreducción del mismo. La actividad microbiana (excepto en el caso de la fotosíntesis oxigénica) tiende a reducir el potencial redox y a dificultar la vida aerobia. Muchos microorganismos pueden continuar su actividad en condiciones anaerobias; pero esto no es posible en el caso de animales. pH y actividades microbianas. La actividad microbiana causa cambios en el pH del suelo o agua en la que se produzca. Estos cambios en el pH pueden tener efectos selectivos fuertes sobre otras bacterias (no suficientemente acidófilas para tolerar ambientes extremos cuando éstos se produzcan) y tiene efectos químicos sobre la solubilidad de gases en el agua, la disponibilidad de nutrientes cuya solubilidad varía y la concentración de metales pesados en los ecosistemas. Ciclo del nitrógeno - Fijación del nitrógeno Proceso de reducción del N2 atmosférico, no asimilable, a NH4+ asimilable por las plantas y, a través de ellas, por toda la cadena trófica. La fijación de nitrógeno se produce únicamente por bacterias en condiciones anaerobias y requiere el consumo de una gran cantidad de energía. La fijación de nitrógeno supone unos 2x108Tm al año (unas 8 veces la producción anual de abonos nitrogenados). - Amonificación Consiste en la liberación del NH4+ de las moléculas inorgánicas. Es un proceso microbiano producido por microorganismos ureolíticos y por especies que posean desaminasas. - Nitrificación U N I V E R S I D A D 32 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Proceso en el que ciertos quimiolitotrofos utilizan la energía liberada en la oxidación del NH 4+ para sus reacciones metabólicas. Este proceso es muy poco eficiente, por lo que es necesaria la oxidación de una gran cantidad de substrato para que pueda producirse un crecimiento apreciable de este tipo de microorganismos. Por otra parte, el proceso es obligadamente aerobio. La nitrificación produce un cambio notable en el estado de oxidación del nitrógeno fijado al pasar de forma catiónica (NH4+) a aniónica (NO3-). En suelos arcillosos de gran carga negativa, el NH 4+ queda retenido con más facilidad, mientras que el NO 3- no se retiene y pasa a aguas subterráneas con lo que sale del sistema. Un efecto colateral negativo de la nitrificación es que los nitratos son tóxicos para animales ya que pueden dar lugar, entre otros efectos indeseables, a la producción de nitrosaminas y de otros agentes cancerígenos. En ciertas ocasiones, se han utilizado inhibidores de la nitrificación para reducir estos efectos en el suelo. - Desnitrificación Se produce por la actividad de microorganismos que, en condiciones de anaerobiosis, son capaces de utilizar NO3- y NO2- como aceptores finales de electrones en procesos de respiración anaerobia. Los productos finales son diferentes estados de oxidación del nitrógeno (NO, N 2O, N2) dependiendo de la disponibilidad de materia orgánica, de la concentración de nitratos y del pH del suelo. Este proceso cierra el ciclo del nitrógeno: es una reducción desasimiladora. Ciclo del azufre El ciclo comprende varios tipos de reacciones redox desarrolladas por microorganismos: 1.- Ciertos tipos de bacterias son capaces de extraer el azufre de compuestos orgánicos (proceso de desulfuración) que rinde SO4= en condiciones aerobias y H2S en condiciones anaerobias. 2.- Bacterias anaerobias respiradoras de SO4= que producen la acumulación de H2S hasta alcanzar concentraciones tóxicas. 3.- Bacterias fotosintéticas anaerobias pueden usar el H2S como donador de electrones en sus procesos metabólicos dando lugar a depósitos de azufre elemental (Sº). 4.- Bacterias quimiolitotrofas que utilizan el H2S como fuente de energía para la producción de ATP. En muchos casos se producen asociaciones entre bacterias formadoras y consumidores de H 2S en un sistema balanceado. En todos los caos, el Sº es la forma no asimilable y sólo puede entrar en el ciclo por la acción de algunas bacterias que son capaces de oxidarlo a SO 4=. Drenaje ácido de las minas En minas de carbón en muchas ocasiones hay una contaminación con pirita (Fe 2S) que se oxida rápidamente en contacto con el aire y por acción microbiana. La oxidación de estos sulfuros puede dar lugar a la producción de grandes cantidades de SO 4H2 que acidifica el suelo impidiendo todo crecimiento posterior de plantas o de bacterias no acidófilas extremas. Este ácido puede alcanzar el agua de los ríos al escurrir de las pilas de carbón que están sufriendo el proceso. Otros ciclos Fósforo Este ciclo no está sometido a procesos redox porque la forma esencial del fósforo (tanto orgánico como inorgánico) es el fosfato. La actividad microbiana reside en la capacidad de producción de otros ácidos orgánicos que aumenten o disminuyan la solubilidad de los fosfatos en el ecosistema haciéndolos más o menos accesibles a otros organismos. El fosfato suele ser limitante del crecimiento. Una entrada masiva de fosfatos en el sistema (como ocurre debido al empleo masivo de detergentes fosfatados) aumenta la productividad del ecosistema con lo que la materia orgánica aumenta considerablemente. Cuando esta materia orgánica comienza a descomponerse, se incrementan los procesos de respiración y, por consiguiente, el consumo de oxígeno, lo que genera un incremento de anaerobiosis conocido como proceso de eutrofización. U N I V E R S I D A D 33 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Hierro El ciclo de este elemento está asociado a la conversión entre sus formas Fe 2+ más soluble que las Fe3+. Los microorganismos que oxidan hierro (quimiolitotrofos) producen cambios en la accesibilización del elemento a otros miembros del ecosistema. Calcio El ciclo biogeoquímico del calcio consiste en variaciones de su solubilidad debido a la formación de compuestos carbonatados más (Ca(CO3H)2) o menos (CaCO3) como consecuencia de la liberación por microorganismos de ácidos orgánicos que desplacen el equilibrio entre ambas formas. Metales pesados Los microorganismos pueden cambiar el estado de oxidación o de modificación (metilación,. por ejemplo) de metales pesados de manera que aumenten o disminuyan su toxicidad o su adsorción a las membranas y estructuras biológicas, lo que influye determinantemente en su acumulación a lo largo de la cadena trófica. TAREAS DEL DIF´s: El equipo de trabajo complementará el presente trabajo con otra literatura al respecto y luego de la discusión grupal elaborará un informe donde se demuestre que determinaron y evaluaron, cuales son los géneros bacterianos que interviene en cada uno de los