Capítulo 2d: Análisis y tipificación del VPH

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UICC
HPV and
CERVICAL
CANCER
CURRICULUM
UICC HPV and Cervical Cancer Curriculum
Chapter 2.d. Screening and diagnosis - HPV analysis and typing
Prof. Suzanne Garland, MD; Prof. Sepehr Tabrizi
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01
Capítulo 2.d.
Detección y diagnóstico -- análisis
y tipificación del VPH
Prof. Suzanne Garland MD
Directora de Investigación Microbiólogica, Jefe de
Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas
The Royal Women's Hospital
Melbourne, Australia
Associate Prof. Sepehr Tabrizi
Investigador Principal, Departamento de Microbiología
The Royal Women's Hospital
Melbourne, Australia
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02
Partículas similares al virus
(VLPs)
• Ánalogos no infecciosos de un virus patógeno
• VLP-L1 se ensambla in vitro en cápsides vacías o ‘VLPs’
• La producción de VLP no es estandarizada
- Sistemas de expresión diferentes, métodos de
preparación, métodos de control de calidad
- Formatos de identificación varían (directa e indirecta)
- No hay estándar de oro para establecer el umbral de
resultado positivo
- Pocas comparaciones entre laboratorios
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03
Partículas similares al virus
(VLPs)
• VLPs pueden ser analizadas mediante técnicas de
microscopía electrónica
W
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04
Detección de anticuerpos VPH
• Anticuerpos
- Su presencia representa una infección en el pasado o
presente
- Se puede generar contra las proteínas del VPH
tempranas (early/E) o tardías (late/L)
- Presencia de anticuerpos neutralizantes L1 correlacionan
con protección antiviral iniciada por la vacuna
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05
Detección de anticuerpos VPH
• Se han desarollado diversos métodos de análisis para
detectar anticuerpos en el suero/mucosa:
- Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA):
mide las inmunoglobinas (Ig) en su totalidad, tanto
neutralizantes como no neutralizantes.
- Ensayos de unión competitiva, por ejemplo, el ensayo
competitivo Luminex (cLIA): mide las Ig neutralizantes a
un epítopo solamente, pero todas las diferentes clases de
Ig
- Ensayo pseudovirión: mide el total de Ig neutralizantes,
de todas las subclases
- Western blot
- Radio-inmunoprecipitación
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06
Detección de AND del VPH en el tejido por
microscopio
• Inmunohistoquímica (antígeno especifico de grupo)
• Citología Pap: detecta células precancerosas
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07
Técnicas de detección molecular de ADN
del VPH
Métodos de amplificación
• Amplificación de la señal
- Captura de híbridos/Hybrid Capture (HC2)
• Amplificación del objetivo
- Reacción en cadena de la polimerasa – PCR de ADN
del VPH
- ARNm del VPH
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Análisis Hybrid Capture 2
• Prueba actualmente aprobada por la FDA
- 1995 formato de tubo; 1999 formato micro-placa
• Diseñado para trabajar con una muestra de células
cervicales exfoliadas
• Kit recomendado incluye cepillo y medio de transporte de
la muestra
- Recoge células endo- y exocervicales
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09
Análisis Hybrid Capture 2
• Sensibilidad de 5000 genomes/muestra
• Mezcla de bajo riesgo
- VPH tipo 6, 11, 42, 43, 44
• Mezcla de tipo de alto riesgo
- VPH tipo 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59
and 68
• Los resultados no son específicos del tipo
• No hay control de número de entrada de las células
• Buena comparación entra laboratorios
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Reacción en cadena de polimerasa
• Muy sensible; cerca de 1-10 copias /100,000 células
• Permite realizar pruebas de diferentes tipos de muestras
• Permite el análisis de muestras de archivo con AND de baja
calidad
• Ensayos de consenso: objetivo general: región L1
- Conservado
- Primers varían:
MY09/MY11
SPF1/SPF2
PGMY09/PGMY11
GP5+/GP6+
- Sistemas de detección:
ELISA
dot blot
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Diferentes metodologías de PCR
• Test AMPLICOR ® HPV
• Test LINEAR ARRAY® HPV
• Test genotipo INNO-LiPA ®
- Genotipado de VPH en tejido preparado en parafina
- Las secciones de tejido pueden ser muy viejas y están
sujetas a la degradación del ADN (incluso durante la
extracción)
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Diferentes metodologías de PCR
• Formato de Chip de ADN de VPH
• HPV Microarray
• Citometría de flujo
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Otras metodologías para detectar los tipos de
VPH
• Luminex’s xMAP® Technology
• Norchip - HPV Proofer
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Limitaciones y Desafíos
• Ensayos de diversa gama
• Diferente sensibilidad y especificidad
• Falta de controles fácilmente disponibles, la garantía de
calidad y el control de calidad
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Uso práctio de los métodos de prueba de
ADN del VPH
Clínico
• Tamizaje
• Triage de las pruebas de Papanicolau equívocas
• Sequimiento de displasia post-tratamiento
Epidemiología
• Vigilancia en zonas geográficas
- Prevalencia de VPH
- Prevalencia de genotipo de VPH
Vacuna
• Antes y después de la implementación de un programa de
vacunación
- Estudios de eficacidad de la vacuna
- Diferent regiones del mundo
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Gracias
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