identificacion y cuantificacion por LC-MSMS BV2 2016

MASS ESPECTROMETRY
DR. SERGIO ALEMANO
Como procesar el material vegetal?
Identificación y cuantificación de fitohormonas // -UNRC
2
1
Cromatografía3
Separación basada en polaridad
Historia de la
cromatografía líquida
Cromatografía de fase reversa
La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmóvil
apolar y una fase móvil de polaridad moderada.
Una de las fases estacionarias más comunes de este tipo de
cromatografía es la silica tratada con RMe2SiCl, dónde la R es una
cadena alquil tal como C18H37 ó C8H17.
LFV – UNRC – 2013 ®
El tiempo de retención es mayor para las moléculas de naturaleza apolar,
mientras que las moléculas de carácter polar efluyen más
rápidamente.
Identificación y cuantificación I 4
2
Historia de la
cromatografía líquida
Separación basada en polaridad
Los gradientes usualmente comienzan con una fase móvil
predominantemente acuosa y gradualmente avanza a una fase
orgánica.
La fase reversa, separa sobre la base de hidrofobicidad, con
correlaciones con el número de carbones de los compuestos.
CH3
7 Carbonos
H3C
CH3
8 Carbonos
LFV – UNRC – 2013 ®
6 Carbonos
Fuente: Chem 7116 Quantitation Module Lecture 2
Techniques & Equipment for Small Molecule Quantitation
Identificación y cuantificación I 5
Sensibilidad HPLC
Partículas pequeñas, incrementan la
sensibilidad y reduce tiempos de la
corrida. Estándar: 5 µm, pero < 3 µm,
mejor.
SAME INJECTION VOLUME
Diámetro de la columna:
LFV – UNRC – 201 ®
Capilar
1mm ID column
2mm ID column
4.6mm ID column
Fuente: Chem 7116 Quantitation Module Lecture 2
Techniques & Equipment for Small Molecule Quantitation
Identificación y cuantificación I 6
3
LFV – UNRC – 2013 ®
http://www.waters.com/WatersDivision/ContentD.asp?watersit=JDRS-6UXGYA
Identificación y cuantificación I 7
Como detectar hormonas vegetales?
Identificación y cuantificación hormonas // LFV-UNRC8
4
Detector de absorbancia (UV-Visible)
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
DETECTORES HPLC
10
5
11
La Espectrometría de Masas es una poderosa técnica micro-analítica
usada para:
•
Identificar compuestos desconocidos.
•
Cuantificar compuestos conocidos
•
Elucidar la estructura y propiedades químicas
de moléculas.
Para compuestos no volátiles, iones de la molécula intacta son producidos al
pasar la solución por un campo eléctrico (electrospray ionization) o por
bombardeo de partículas (fast atom bombardment) (Villa, 2003).
12
6
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
How does a mass spectrometer work?
Fuente de
Ionización
ESI, API.
Cuadripolos
Ionización
Separación
de iones
Placa de
coalición
Detección
de iones
13
Consideraciones
Espectrometría de Masas
MS/MS
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
La finalidad de la ionización es que la muestra M pierda un
electrón, generando así un ion radical M+. (porque ahora tiene
un electrón desapareado) ó gane uno M-.
Como los iones son inestables y muy reactivos se deben
manipular en alto vacío
Al detector llegarán todos los iones, tanto el M+. Como
los fragmentos de éste.
El detector registra todos los iones según su relación m/z
(relación masa/carga) y los cuantifica según su abundancia
relativa. (como generalmente se forman iones con una sola
carga m/z se trata simplemente de la masa del ion).
Pico base: ion mas abundante del espectro (100 %
abundancia relativa)
14
7
IONIZACIÓN
APCI:
API-Electrospray:
Carbamatos
Herbicidas: Fenilurea
Pesticidas
Triglicéridos
Aditivos en pláticos
Explosivos
Micotoxinas
Fármacos
Antioxidantes
Azúcares
Ácido Succínico
Compuestos Fenólicos
Sulfonilureas
Hidratos de Carbono
LSD
Benzodiazepinas
Morfinas
Pesticidas
Pigmentos
Micotoxinas
Péptidos y proteínas
Fármacos
Salbutamol
Penicilina
Aminas Aromáticas / Cuaternarias
Antidepresivos
Esteroides y corticoesteroides
Antocianinas
Iones
15
Ejemplos de Aplicación
José Rodríguez
Servicio Instrumentación Científica (SUIC).
Universidad de Murcia
Fuente de
Ionización
ESI, API.
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
Ionización
Ionización
16
8
Ionización
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
Electrospray (ESI): es una muy fina pulverización, donde se generá un campo
magnético, y se utiliza en aquellas moléculas que tienen polaridad, y se debe
tener en cuenta que el solvente ya es polar.
“Electrospray ionization” (ESI) y que llevó a John B. Fenn a compartir con el Ing.
Tanaka el Premio Nobel de Química 2002. Se trata del método de
volatilización / ionización de analitos más suave que se conoce a tal punto, que
se ha demostrado que material viral sometido a este método de ioniza-ción
mantiene intacta su actividad, Erra-Balsells, 2004.
17
Espectrometría de Masas LC- MS / MS 18
9
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
How does a mass spectrometer work?
Fuente de
Ionización
ESI, API.
Ionización
Cuadripolos
Separación
de iones
Placa de
coalición
Detección
de iones
19
Espectrometría de Masas
GC- MS / MS
Analizadores

