estudio de la diversidad genetica mediante analisis de marcadores

ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENETICA MEDIANTE ANALISIS DE MARCADORES
GENETICOS MOLECULARES EN RAZAS CUNICOLAS DE GRANJAS PRODUCTORAS EN
EL ESTADO DE MEXICO.
INTRODUCCION
La cunicultura en el Estado de México. Datos del Instituto Nacional de
Geografía e Informática (INEGI) de 1986, refieren que el Estado de México es
considerado desde 1980 como el primer productor de conejos a nivel nacional,
el mayor dinamismo se encuentra en los municipios conurbanos con el Distrito
Federal,
como
Texcoco,
Ecatepec,
Cuautitlán,
Cd.
Nezahualcoyotl,
Chimalhuacan, Chalco e Ixtapaluca; en los municipios del norte del Estado,
como Atlacomulco, El Oro, Temascalcingo, Jocotitlan e Ixtlahuaca, y en los
denominados corredores gastronómicos como la Marquesa y Tenancingo
(Mendoza et al., 2001b). Actualmente se cuenta con un censo 45,000 hembras
de vientre distribuidas en los 56 Municipio Mexiquenses en manos de 1,000
unidades de producción (Datos no publicados del Comité Sistema Producto
cunicola y SAGARPA, 2010). Las razas que predominan razas cárnicas como
la Nueva Zelanda California y Chinchilla principalmente.
El 23.2% de las UP. crían la raza Nueva Zelanda, el 18.2 % tienen conejos
criollos o nativos, el 9.1% crían la raza California, 3.3 % crían Gigante de
Flandes, el 1.7% Chinchilla, 1.5% crían raza Mariposa, .8% conejos de la raza
Rex, el .6 % crían raza Azteca Negro, también se encontró un 28.7% para el
caso de las UP que reportaron tener al menos dos razas diferentes en su
explotación y por último el 6.2% al momento, desconocían la raza de sus
conejos.
El nivel de producción de conejos encontrado en el Estado de México, se
resume en un 66.7% de traspatio, familiar o de pequeña escala, el 26.9% es
semitecnificado o comercial y existe un 2.3% de granjas tecnificadas o
industriales;
El desarrollo de la producción animal se basa en obtener núcleos de animales
con potenciales genéticos. El conocimiento de las relaciones genéticas que se
tiene entre los distintos animales que forman estos núcleos es de suma
importancia, debido a que permite establecer los programas de cruzas que se
deben realizar para obtener un determinado potencial genético en base al
numero de alelos que se identifiquen en genes que estén asociados a una
determinada característica de producción.
Recientemente se han desarrollado un numero de marcadores moleculares
para el estudio de relaciones de parentesco, entre estos marcadores están el
DNA mitocondrial (DNA mt, los microsatélites y los polimorfismos de un solo
nucleótido)
En la cunicultura de nuestro país esta tecnología aun no se utiliza; por lo que
es necesario desarrollar y estandarizar un sistema que facilite a los productores
la toma de decisiones para implementar mejores programas de reproducción y
a la vez permita una mejor identificación genética de las poblaciones cunicolas
para una mejor organización y conocimiento del germoplasma
y de esta
manera establecer líneas de animales apropiados para la producción.
ANTECEDENTES
La cunícultura en México está dividida en función de su producción, el 90 % se
encuentra en el sistema familiar o de autoconsumo, son explotaciones de 30
hembras o menos, en el cual no se obtiene una producción constante y el
producto que obtiene de su explotación esta destinada principalmente al
consumo familiar, el 10 % restante se encuentra en sistemas semitecnificados
las cuales tienen más de 50 hembras en producción, su objetivo es con una
visión empresarial y con la cual rentabilizan una empresa, en la cual se
emplean metodologías que permiten eficientizar y maximizar la productividad.
(Demeterova et al., 1989). Refieren que en los países en desarrollo la mayor
parte de los conejos se producen en sistemas en pequeña escala o familiares.
En el estado de México, Mendoza (2000) refiere una clasificación de los
sistemas de producción cunícola generalmente aceptada de acuerdo al número
de hembras de vientre que se tienen en las granjas.
Producción comercial o de mediana escala: el número de hembras de vientre
que se mantiene en inventario va de 31 a 300 hembras, estas UP exigen el
trabajo de tiempo parcial hasta de tiempo completo de una persona y el apoyo
de uno o dos ayudantes. Producción industrial o de gran escala: el inventario
es de 301 o más hembras de vientre, el trabajo lo realiza personal profesional
en la cunicultura.
