INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
INOCUIDAD ALIMENTARIA
PRÁCTICA 7
DETERMINACIÓN DE Salmonella y Shigella
1. OBJETIVOS
a)
El alumno conocerá la normatividad oficial y la importancia para la
determinación de Salmonella y Shigella.
b)
El alumno conocerá la metodología establecida para determinar la
presencia de Salmonella y Shigella en muestras de alimentos aplicando
la metodología oficial.
c)
El alumno aplicará las técnicas establecidas para el aislamiento y
descripción de Salmonella y Shigella en diferentes medios de cultivo
para alimentos frescos y procesados.
d)
El alumno interpretará los resultados obtenidos para la presencia de
Salmonella y Shigella para determinar la calidad sanitaria de alimentos
según la normatividad oficial.
2. INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Salmonella han sido muy estudiados como patógenos
cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este
microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las
plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del método
analítico utilizado para su detección.
MANUAL DE PRÁCTICAS DE
INOCUIDAD ALIMENTARIA
Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los
métodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su
detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos consideraron dos
aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células
bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que está sujeto (por
ejemplo: tratamiento térmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a
la naturaleza del producto bajo estudio.
Para diversos alimentos existen diferentes protocolos de aislamiento de
Salmonella, todos ellos son esencialmente similares y emplean las etapas de
preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos
selectivos y diferenciales, identificación bioquímica y confirmación serológica.
Shigella es un género bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae,
integrada por gérmenes de forma bacilar, no esporulados, inmóviles, pero
animados de movimiento pendular (oscilación) in situ. Son Gram negativos,
aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos. Fermentan la
glucosa sin producción de gas; no obstante, debido a su similitud con E.coli, se
han encontrado biotipos que producen gas a partir de la glucosa. No
descarboxilan la lisina. No fermentan la lactosa. No utilizan el citrato como única
fuente de carbono. No crecen en el medio cianuro potasico. Su actividad
bioquímica es muy reducida.
El género Shigella se divide en cuatro especies que pertenecen a subgrupos
serológicos distintos:
Cuadro 1. Especies del género Shigella
Subgrupo
Especie
Sh. dysenteriae
A
Sh. flexneri
B
Sh. boydii
kC
Sh. sonnei
D
Existen algunas cepas de E. coli inmóviles y que no fermentan la lactosa que se
confunden con la Shigella. Se pueden diferenciar por las pruebas siguientes:
PRACTICA 7
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MANUAL DE PRÁCTICAS DE
INOCUIDAD ALIMENTARIA
Cuadro 2. Pruebas bioquímicas para la diferenciación entre género
bacteriano
Género
bacteriano
E. coli inmóvil
no
fermentador
lactosa
Shigella
Citrato
Acetato
Malonato
Fermentación
de azúcares
+
+
+
+
-
-
-
Pocos
La Shigella causa diarrea en el hombre, denominada disentería bacilar y, más
recientemente, shigelosis. Las distintas especies de este género son huéspedes
adaptados al hombre y a otros primates. La transmisión de la enfermedad se
produce, normalmente, por contacto de persona a persona y vía fecal oral. Otra
forma muy importante de contagio es por contaminación del agua y los alimentos
con heces humanas de enfermos. Las moscas sirven, a veces, de vehículo en la
transmisión de las Shigella desde heces contaminadas a cualquier tipo de
alimento.
3. INVESTIGACIÓN PRELIMINAR
a)
¿Explique que enfermedad causa la Salmonella
síntomas o cuadro clínico?
b)
¿Por qué se realiza el pre-enriquecimiento en el aislamiento de
Salmonella y Shigella?
c)
¿Qué tratamientos se recomiendan para evitar la presencia de los
géneros Salmonella y Shigella de los alimentos? Explique
d)
¿En qué condiciones ambientales puede proliferar Shigella? Explique
e)
¿Qué alimentos son portadores de Shigella y Por que?
f)
¿Qué pruebas bioquímicas se realizan para identificar a los géneros
Salmonella y Shigella?
PRACTICA 7
y cuáles son sus
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INOCUIDAD ALIMENTARIA
4. MATERIALES Y REACTIVOS
Autoclave u horno a 180°C
Balanza digital
Cuenta colonias
Potenciómetro
Refrigerador
Incubadora a 352°C
Licuadora
4 cajas Petri
1 pipetero metálico
1 cilindro metálico para cajas Petri
4 pipetas de 2 mL
4 pipetas de 10 mL
1 probeta de 250 mL
1 vaso de precipitados de 500 mL
1 espátula
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL
4 frascos de dilución
1 mechero
1 soporte
1 varilla
Benzal
Yodo-ioduro
Reactivo de Kovacs
Solución reguladora de fosfatos pH 4 y 7
Agua destilada
Un matraz con 125 mL de caldo lactosado
Un frasco con 90 mL de caldo tetrationato
1 caja con 20 mL de agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD)
1 caja con 20 mL de agar verde brillante
1 caja con 20 mL de agar sulfito de bismuto
1 caja con 20 mL de agar Salmonella Shigella
1 tubo con 3 mL de LIA
1 tubo son 3 mL de TSI
1 tubo son 3 mL de SIM
1 tubo son 3 mL de MIO
1 tubo son 3 mL de RM
1 tubo son 3 mL de VP
1 tubo son 3 mL de caldo urea
1 tubo son 3 mL de caldo malonato
1 tubo son 3 mL de citrato de Simmons
1 tubo son 3 mL de caldo rojo de fenol y manitol
Muestras de alimentos
PRACTICA 7
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INOCUIDAD ALIMENTARIA
5. DESARROLLO EXPERIMENTAL
5.1.