Cuadrupolos

Trampa de iones

Tiempo de vuelo
10
Espectrometría de Masas
MS/MS
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
A principios de los 50´s, los patrones de fragmentación de los iones
comenzaron a ser entendidos, aunque los aparatos disponibles
estaban limitados en el rango de masas.
Otro tipo de instrumento desarrollado para el propósito de acoplar el
espectrómetro de masas a un cromatógrafo de gases fue el filtro de
masas cuadrupolo, el cual usa un campo eléctrico cuadrupolar
conteniendo componentes de radiofrecuencia y corriente directa para
separar iones. En 1953 el analizador de masas cuadrupolo fue
patentado por Wolfgang Paul de la Universidad de Bonn.
En 1956 las primeras
muestras biológicas
(esteroides) fueron
exitosamente analizadas.
21
22
Espectrometría de Masas LC- MS / MS
11
How does a mass spectrometer work?
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
Fuente de
Ionización
ESI, API.
Cuadripolos
Separación
de iones
Ionización
Placa de
coalición
Detección
de iones
23
Detector
Placa de
coalición
Detección
de iones
Identificación y cuantificación de fitohormonas / / LFV-UNRC
primary ion
- 1000V
+
ee-
L
e- e
- 100V
D
L >> D
24
12
25
Espectrometría de Masas LC- MS / MS
Cuales son las variables a tener en
cuenta en un LC-MS/MS?
26
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
13
27
Cuales son las formas de identificar
y cuantificar compuestos en un LCMS/MS?
28
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
14
Mass analyzers separate ions based on their
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
mass-to-charge ratio (m/z)
Daughter: Selecciona una masa en el primer cuadripolo, y luego realiza un
scan en el segundo con el fin de determinar fragmentos provenientes de
esta masa luego de pasar por la zona de colisión
del LC-MS-MS
29
Pico
Base
Ion
Molecular
Fragmentos ?
30
15
Mass analyzers separate ions based on their
mass-to-charge ratio (m/z)
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Multiple reaction monitoring (MRM)
Daughters of ABA
263 m/z
111 m/z
153 m/z
263 m/z
31
MASS SPECTROMETRY
ABA DAUGHTERS
The Plant Journal
Volume 35, Issue 3, pages 405-417, 8 JUL 2003 DOI: 10.1046/j.1365-313X.2003.01800.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.2003.01800.x/full#f1
16
Multiple reaction monitoring (MRM)
33
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
17
Como realizar una curva de
calibración en un LC-MS/MS?
35
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Cuantificación
Fuente:
36
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
18
Cuantificación
Además, cuando se utiliza una técnica de purificación previa al cromatógrafo asumo que el
rendimiento de este proceso es exacto.
Fuente:
37
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Cuantificación
Ventajas:
- Se independiza de la precisión del volumen de inyección, principalmente para HPLC ó GC
que no poseen inyección automatizada.
- Se independiza de la repetitividad del proceso de purificación.
38
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
19
Cuantificación
O
Estandarés, deuterados,
carbonados, etc., de
Jasmonatos
C OO CD 3
O PD A -M e
D
O
D
D
D
D
CO OH
O
D
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
O
OCCD3
D
O
O
OPD A
COOH
OH
12-OH-JA
COOH
D
D
D
O
D
COOH
D
O
OCCD 3
O
D3CCO
O P C -8
O
COOH
CAs
4 isomers
COOH
11-OH-JA
COOH
D
O P C -8
D
O
D
COOH
O
D
JA
D
COOH
OCCH3
D
D
OAc--Ketol
O
COOH
O
O
OSO2OH
OSO2OH
CO OH
D
D
O
D
D
O
D
D
D
D
COOH
COOCD3
12-HSO4-JA
O
D
D
CO OC D3
JA - M e
39
Fuente: Dr. Otto Miersch. Leibniz-IBP, Halle. Germany
Cuantificación
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Estandarés, deuterados,
carbonados, etc., de
Jasmonatos
Fuente:
40
20
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Cuantificación
41
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Cuantificación
Administrator: Fill out blue racks or letters
LC-MS/MS
Compound: JA
Standard: (D6)JA
209 > 59
215 > 59
Calculation for:
MW:
Mixtures:
a=
b=
1,6766
-0,0627
Area
(D6)JA
JA
1 Area standard
1 Area standard
Weigth
10
200
Compound: JA
6,3 ng/sample
30,2 pmol / sample
Compound: JA
31,7 ng / g
150,9 pmol / g
ng Compound / Area Compound /
Area Standard
Area standard
0
0,03
0,3
0,50
0,6
1,01
1
1,59
2
3,41
3
5,14
5
7,63
7,5
12,30
10
17,13
Area
JA
539
10149
21869
36825
78642
124164
188549
306272
417775
Area
(D6)JA
20614
20443
21580
23160
23072
24173
24721
24909
24382
Compound - Standard
y = 1,6766x - 0,0627
Area Compound / Area Standard)
18,00
16,00
14,00
12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
0,00
-2,00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
ng Compound / ng Standard
Identificación y cuantificación hormonas / LFV-UNRC
Standard [ng]
Sample [mg]
210
JA
y = 1,6766x - 0,0627
( y = ax + b )
42
21