Variabilidad genética.
La variabilidad genética puede entenderse como cualquier cambio espontáneo
que se produzca en la secuencia nucleotídica de un organismo. Dichos
cambios se denominan mutaciones y pueden ser puntuales, si se produce la
sustitución de un único nucleótido (SNP), o bien regionales, si la sustitución es
de varios nucleótidos (STR, VNTR, LINE, SINE, ALU). Para estudiar la
variabilidad genética, una de las técnicas más utilizadas han sido los
marcadores genéticos.
Los marcadores genéticos deben satisfacer varias condiciones para ser de
mayor utilidad, deben estar ampliamente distribuidos a lo largo del genoma,
tienen que ser altamente polimórficos, su análisis debe ser rápido, fácil, seguro
y el método de análisis del marcador tiene que poder repetirse con fiabilidad en
otros laboratorios (Cheng y Crittenden, 1994).
Los marcadores moleculares (Driscoll et al 2002) son biomoléculas que se
pueden relacionar con un rasgo genético. Las biomoléculas que pueden ser
marcadores moleculares son las proteínas (antígenos e isoenzimas) y el DNA
(genes conocidos o fragmentos de secuencia y función desconocida). Cuando
varios marcadores moleculares se asocian inequívocamente con un rasgo
genético, se dice que forman un QTL (loci de rasgos cuantitativos o
cuantificables). Un marcador molecular monomórfico es invariable en todos los
organismos estudiados, pero cuando presenta diferencias en el peso
molecular, actividad enzimática, estructura, o sitios de restricción, se dice que
es polimórfico. A veces el grado de variación es tal que se denominan
hipervariable. Algunos marcadores moleculares utilizados en estudios de
paternidad o diferenciación de poblaciones o individuos son;
a) RFLP (Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos de restricción).
Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección
de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la
misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos
más fáciles de analizar son los derivados de la digestión del genoma de
las
mitocondrias
o
los
cloroplastos,
puesto
que
delecciones,
sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón
de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde
migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas
de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de
bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas
para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern
Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a
genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA
preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP
evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy
preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución
física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se
hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de
sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina
PCR-RFLP (Driscoll et al 2002).
b)
MAAP
(Múltiples
perfiles
arbitrarios
de
amplificación)
Término genérico acuñado en 1994 con el que se designan las técnicas
que emplean oligonucleótidos arbitrarios para generar huellas dactilares
complejas. Entre estas técnicas cabe destacar:
RAPD (DNA polimórfico amplificado al azar): Es una de las
técnicas más versátiles desde que se desarrolló en el año 1990.
Se usa una colección de decanucleótidos para amplificar por PCR
áreas específicas distribuidas al azar por el genoma. Su pequeñez
y la baja temperatura de alineamiento (36°C) aseguran que se
unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir
amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se
pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles
electroforéticos que variarán según el polimorfismo de los distintos
individuos o grupos de individuos, y proporcionarán una huella
dactilar característica. Es muy cómoda, rápida, requiere poco
DNA que además no necesita estar muy puro, no presupone
conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir
rápida
y
simultáneamente
muchos
organismos.
Sus
inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen
corresponder a DNA ligado a algún carácter, sino redundante, y
que no da información sobre el número de copias que el DNA
genómico contiene de la secuencia amplificada.
AP-PCR (PCR con oligonucleótidos arbitrarios): La idea es
similar a la RAPD, desarrollándose a la vez que ésta, aunque se
cambia el diseño de los oligonucleótidos y el tipo de PCR. Los
oligonucleótidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR
consta dos de ciclos de baja astringencia (poco específicos) que
permite
la
polimerización
de
una
batería
de
fragmentos
característicos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos
de alta astringencia para amplificar (visualizar) específicamente
las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden
migrar en un gel de agarosa para observar las grandes diferencias
entre especies, o bien se puede marcar radiactivamente y migrar
en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho más finos
y precisos. Existe una variación denominada DAF (Huellas
dactilares por amplificación de DNA) que utiliza oligonucleótidos
de 5 a 15 bases, pero las huellas.
proporcionadas suelen
ser muy
complejas
y difíciles de
interpretar.
