GUIA LABORARORIO MICROBIOGÍA Titulo del Laboratorio: Tinción
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GUIA LABORARORIO MICROBIOGÍA Titulo del Laboratorio: Tinción de Gram ,técnicas de siembra Nombre de la carrera: Medicina Nivel del curso: VI Nivel Nombre de los docentes responsables: TM María Ester Aliaga López TM Lina Castillo Catalán Fecha de ejecución: 14-15 abril 2011 1.- Objetivo del laboratorio 2.- Introducción 3.- Desarrollo de la actividad 4.- Tipo de evaluación_ 4.1.- Quíz de entrada: Objetivo: El alumno este informado de la teoría para realizar la actividad. 4.2.- Informe de la actividad realizada a entregar en el laboratorio siguiente Objetivo: Evaluar aprendizaje del laboratorio realizado 1.- Objetivo del laboratorio: 1.1.-El alumno debe aprender los fundamentos de la coloración de Gram y su aplicación. 1.2.-Debe manejar diferentes técnicas de siembra, para lograr aislamiento de los microorganismos. 2.- Introducción: Fundamento de la tinción de Gram. *Clasificación de bacterias según el tipo de pared celular: -Gram positivas -Gram negativas -Acido-Alcohol resistentes -Otras (ej: arqueobacterias) -Sin pared (Micoplasmas: parásitos intracelulares) *Componentes de la pared celular: . Peptidoglicanos . Proteínas . Polisacáridos . Lipopolisacaridos(solo en bacterias Gram negativas) . Ac. Teicoicos y ác. Lipoteicoicos (solo en bacterias Gram positivas) Sin embrago los componentes tipicos de la pared celular son los peptidoglicanos, los lipopolisacaridos y los ác. Teicoicos y ác. Lipoteicoicos. *-Gram positivas Pared celular formada casi exclusivamente por unidades repetidas compuestas de peptidoglicanos y atravesada por ác teicoicos y lipoteicoicos. Al teñirlas con la tinción de Gram se tiñen de azul *-Gram negativas Pared celular mas compleja, formada por una capa fina de peptidoglicanos sobre la membrana citoplasmática que esta situada en un espacio virtual que es el Espacio Periplasma(#), y sobre este espacio existe una especie de segunda membrana plasmática que es la Membrana Externa* de la pared celular bacteriana, la cual es exclusiva de las bacterias Gram negativas. Al hacer la tinción de Gram adquieren un color rojo Las bacterias se agrupan en base a su tinción por la técnica de Gram. – Gram positivos - Pared celular con grueso peptidoglicano que retiene un colorante específico. No tienen membrana externa. – Gram negativos - pared celular compleja, con membrana externa y un espacio entre membrana interna y externa -el periplasma- que contiene el saco de mureína y abundantes enzimas. El peptidoglicano es fino, por lo que no retienen el colorante. Con esta tinción, las Gram positivas aparecen en color púrpura, mientras que las Gram negativas presentan color rojo Cocacea Gram +(Estafilococcus) Bacilo Gram (-) E. coli Tecnicas de siembra *Introduccion: Un microorganismo se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van, desde azúcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo sólido donde las células que se multiplican no cambian de localización; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisión binaria una colonia macroscópica compuesta por decenas de millones de células similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecerá como cultivo puro de un solo tipo de bacteria. La principal diferencia entre un medio de cultivo sólido y uno líquido es que el medio de cultivo sólido contiene un 1,5-2% de agar-agar, mientras que el medio líquido no contiene agar-agar. Caracteristicas y requerimientos de los Microorganimos Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfológicamente que es imposible diferenciarlas sólo con el uso del microscopio. En este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en medios de cultivo especiales. Así, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayoría de las especies bacterianas, pero no la del tipo que se desea averiguar si está presente. Otras veces, el medio de cultivo contiene determinados azúcares especiales que sólo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se añaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos ácidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentación, generan gases que pueden ser detectados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado. Con otros medios de cultivo se puede identificar si las bacterias producen determinadas enzimas que digieren los nutrientes. Así, algunas bacterias con enzimas hemolíticas (capaces de romper los glóbulos rojos) producen hemólisis y cambios apreciables macroscópicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y técnicas de cultivo son esenciales en un laboratorio de microbiología de un hospital, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibióticos a los que son sensibles esas bacterias. Los cultivos suelen usarse en medicina para determinar la presencia de agentes patógenos en fluidos corporales (como por ejemplo la sangre o la orina). Condiciones requeridas de lo medios de cultivo Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de ellos sean confiables, deben cumplir con los siguientes requisitos: Disponibilidad de nutrientes. Consistencia adecuada del medio. Presencia o ausencia de oxígeno y otros gases. Condiciones adecuadas de humedad. Luz ambiental. pH adecuado. Temperatura. Esterilidad. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en: a) Su consistencia: Sólidos, líquidos y semisólidos b)Su utilización: Comunes (A. Nutritivo),Enriquecimiento (Thayer Martin),Selectivo (Salmonella-shiguella),Diferenciales (Mac Conckey), Identificación (Citrato simons),Multiplicación (infusión cerebro corazón), Coservacion (A.cepa), Transporte (Stuart) c) Su composición: Medios complejos, Medios sintéticos, Medios semisintéticos d) Su origen: Naturales, sintéticos y semisintéticos. 3.- Desarrollo de la actividad: PROCEDIMIENTO TINCIONDE GRAM Procedimiento 1.-Cubrir el portaobjetos con una delgada capa de Cristal- Violeta por espacio de 1 minuto. Lave enseguida con agua, inclinando el portaobjetos para evitar el desprendimiento del frotis. 2.- Aplicar Lugol y déjelo por 1 minuto, lave con agua. 3.- Agregue Alcohol-Acetona por espacio de 15 a 30 segundos gota a gota, con el portaobjetos inclinado. Tan pronto como ya no arrastre color lave con agua. 4.