ciclos mencionados. Mostrando su importancia. PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD DIF´s # 4. UNIDAD O TEMA: MORFOLOGÍA BACTERIANA TITULO: BACILOS ACIDO-ALCOHOL RESISTENTES FECHA DE ENTREGA: PERIODO DE EVALUACIÓN: Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la coloración de Gram y no pueden ser clasificados como Gram positivos o negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de Ziehl-Neelsen (Tinción Acido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes (BAAR). Los microorganismos del género Mycobacterium contienen una membrana citoplasmática formada por una bicapa lipídica similar a las restantes eubacterias. Por encima de esta membrana se encuentra el rígido peptidoglicano que contiene N-glucolilmurámico en lugar de N-acetilglucosamina. Por medio de U N I V E R S I D A D 34 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS una unión fosfodiéster, el peptidoglicano se halla unido covalentemente al arabinogalactano, un polímero de arabinosa y galactosa. En la porción más distal y externa de los arabinogalactanos se hallan fijados los ácidos micólicos que tienen cadenas carbonadas largas (C60 a C90). Los glucolípidos son un grupo de compuestos (micolatos de trealosa, sulfolípidos, micósidos, etc) que se encuentran asociados no covalentemente a los ácidos micólicos y se ubican periféricamente en la pared. Los micolatos de trealosa (llamados factores de cordón porque su presencia produce cultivos que tienen forma de cordones serpenteantes) y sulfolípidos se encuentran principalmente en las cepas de Mycobacterias más virulentas. El lipoarabinomanano (LAM) es un compuesto que se halla anclado en la membrana citoplasmática. El LAM es considerado como el equivalente mycobacteriano del lipopolisacárido de las Gram negativas debido a que provoca una importante respuesta antimicrobiana en macrófagos. En las cepas de Mycobacterias más virulentas la arabinosa terminal del LAM está recubierta con residuos de manosa (manLAM) a diferencia de las cepas no virulentas no están recubiertas (AraLAM). Además, el LAM también podría servir como poro para el paso de los nutrientes a través de la pared celular. En la pared celular también se encuentran proteínas inmunoreactivas que son utilizadas con fines diagnósticos (PPD). El Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis, una enfermedad que primariamente produce lesiones en los pulmones y que puede causar la muerte si nos es tratada en forma adecuada. Existen otras Mycobacterias capaces de producir infecciones en el hombre. El M. bovis también causa tuberculosis, mientras que las infecciones producidas por M. avium, M. kansakii, M. fortuitum y M. chelonei son consideradas oportunistas y no tuberculosas. La lepra es una infección causada por el Mycobacterium leprae que es un parásito intracelular obligado que se multiplica lentamente en células fagocitarias mononucleares como los histiocitos de la piel y en las células de Shwan de los nervios. La tuberculosis es una enfermedad de distribución mundial pero con consecuencias devastadoras en los países en desarrollo. En el año 1993 la Organización Mundial de la Salud (OMS-WHO World Health Organization) declaró a la tuberculosis una "Emergencia Global". Se estima que un tercio de la población mundial está infectada con el M. tuberculosis, y que en la próxima década serán infectadas más de 300 millones de personas de las cuales 90 millones desarrollarán la enfermedad y 30 millones morirán por ella. TAREA DEL DIF´s: El equipo de trabajo, en base al presente resumen y por medio de la revisión bibliográfica y la discusión grupal determinará los siguientes cuestionamientos: 1.- ¿Cuáles son las diferencias básicas de este género bacteriano con respecto a las bacterias No Alcohol Ácido Resistentes? 2.- ¿Qué beneficios otorgaría esta diferencia estructural a las bacterias del género Mycobacterium? U N I V E R S I D A D 35 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS IX. PRÁCTICAS DE LABORATORIO. Normas generales de uso del laboratorio Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad. 1. Se debe llevar siempre puesto el mandil para proteger la ropa. 2. Las sesiones se iniciaran con una explicación detallada e instrucciones del trabajo a realizar, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. No empiece a trabajar antes de haber recibida la explicación. Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se conozcan. 3. Lávese las manos al inicio y fin de cada sesión. 4. No ingiera alimentos, ni fume en los laboratorios. 5. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. 6. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. 7. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación. 8. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el profesor. 9. No tocar con las manos y menos con la boca los productos químicos. 10. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. 11. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama. 12. Cuando se manejan productos corrosivos (ácidos, álcalis, etc.) deberá hacerse con cuidado para evitar que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se verterán bruscamente en los tubos de ensayo, sino que se dejarán resbalar suavemente por su pared. 13. Cuando se quiera diluir un ácido, nunca se debe echar agua sobre ellos; siempre al contrario: ácido sobre agua. 14. Cuando se vierta un producto líquido, el frasco que lo contiene se inclinará de forma que la etiqueta quede en la parte superior para evitar que si escurre líquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda identificar el contenido del frasco. 15. No pipetear nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba manual, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el laboratorio. 16. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo superior para regular la caída de líquido. 17. Al enrasar un líquido con una determinada división de escala graduada debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la altura de los ojos para que la visual al enrase sea horizontal. 18. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen líquidos debe evitarse la ebullición violenta por el peligro que existe de producir salpicaduras. El tubo de ensayo se acercará a la llama inclinada y procurando que ésta actúe sobre la mitad superior del contenido y, cuando se observe que se inicia la ebullición rápida, se retirará, acercándolo nuevamente a los pocos segundos y retirándolo otra vez al producirse una nueva ebullición, realizando así un calentamiento intermitente. En cualquier caso, se evitará dirigir la boca del tubo hacia la cara o hacia otra persona. 