PRE-ENRIQUECIMIENTO
a) Transferir asépticamente 25 mL o 25 g del alimento a un matraz
conteniendo 125 mL de caldo lactosado y homogeneizar.
b) Incubar 24 horas a 352°C.
5.2.
ENRIQUECIMIENTO
a) Adicionar 0.2 mL de yodo-ioduro a 90 mL de caldo tetrationato y
homogeneizar.
b) Transferir 10 mL de caldo lactosado a 90 mL de caldo tetrationato.
c) Incubar a 352°C durante 24 horas.
5.3.
AISLAMIENTO EN MEDIOS SÓLIDOS.
a) Tomar una asada de caldo tetrationato e inocular por estría cruzada cada
una de las cajas de XLD, agar verde brillante, una caja con 20 ml de agar
verde brillante, agar Salmonella Shigella y agar sulfito de bismuto.
b) Incubar a 352°C durante 24 horas.
c) Observar los medios de cultivo para identificar colonias sospechosas de
Salmonella y Shigella de acuerdo a sus características en cada uno de los
medios de cultivo.
5.4.
IDENTIFICACIÓN CON PRUEBAS BIOQUÍMICAS
a) Seleccionar de 1 a 2 colonias por placa.
b) Con el asa en punta tomar cuidadosamente colonias que se sospecha
son de Salmonella e inocular un tubo con TSI y otro de LIA por picadura y
estría.
c) Incubar a 352°C durante 24 horas.
d) En caso de duda se utilizan SIM o MIO, RM, VP, urea malonato, citrato y
manitol como pruebas bioquímicas confirmatorias.
En el cuadro 3, se presentan las características de Salmonella y Shigella en TSI,
en el cuadro 4 en LIA, y en el cuadro 5 las características para las pruebas
bioquímicas.
PRACTICA 7
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Cuadro 3. Características de Salmonella y Shigella en TSI
Género y especie Agar inclinado Fondo Gas H2S
Salmonella typhy
K
A
+ (-)
Salmonella sp.
K
A
+
+(-)
Shigella
K
A
+(-)
Cuadro 4. Características de Salmonella y Shigella en LIA
Género y especie Agar inclinado Fondo Gas H2S
Salmonella typhy
K
Kb
+ (-)
Salmonella sp.
K
K
+(-)
Shigella
K
A
+(-)
K = alcalino; A =ácido; (-) = reacciones ocasionales; algunos cultivos raros de
Salmonella typhi pueden no descarboxilar la lisina.
Cuadro 5. Resultados de las pruebas bioquímicas
Salmonella typhi Shigella
Prueba o sustrato
SIM (H2S, indol, movilidad)
+,-,+
+,-,Rojo de metilo
Voges Proskauer
Urea
Malonato
Citrato de Simmons
+
Lactosa
Manitol
+
+
6. INFORME DE RESULTADOS
En un cuadro presente los resultados obtenidos de las muestras analizadas
contemplando las especificaciones de acuerdo a la normatividad.
a) Describir la morfología colonial de Salmonella y Shigella en los siguientes
medios:
XLD:
Agar verde brillante:
Agar sulfito de bismuto:
Agar Salmonella Shigella:
PRACTICA 7
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b) Presentar y analizar los datos obtenidos en las pruebas bioquímicas para
Salmonella y Shigella.
c) Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos y los
objetivos de la práctica.
7. BIBLIOGRAFÍA
a) Adams, M.r. y Moss, M.O. 1997 Microbiologia de los alimentos. Acribia , S.A.
Zaragoza, España. Pags. 241-257.
b) Doyle, M.P; Beuchat, L.R. y Montville, T.J. 2001. Microbiología de los
alimentos. Fundamentos y fronteras. Acribia, S.A. Zaragoza, España. Págs.
133-163, 225-237.
c) Fernández, E.E. 2000. Microbiología e inocuidad de los alimentos.
Universidad Autónoma de Querétaro. México. Pags. 261-320.
d) Forsythe, S.J. y Hayes, P.R. 2002. Higiene de los alimentos, microbiología y
HACCP. Acribia, S.A. Zaragoza, España. Págs.
e) ICMSF. 1998. Microorganismos de los alimentos, características de los
patógenos microbianos. Acribia, S.A. Zaragoza, España. Pag. 255-305, 327348.
f) Mac Faddin J. T. 2003. Pruebas Bioquímicas para la identificación de
bacterias de importancia clinica 3ª. Ed. Editorial Médica Panamericana.
Buenos Aires, Argentina.
g) NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimientos para la toma,
manejo y transporte de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.
Secretaría de Salud. México.
h) NOM-114-SSA1-1994. Bienes y servicios. Método para la determinación de
Salmonella en alimentos. Secretaría de Salud. México.
PRACTICA 7
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