- Finalmente cubrir el portaobjetos con una delgada capa de Safranina por espacio de 30 segundos. Lave con agua. 5.- Dejar secar el frotis teñido y observe al microscopio óptico con los objetivos de 100x. con aceite de inmersión Técnicas de Inoculación (siembra) Las técnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varían, dependiendo del objetivo. Esterilización del Asa Bacteriológica Las asas bacteriológicas básicamente son alambres unidos a un mango que permite manipularlas. El alambre puede ser de diferente material, (fierro níquel, nicromo, platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,) dependiendo de la necesidad. Para su esterilización se utiliza calor seco (llama), y se procede así: - Prender el mechero - Tomar el asa bacteriológica por el mango y colocarla en posición vertical, sobre la llama del mechero, hasta que el alambre quede al rojo vivo. - Dejar enfriar o enfriar dentro del medio de cultivo, antes de tomar las colonias. Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo 1. Siembra en Medio Líquido (Caldo) - Obtener la muestra con asa bacteriológica o torula - Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotación. 2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta) - Obtener la muestra con asa - Hacer estrías en la superficie del medio 3. Siembra en Agar semisólido (Mio) - Obtener la muestra con asa recta - Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio Medios en Placa de Petrí Siembra por agotamiento: El objetivo de esta técnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificación y sensibilidad a los antimicrobianos. 1. Obtener la muestra con torula o asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar, haciendo estrías (líneas) de un extremo a otro (primer cuadrante) 2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante primero y extenderlas hasta el cuadrante dos 3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante dos y extenderlas hasta el cuadrante tres 4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro. Siembra en cuadrícula: El objetivo de esta técnica es hacer recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) 1. Obtener la muestra con asa calibrada que dispense una cantidad exacta y distribuirla con el asa en línea recta por todo el centro 2. Hacer estrías de extremo a extremo en sentido contrario a la línea de inóculo Diferencia entre “aislar” y “extender Técnica de siembra para aislamiento (G modificada) Inoculación en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo 1. Siembra en Medio Líquido (Caldo) - Obtener la muestra con asa bacteriológica o escobillón - Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotación 2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta) - Obtener la muestra con asa - Hacer estrías en la superficie del medio 3. Siembra en Agar semisólido (taco) - Obtener la muestra con asa recta - Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio Medios en Placa de Petrí: Siembra por agotamiento: El objetivo de esta técnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificación y sensibilidad a los antimicrobianos. 1 Obtener la muestra con torula o asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar, haciendo estrías (líneas) de un extremo a otro (primer cuadrante) 2 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciarestrías desde el cuadrante primero y extenderlas hasta el cuadrante dos. 3 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante dos y extenderlas hasta el cuadrante tres. 4 Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estrías desde el cuadrante tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro. Técnica G modificada Procedimiento 1. Conocer, ordenar y describir cada uno de los medios de cultivo que va a sembrar 2. Marcar en la base (nunca en la tapa) adecuadamente cada uno de los medios. La etiqueta debe contener: Nombre del paciente Registro de laboratorio, que debe incluir la fecha y consecutivo del Laboratorio Tipo de muestra : Juan Perez F. Faringeo 425 14/ 4/11 3. Siembra en Caldo de cultivo 3.1. Coger con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa , 3.2 Coger el asa con la mano derecha y esterilizarla 3.3 Retirar la tapa (o algodón) del tubo con el dedo meñique de la mano derecha y mantenerla ahí (no colocar sobre el mesón, para evitar contaminación) 3.4. Flamear la boca del tubo 3.5. Introducir el asa estéril y tomar una asada 3.6. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar la tapa (o algodón) 3.7. Coger el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el meñique de la derecha retirar la tapa, flamear la boca del tubo 3.8. Introducir el asa en el caldo y dar movimientos de rotación 3.9. Retirar el asa, flamear y tapar el tubo 3.10. Esterilizar el asa 4. Siembra en Agar Inclinado: Seguir los mismos pasos descritos en siembra en caldo de cultivo, pero al sembrar hacer estrías sobre la superficie del agar 5. Siembra en Agar semisólido: Seguir los mismos pasos descritos en siembra en caldo de cultivo pero al sembrar, utilizar el asa recta e inocular en línea recta por el centro y hasta la mitad del agar. 6. Siembra en Agar, en Placas de Petrí: Sembrar por “agotamiento” -Tomar la base de la caja por los bordes, con el índice y pulgar de la mano izquierda y voltear la mano para que la superficie del agar quede hacia arriba -Descargar el inóculo en el primer cuadrante haciendo estrías de lado a lado, como lo indica la figura (ver arriba, siembra por agotamiento); flamear el asa y enfriarla en un extremo del agar - Girar la caja e iniciar las estrías partiendo del primer cuadrante, flamear el asa, y enfriarla en el extremo del agar - Girar nuevamente la caja y repetir una vez más el mismo procedimiento. Parte 2 : Incubación Colocar las placas en estufa de cultivo a 36 ± 1 º C por 24 hrs. Aerobios directamente a la estufa - Microaerófilos en jarra con CO2 - Anaerobio en Jarra de anaerobiosis Colocar tubos con medios líquidos, semisólidas, en gradillas. Observacion El informe de Laboratorio debe entregarse en la actividad de la semana siguiente, en el formato entregado. La no entrega significa un punto menos, de la nota obtenida.