19. Cualquier material de vidrio no debe enfriarse bruscamente justo después de haberlos calentado con el fin de evitar roturas. 20. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen. U N I V E R S I D A D 36 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS El Microscopio óptico compuesto PARTES DE UN MICROSCOPIO ÓPTICO Sistema óptico o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del objetivo. o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación. o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecánico o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación. o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, ….. o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y micrométrico que consigue el enfoque correcto. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya debería estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. 6. Empleo del objetivo de inmersión: a. Bajar totalmente la platina. b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite. U N I V E R S I D A D 37 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS c. d. e. f. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de x40. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3. i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación. j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica. Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el microscopio. 5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden dañar las lentes y su sujeción. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico, micrométrico, platina, revólver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está observando a través del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de los mismos. PRÁCTICA DE LABORATORIO 1 Examen microscópico de las bacterias PREPARACIONES FRESCAS O HÚMEDAS PARA BACTERIAS VIVAS. En este preparado las bacterias vivas suspendidas en un medio líquido se muestran refringentes o transparentes, por lo que se debe cerrar el diafragma del microscopio. A través de esta técnica se observa si las bacterias tiene movimiento o no, es decir las que poseen flagelos se desplazaran a todas partes y las que no se dejaran arrastrar por las moléculas de agua en una sola dirección, a este fenómeno se la conoce como movimiento Browniano. También es posible observarla forma de las bacterias o algún cambio citológico como ser la división binaria o, la presencia de bacterias en el citoplasma de las células vivas. U N I V E R S I D A D 38 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS PASOS 1. Tomar un portaobjetos limpio y desprovisto de grasa. 2. A partir del medio líquido utilizando una pipeta Pasteur y válvulas para absorber, se colococan de 13 gotas del medio y sobre estas un cubreobjetos. 3. Observar al microscopio con la ayuda de los objetivos: 4X, 10X o 40X. PREPARACIÓN DEL FROTIS PARA BACTERIAS MUERTAS Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. PASOS 1. Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente. 2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. 3. Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse. FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS 4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos. Dejar enfriar el porta entre los pases. 5. Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Golpear el portaobjetos por su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Una vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar con el proceso de tinción. TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO 6. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos. En ocasiones el colorante tiñe sólo en caliente, por lo que el tiempo que dure su actuación se deberá sostener el portaobjetos con unas pinzas sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se produciría la destrucción de las células. 7. Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar la máxima cantidad de agua de los portaobjetos golpeándolos por su canto con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo. 8. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningún caso se debe frotar el porta. 9. Observar la preparación al microscopio llegando hasta el máximo aumento. Si se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de inmersión. MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIÓN U N I V E R S I D A D 39 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS La técnica siguiente es de aplicación para cualquier preparación microscópica que se desee montar de forma definitiva. Se anotará en un extremo del portaobjetos el contenido de la preparación, la fecha y, en su caso, el nombre del alumno. 10. Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteniéndolos un mínimo de 5 minutos en cada baño. La serie de alcoholes puede modificarse en función de la disponibilidad de los reactivos, pero el objetivo es que la preparación quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño. a. Alcohol de 70º b. Alcohol de 95º c. Acetona pura d. Acetona-xilol (1:1) e. Xilol Montar la preparación. Emplear bálsamo de Canadá, euparal o algún medio de montaje sintético. Utilizar preferiblemente cubreobjetos de 22x22 mm. PRÁCTICA DE LABORATORIO 2 Observación de bacterias En microbiología se utilizan diferentes técnicas de coloración para una mejor observación de las bacterias, en casi todas las coloraciones se utilizan productos o colorantes. En aquellos casos que en colorante tienen carga +, se colorean las estructuras con carga – y, con los de carga -, las estructuras +. Dentro de las coloraciones tenemos: a) las simples o primarias, caracterizadas por la utilización de un solo colorante, y b) las especiales o estructurales, en las que intervienen dos o mas colorantes. OBJETIVOS 1. Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales. 2. Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qué casos se recomienda una u otra. 3. Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones que existen. 4. Practicar con el microscopio al máximo aumento y con el correcto empleo del aceite de inmersión. MATERIAL Mechero Bunsen o de alcohol Asa de siembra o aguja enmangada Pinzas Portaobjetos Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc. Colorantes para tinción: a) Solución de cristal violeta al 1% b) Solución de safranina al 0,5% c) Azul de metileno al 1% Microscopio y aceite de inmersión BACTERIAS DEL YOGUR El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas arrosariadas). Además, el tamaño del lactobacilo (unos 30µm de longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha práctica con el enfoque del microscopio. 1. Realizar el frotis disolviendo una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua. 2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa. 3. Teñir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos. U N I V E R S I D A D 40 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 4. Observar al máximo aumento del microscopio. BACTERIAS DEL VINAGRE El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti, aunque también Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares. 1. Tomar con una aguja enmangada una pequeña porción de madre de vinagre natural o de la telilla que se forma sobre la superficie de los vinos agriado. 2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis. 3. Dejar secar y fijar con calor. 4. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. BACTERIAS DEL SARRO DENTAL El sarro dental es un depósito consistente y adherente localizado sobre el esmalte de los dientes. Está constituido principalmente por restos proteicos, sales minerales y bacterias junto con sus productos metabólicos. La flora bacteriana de la cavidad bucal es muy variable dependiendo de las condiciones que se den en el momento de hacer la preparación, pero suelen abundar bacterias saprófitas, pudiéndose observar gran variedad de morfologías: espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos. 1. Con una aguja enmangada tomar una pequeña porción de sarro dental y disolverla en una gota de agua sobre el portaobjetos. 2. Dejar secar y fijar con calor. 3. Teñir 2-3 minutos, lavar el exceso de colorante y secar. BACTERIAS DEL SUELO La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prácticamente infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso, desconocidas para los microbiólogos. Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardín. Después de varios días, las bacterias se habrán adherido al vidrio y sólo habrá que fijarlas por calor y teñirlas con un colorante cualquiera. Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, así como la parte que no se va a teñir. PRÁCTICA DE LABORATORIO 3 Tinción Gram La coloración de Gram es una coloración de tipo especial en la que interviene el cristal violeta y la safranina o fuscina básica, fue descubierta hace más de 100 años por el médico Christian Gram y hoy en día es la coloración más utilizada en los laboratorios de bacteriología. Pero su principal característica es la de dividir a las bacterias en dos grandes grupos taxonómicos: - Gram positivas (azules) - Gram negativas (rojas) Con este tipo de coloración se da inicio a la identificación de cada una de las bacterias. Durante muchos años no se pudo explicar y fue totalmente desconocido, el hecho de porque utilizando la misma cronología, los mismos colorantes algunas bacterias se teñían con el cristal violeta y otras con la safranina. Hasta hace muy pocos años y con la ayuda del microscopio electrónico y los trabajos en Ingeniería Genética Bacteriana se pudo dar un respuesta técnica a lo que sucede con esta coloración y, se estableció que las diferentes coloraciones que presentan los distintos géneros bacterianos se deben a la presencia del ácido teicoico en las estructuras de la pared de las bacterias. Así, en fundamento técnico radica en la presencia de ese compuesto en la capa de polipéptidos o peptidoglicanos, de las Gram positivas. MATERIAL 1. Microscopio U N I V E R S I D A D 41 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Portaobjetos Asa de siembra Cubeta de tinción Cultivo bacteriano Pinzas Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Colorantes y reactivos: i. Cristal violeta ii. Lugol iii. Alcohol-acetona iv. Safranina. REALIZACIÓN 1. Preparar los frotis bacterianos. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Teñir con cristal violeta 1min. Lavar con abundante agua el exceso de colorante. Cubrir con Lugol 1´. Lavar con agua el exceso de Lugol. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la preparación deje de perder color (3´´) Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente. Teñir con safranina 1min. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste. Secar la preparación. Examinar al microscopio con objetivo 100X, fijándose sobre todo en el color de cada preparación. Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los tiempos. En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así los tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan mientras duren esos colorantes son fiables. Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes ya preparados, pero es mucho más caro. PRÁCTICA DE LABORATORIO 4 Tinción ácido-alcohol resistente Es una coloración compuesta o estructural, pues en ella intervienen dos colorantes: fucsina fenicada y azul de metileno y, además permite descubrir algunos componente presentes en la pared celular de las llamadas bacterias alcohol- ácido resistentes. Esta coloración diferencia a las bacterias en dos grupos taxonómicos: alcohol-ácido resistentes no alcohol ácido resistentes En este tipo de coloración tienen importancia las bacterias de los géneros Mycobacterium y Nocardia, dentro del primer género se encuentran bacterias tan importantes como las responsables de la tuberculosis en animales y el hombre, la de la lepra en los humanos y, muchas otras saprofitas habitantes del suelo. U N I V E R S I D A D 42 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Las bacterias del género Mycobacterium, tiene la particularidad de presentar en su pared una capa muy gruesa de lípidos, lo que impide que puedan colorearse utilizando cualquier otro método, por lo que se utiliza esta coloración de Zhiel Neelsen, en la cual intervienen colorantes y medios físicos como el calor para permitir la penetración del colorante en esta gruesa capa. Y es tan fuerte la reacción que las bacterias no se decoloran ni aún utilizando el agente decolorante más fuerte como el alcohol-ácido. La explicación técnica, se debe a la presencia del ácido micólico en la capa lipídica de la pared de este grupo de bacterias, el cual les otorga la condición de bacterias alcohol- ácido resistentes. MATERIALES Microscopio Portaobjetos Asa de siembra Cubeta de tinción Cultivo bacteriano Pinzas Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Colorantes y reactivos: a) Azul de metileno b) Fucsina-fenol c) Mezcla de ácido y alcohol REALIZACIÓN 1. Prepara un frotis bacteriano. 2. Cubrir la preparación con carbofucsina. 3. Calentar la preparación en un mechero Bunsen durante 5´. No debe hervir. Si se evapora, se añade más carbofuxina para que no se seque en ningún momento. 4. Lavar con agua el resto de colorante. 5. Decolorar con la mezcla ácido-alcohol. 6. Lavar con agua para que no prosiga la decoloración. 7. Teñir con azul de metileno 1´. 8. Lavar con agua el resto de colorante. 9. Secar la preparación. 10. Examinar al microscopio. PRÁCTICA DE LABORATORIO 5 Tinción de esporas Es una coloración especial o estructural en la cual interviene dos colorantes: verde malaquita y solución acuosa de safranina o fuscina básica, desde luego permite observar con exclusividad la presencia de estructuras como las esporas, presentes en sólo dos género bacterianos: Bacillus y Clostridium. Como sabemos la espora es una fase de resistencia bacteriana cuya función principal es la de envolver el genoma o paquete genético de la célula vegetativa o célula madre. De esta manera, una vez formada la espora es liberada al medio, donde resiste condiciones adversas, como las altas temperaturas, humedad y, también bajo ciertas condiciones éstas germinan y se convierten en células vegetativas. MATERIALES Microscopio Portaobjetos Asa de siembra Cubeta de tinción Cultivo bacteriano Pinzas U N I V E R S I D A D 43 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Frasco lavador Mechero de alcohol Papel de filtro Colorantes: a) Verde Malaquita b) Safranina REALIZACIÓN 1. Preparar los frotis bacterianos indicados. 2. Teñir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra encima de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que hierva, durante 5 min. Añadir más colorante si la muestra se seca. 3. Lavar con agua el resto de colorante. 4. Teñir con safranina 1´. 5. Lavar con agua el resto de colorante. 6. Secar la preparación. 7. Observar la preparación al microscopio. PRÁCTICA DE LABORATORIO 6 Tinción de cápsulas bacterianas MATERIALES Microscopio Portaobjetos Asa de siembra Cubeta de tinción Cultivo bacteriano Pinzas Frasco lavador Mechero de alcohol Colorantes: a) Solución de fuscina alcohólica saturada o solución A b) Solución de sulfato de cobre al 20% o solución B REALIZACIÓN 1. Con el cultivo a estudiar, preparar un frotis lo mas delgado posible. 2. Fijar. 3. Colorear con solución A. 4. Calentar hasta que se emitan vapores por 30´´ 5. Lavar el frotis con la solución B. 6. Dejar secar y observar. PRÁCTICA DE LABORATORIO 7 Coloración de flagelos MATERIALES Microscopio Portaobjetos Asa de siembra Cubeta de tinción Pinzas Frasco lavador U N I V E R S I D A D 44 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Mechero de alcohol Lápiz graso Colorante de Leifson Agar inclinado de 6-8 hrs. de incubación. REALIZACIÓN 1. Calentar una de las caras del portaobjetos al mechero, trazar con el papel graso un margen sobre su superficie. 2. Colocar la muestra de bacterias en el centro del área limitada, inclinar para que se extienda. 3. Secar a temperatura ambiente. 4. Colorear con 0,8-1 ml de colorante la preparación por 10´. 5. Lavar y dejar secar al aire. PRÁCTICA DE LABORATORIO 8 Coloración del citoplasma bacteriano MATERIALES Microscopio Portaobjetos Asa de siembra Cubeta de tinción Cultivo bacteriano Pinzas Frasco lavador Mechero de alcohol Colorantes: a) Solución de Albert I b) Solución de Albert II REALIZACIÓN 1. Preparar un frotis 2. Teñir con solución Albert I durante 3-5´. 3. Lavar y secar. 4. Teñir con solución Albert II por 1´. 5. Lavar y secar con papel filtro. 6. Observar. PRÁCTICA DE LABORATORIO 9 Preparación y esterilización del material de laboratorio En microbiología donde se utilizan cultivos microbianos, medios, aparatos y materiales debemos procurar que éstos, no se encuentren contaminados y procurar que se hallen bacteriológicamente limpios antes de ser utilizados. El método aplicado para la limpieza de nuestro material será la esterilización mediante la exposición a sustancias químicas y el empleo de temperaturas elevadas durante cierto periodo. Todo esto con el fin de no tener resultados erróneos en cuento a la lectura en interpretación de nuestros análisis, debido a la presencias de microorganismos inocuos o patógenos. MATERIAL Horno Autoclave Agua destilada U N I V E R S I D A D 45 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Solución de lisol al 3% REALIZACIÓN 1. Lavar el material (cristales) con abundante detergente, enjuague con agua corriente y, por último con agua destilada. 2. Colocar el material en una solución crómica (lisol al 3%), enjuague con agua del grifo y luego con agua destilada. 3. Sacar en el horno 4. Esterilizar: Cajas Petri, envolver en papel, colocar en el horno a 160°C./1 hr, enfriar lentamente. Pipetas, introducir una mota de algodón en el cuello de la pipeta y envolver con tiras de papel de 3 cm de ancho desde la base hacia la punta, colocar a 160°C./1 hr. Tubos de ensayo, colocar algodón en la boca del tubo a 1/5 parte de longitud del mismo, depositar en un recipiente adecuado, tapar con papel y atar, 150-300°C./1-1 ½ hrs. Matraces, tapar del cuello con algodón, colocar un gorro de papel y ¼ de papel aluminio. Esterilizar en el horno a 150-200°C./1-1 ½ hrs o, en autoclave a 121°C/20´ El material metálico (asa de platino, tijeras, bisturí, material quirúrgico en general) debe ser esterilizado a la llama directa o por ebullición, no debe incluirse en la mezcla crómica. Medios de cultivo, debe estar el los recipientes perfectamente tapados, esterilizar en el autoclave a 121°C./20-30´. PRÁCTICA DE LABORATORIO 10 Preparación de medios de cultivo La preparación de medios de cultivo tiene como finalidad ofrecer a los microorganismos los factores físicos y químicos ideales para su desarrollo y multiplicación y, de esta forma poder identificarlos obteniendo cultivos puros de las muestras. MATERIALES Balanza Colorímetro Matraces Mechero Pipetas Buretas Soporte PASOS 1. Mezcla de los ingredientes: a) Pesar el polvo del medio a preparar, según las indicaciones señaladas en la etiqueta. b) Colocar en el matraz Erlenmayer c) Colocar un poco de agua y diluir d) Agregar el resto del agua e) Mezclar, homogenizando con agua del calor. 2. Esterilización, colocar en el autoclave a 121°C./15lb/15´. 3. Reparto o envasado, colocar en las placas Petri, dejando reposar y enfriar a temperatura ambiente para que se solidifique. Si se utilizan tubos, se inclinarán a 15° o completamente vertical, dependiendo de su futura aplicación. 4. Chequeo, colocar en la estufa por 24-48 hrs. a 37°C. Si se observara alguna contaminación después de este periodo, manifestada con presencia de colonias bacterianas en los medios sólidos (placas) o enturbamiento de los medios líquidos (tubos), se procede al descarte de los mismos. 5. Conservación, refrigerara entre4-15°C. hasta su utilización, que no deberá pasar de los 2 meses. PRÁCTICA DE LABORATORIO 11 U N I V E R S I D A D 46 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS Siembra y aislamiento de bacterias La siembra de las bacterias en diferentes medios con métodos especiales para obtener cultivos puros y de fácil identificación, se realizan con el objeto de lograr la perpetuación de la especie bacteriana en estudio, diagnosticar la enfermedad y establecer investigaciones sobre la célula como tal, su actividad bioquímica y fisiología. CAJA PETRI a) Siembra por estrías simple. Cerca del mechero tomar una mezcla de microorganismos y realizar una estría de manera vertical sobre el diámetro de la caja Petri (con medio de cultivo sólido), difundir o difuminar con estrías transversales continuas. b) Siembra por agotamiento. Se utiliza para efectuar transplante de bacterias. Consiste en tomar con el asa de platino esterilizada una muestra de las bacterias deseadas, realizar en 1/3 de la placa estrías transversales sin levantar el asa, luego rotar 45° y realizar otra estría continua en el otro tercio (previa esterilización del asa), rotar nuevamente repitiendo la maniobra y el espacio claro efectuar una estría simple. EN PICADURA Cerca del mechero, sembrar en los tubos con medio sólido, por medio de una punción directa con el asa de platino desdoblada. MEDIO SÓLIDO INCLINADO Igual que el anterior, sólo que al sacar el asa realizar un estría sobre la superficie inclinada del medio. CALDO Tomar una muestra con el asa de platino, depositar en el tubo con caldo, agitar e incubar por 24-48 hr/37°C. PRÁCTICA DE LABORATORIO 12 Determinación de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos Es una prueba laboratorial para establecer las acciones de ciertos antibióticos sobre una bacteria determinada. Como sabemos la forma de destruir estos microorganismos dentro del animal es a través de la acción de los macrófagos y de otras células fagocitarias. Pero cuando los antígenos sobrepasan las capacidades del organismo provocando infecciones y enfermedades, se recurren a los antibióticos que, son sustancias derivadas de bacterias y hongos saprofitos de acción bactericida o bacteriostática. Es bueno recordar que muy pocos antibióticos actúan únicamente sobre el microorganismo y sus estructuras y, que la gran mayoría a la vez tiene acción dañina sobre las células y tejidos de los animales jóvenes y débiles, por esto es indispensable seleccionar el antimicrobiano más adecuado para eliminar la bacteria responsable de provocar la enfermedad y, esto sólo es posible a través del antibiograma que, no es otra cosa más que enfrentar a la cepa en estudio con un conjunto de antibióticos en un medio apropiado, por medio de las pruebas “in vitro”. De esta forma evitaremos el uso indiscriminado de estas sustancias y nos permitirá en primer lugar, seleccionar un buen antibiótico y en segundo lugar eliminar la presencia de bacterias antibióticos resistentes. METODO DEL DISCO (HENDERSON Y BAUER-KREBY) 1. Aislar la cepa responsable 2. Sembrar la bacteria en un medio sólido (Müeller- Hinton) caja Petri. Para el grupo de las coliformes y Proteus spp, en agar desoxicolato o eosina azul de metileno. 3. Colocar los discos de antibióticos sobre la superficie. Estos se encuentra en diferentes concentraciones, recomendando el uso de las más bajas, simulando los niveles que se pueden encontrar en sangre. 4. Incubar a 37°C./24-48 hrs. y leer inmediatamente. U N I V E R S I D A D 47 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS PRÁCTICA DE LABORATORIO 13 Determinación de la calidad del agua El agua es un importante vehículo transmisor de enfermedades sobre todo de tipo gastrointestinale, por esta razón y para establecer la potabilidad del agua, se realizan análisis físicos, químicos Y microbiológicos. En Medicina Veterinaria otorgamos mayor importancia al análisis microbiológico del agua, por su relación con las patologías que produce. De ahí que esté destinado a conocer el estado sanitario de las muestras de agua, buscando contaminantes fecales, entre los que se encuentran: - Grupo coliformes: E. Coli, Enterobacter aerógenes y Enterobacter cloacae. - Enterococcus S. feacalis - Clostridium perfringens Todos ellos presentes comúnmente en el contenido intestinal de los animales y el hombre. Se prefiere al grupo de los coliformes porque presentan un número mayor, un periodo de vida muy conocido (el cual permite establecer contaminaciones recientes) y su cultivo y aislamiento es muy sencillo. Según la OPS, dependiente de la OMS, para considerarse potable el agua debe reunir las ss. condiciones: a) b) c) No debe presentar mas de 20 coliformes por litro No debe desarrolla más de 200 colonias bacterianas por ml El agua no debe contener bacterias que produzcan pigmentos, que despidan mal olor, ni que destruyan las proteínas. MATERIAL Tubos de ensayo de 30 ml con tapa rosca Tubos Durhang Placas petri Gradillas Pipetas Mechero Matraz Asa de platino Agares: a) MacConkey b) Agar nutritivo c) Gelatina nutritiva d) Caldo lactosado Agua destilada Agua del grifo ANÁLISIS CUALITATIVO 1. Prueba presuntiva: En 5 tubos de 30 ml con tubo invertido de Durhang, colocar 10ml de caldo lactosado y 10 ml de la muestra de agua para analizar. Llevar a la estufa por 24 hr/37°C. 2. Prueba confirmativa: En una placa de agar MacConkey sembrar 0,1 cc de agua, incubar a 37°C./24hr. 3. Prueba complementaria: En un tubo de 30 ml con tubo invertido de Durhang, con caldo lactosado sembrar 0,1 cc del agua. Llevar a la estufa por 24 hr/37°C. ANÁLISIS CUANTITATIVO U N I V E R S I D A D 48 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 4. En dos cajas Petri vacías y estériles, colocar 1ml del agua a estudiar, luego agregar en una placa agar nutritivo y en la otra gelatina nutritiva. Llevar a la estufa por 24 hr/37°C. INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Reunir los resultados de las pruebas y comparar con los estándares aceptados por los organismos especializados, en caso de presentarse las pruebas presuntiva y confirmativa positivas se procede a la complementaria. 1. Prueba presuntiva: Determinación el % de gas en cada tubo, se considera positivo con más de 1/3 del tubo con aire. o 1 tubo con gas en el tubo Durhang = 20 coliformes/l o 2 tubos con gas en el tubo Durhang = 40 coliformes/l o 3 tubos con gas en el tubo Durhang = 80 coliformes/l o 4 tubos con gas en el tubo Durhang = 160 coliformes/l o 5 tubos con gas en el tubo Durhang = mas de 160 coliformes/l Prueba confirmativa: Crecimiento de colonias de color rosado. Prueba complementaria: Presencia de gas, en el tubo de la siembra realizada con bacterias del agar McConkey. 3. Análisis cuantitativo: o Agar nutritivo, recuento de las colonias bacterianas/l y presencia de olor y color en el medio. o Gelatina nutritiva, reconocimiento de áreas con proteólisis. 2. PRÁCTICA DE LABORATORIO 15 Observación microscópica de hongos Los hongos a diferencia de las bacterias tienen muy pocos requerimientos en cuanto a medios de cultivo, pues ello necesitan escasos nutrientes y particularmente requieren condiciones ambientales como ser temperatura y humedad para desarrollase. De ahí que el cultivo del hongo es sencillo, pero la identificación no sólo es larga y difícil, sino que puede convertirse en peligrosa por la liberación de esporas. Éstas pueden ser inhaladas por las personas que trabajan en este proceso. En lugar de utilizar el asa bacteriológica, se utilizan unas pequeñas estiletes de punta más aguda, de un material mas grueso y duro, con las que se realiza un hueco en el medio (tubo con tapa rosca, para evitar la liberación de esporas al ambiente y contaminar al operador) y, dentro de éste se coloca las muestras sospechosas. OBJETIVOS 1. Realizar preparaciones en fresco y en cinta adhesiva de distintas especies de mohos. 2. Observar la morfología de los hongos y distinguir entre hifas septadas y no septadas y entre distintos tipos de esporas y las estructuras que las originan MATERIAL Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos (22x22 mm) muy limpios y desengrasados con alcohol Aguja enmangada o lanceta Trozo enmohecido de fruta o pan o un cultivo de hongos Solución de lactofenol al azul algodón Cinta adhesiva transparente PREPARACIÓN EN FRESCO DE MOHOS TÉCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. Realizar la misma operación en otro portaobjetos que se usará para lavar la muestra. U N I V E R S I D A D 49 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 2. Tomar el material a observar en una mínima cantidad con agujas finas o lancetas procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden ver lo que realmente interesa, los conidióforos. 3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que será ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas tapizadas en su interior por los conidióforos), se aplastarán éstos ligeramente sobre la gota o se seccionarán con un bisturí. 4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no quede amontonado. 5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se formen burbujas entre los dos vidrios. PREPARACIÓN EN CINTA ADHESIVA TÉCNICA 1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solución de lactofenol no demasiado grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparación quede demasiado gruesa. 2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm. 3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona central de una colonia puede haber una excesiva concentración de esporas. 4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos. 5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro. PRÁCTICA DE LABORATORIO 16 Gemación de levaduras MATERIAL Microscopio Portaobjetos Cubreobjetos Levadura Agua azucarada Aguja enmangada Lactofenol-safranina TÉCNICA 1. Disolver con ayuda de una aguja enmangada un poco de levadura sobre un porta que contenga 2 o 3 gotas de agua ligeramente azucarada. 2. Colocar el cubreobjetos y observar al microscopio. Repetir los pasos anteriores mezclando sobre el portaobjetos la suspensión acuosa de la levadura con una gota de lactofenol-safranina. Con este procedimiento se consigue una doble finalidad: 1. Ver mejor las células de las levaduras, teñidas por la safranina. 2. Retrasar un poco el desprendimiento de las células hijas gracias a la acción desfavorable del fenol para la vida normal de las levaduras. 1. o o 2. o o Preparación de colorantes Acido-Alcohol: (decolorante para tinción Ziehl-Neelsen) Ácido clorhídrico concentrado ..................................................................................3 ml Etanol 95% ..............................................................................................................97 ml Albert I: Para observar citopalsma. Azul de toluidina ....................................................................................................0,15 g Verde malaquita ........................................................................................................0,2 g U N I V E R S I D A D 50 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS o o o 3. o o o 4. o o 5. o o o 6. o 7. o o o Alcohol etílico (95%) .................................................................................................2 cc Acido acético glacial ..................................................................................................1 cc Agua destilada ........................................................................................................100 cc Albert II Yodo .............................................................................................................................2 g Yoduro de potasio ........................................................................................................3 g Agua destilada ...........................................................................................................300g Azul de metileno: Colorante de contraste para tinción de flagelos. Azul de metileno...........................................................................................................1 g Agua destilada........................................................................................................100 ml Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. Solución de hidróxido potásico al 1%........................................................................1 ml Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%.....................................................30 ml Agua destilada........................................................................................................100 ml Colorante para esporas: Solución acuosa saturada de verde malaquita Colorante para flagelos de Leifson: Solución A Fucsina básica ..............................................................................................1,2 g Etanol 95%................................................................................................100 ml Solución B Ácido tánico.....................................................................................................3 g Agua destilada...........................................................................................100 ml Solución C Cloruro sódico..............................................................................................1,5 g Agua destilada...........................................................................................100 ml Para preparar la solución de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado herméticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 8. Cristal violeta: Para tinción Gram y tinción simple. o Cristal violeta (violeta de genciana)..........................................................................0,5 g o Agua destilada........................................................................................................100 ml 9. Eosina: Para observación de células sanguíneas. o Eosina........................................................................................................................0,3 g o Ácido acético glacial...........................................................................................0,025 ml o Agua destilada........................................................................................................100 ml 10. Fucsina diluida: Para tinción Gram y tinción simple. o Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen...........................................................................10 ml o Agua destilada .......................................................................................................100 ml 11. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tinción ácido-alcohol resistente. o Fucsina básica...............................................................................................................1 g o Etanol 95%...............................................................................................................10 ml o Fenol 5% en solución acuosa.................................................................................100 ml 12. Hematoxilina: Para observación de células sanguíneas. o Hematoxilina................................................................................................................2 g o Agua destilada...............................................................................................................1 l 13. Lactofenol: Para preparaciones microscópicas en fresco de mohos. o Ácido láctico..........................................................................................................100 ml o Fenol.........................................................................................................................100 g o Glicerol............................................................................................…...................200 ml o Agua.......................................................................................................................100 ml 14. Lactofenol al Azul Algodón: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. o Solución de azul algodón Sol. saturada de azul algodón (azul anilina soluble)...................................10 ml Glicerol........................................................................................................10 ml Agua............................................................................................................80 ml Mezclar esta solución con lactofenol a partes iguales U N I V E R S I D A D 51 D E A Q U I N O B O L I V I A FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS Y PECUARIAS 15. Lugol: Solución de yodo para tinción Gram. o Yodo.............................................................................................................................1 g o Yoduro potásico...........................................................................................................2 g o Agua destilada........................................................................................................300 ml 16. Orceína A: Tinción de cromosomas. o Orceína.........................................................................................................................2 g o Ácido acético.........................................................................................................45,8 ml o Ácido clorhídrico 1 mol/l........................................................................................8,3 ml o Agua......................................................................................................................45,8 ml 17. Orceína B: Tinción de cromosomas. o Orceína.........................................................................................................................2 g o Ácido acético............................................................................................................55 ml o Agua.........................................................................................................................55 ml 18. Safranina: Colorante de contraste para tinción Gram (preferible a la fucsina) y esporas. o Safranina..................................................................................................................0,25 g o Agua destilada........................................................................................................100 ml 19. Solución A: Coloración de cápsula método de Hiss. o Solución alcohólica saturada de fucsina básica ..............................................................1 vol o Agua destilada ...............................................................................................................19 vol 20. Solución B: o Sulfato de cobre ...............................................................................................................20 g o Agua destilada ..............................................................................................................100 cc Disolver al momento de usar. U N I V E R S I D A D 52 D E A Q U I N O B O L I V I A