AFLP
(Polimorfismo
de
la
longitud
de
los
fragmentos
amplificados): Esta técnica se desarrolló en 1995 y combina el
uso de enzimas de restricción y oligonucleótidos para PCR, de
manera que se obtienen marcadores moleculares muy específicos
sin necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA
se corta con dos enzimas de restricción, una de corte muy
frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les
ligan oligonucleótidos de extremos compatibles con las enzimas
usadas.y
se
amplifica
por
PCR.
Jugando
con
la
complementariedad del oligonucleótido con el sitio de restricción
se puede disminuir o aumentar el número de bandas amplificadas.
Una ventaja especial de esta técnica es que es capaz de generar
muchos marcadores moleculares en una sola reacción. Por eso el
resultado debe resolverse en un gel de poliacrilamida de alta
resolución, puesto que no se resolverían en agarosa.
STS (Sitios etiquetados por la secuencia) o SSLP (Polimorfismo de longitud en
las secuencias discretas) Desarrollada a partir de 1989, aprovecha las
secuencias conocidas, únicas dentro del genoma, para amplificarlas por PCR.
El polimorfismo se suele encontrar fácilmente cuando lo que se amplifican son
intrones en lugar de exones. La ventaja principal es la velocidad con la que se
pueden realizar los análisis una vez que las parejas de oligonucleótidos se han
establecido claramente. Por tanto se combinan la rapidez de la RAPD con la
especificidad de la
Microsatelites (Short Tandem Repeats STR)
Los microsatellites son secuencias cortas de AND que están formadas por
repeticiones en tándem de una a seis pares de bases (Goldstein y Schlötterer,
1999). Debido a que son altamente polimórficos, codominantes, tienen heencia
mendeliana simple, se encuentran amplia y uniformemente distribuidos a lo
largo del genoma de los seres vivios, su análisis se basa en la PCR (Cheng y
Crittenden, 1994, Doggson et al., 1997, Goldstein y Schlötterer, 1999, Becerra
y Paredes, 2000). Generalmente se localizan en regiones no codificantes del
genoma y los más frecuentes son las repeticiones de los dinucleótidos AC y TG
(Beckman y Weber, 1992).
Los microsatelites tienen varias aplicaciones, ya que permiten estimar los
niveles de variabilidad genética existentes entre las poblaciones, asi como
analizar las relaciones genéticas existentes entre las mismas (ArangurenMendez, 2002), permitiéndonos inferir estimaciones de la diversidad genética y
de la consanguinidad. También son útiles para realizar identificación individual
y pruebas de paternidad, asumiendo que cada individuo tiene dos alelos por
locus, proveniente uno de la madre y otro del padre, los microsatelites deben
ser polimórficos y se debe tener en cuenta que segregan independientemente,
de tal manera que para la identificación individual podemos caracterizar a cada
individuo, ya que es muy poco probable que dos individuos seleccionados
aleatoriamente compartan los mismos alelos para los microsatélites elegidos.
Por otro lado, los microsatelites también pueden utilizarse para la elaboración
de mapas de ligamiento, que pueden ser de gran utilidad en la identificación de
genes responsables de caracteres de interés (Cheng et al., 1995).
En cunicultura el empleo de este tipo de marcadores es poco utilizado. Arruga
et al., 2004 reportan haber utilizado RFLPs para analizar relaciones genéticas
en una explotación de conejos. Sus resultados ayudaron a identificar que los
machos y las hembras utilizados como pie de cría no tenían parentesco,
probando con esto que la metodología de los marcadores moleculares permite
llevar un mejor control de cruzas para la mejora genética de los animales en
aquellas explotaciones donde no existen datos poblacionales o de pedigrí.
PROBLEMÁTICA
El consumo per cápita de carne de conejo en México es de aproximadamente
150 gramos, sin embargo se tiene una demanda potencial de 14 mil toneladas
de carne de conejo por año y solamente se producen 4 toneladas anuales, por
lo que el desarrollo de esta especie es importante (Mendoza, 2006 a). Ya que
actualmente la cunicultura en nuestro país se basa en explotaciones en
sistemas en pequeña escala o familiares. Para impulsar la producción de
conejo es necesario tener buenos programas de reproducción y producción y
para esto se debe contar con líneas de animales mejorados los cuales tengan
parámetros productivos apropiados para los tipos de explotación que se
requiere; es por eso que es necesario el conocimiento de las condiciones
genómicas de los animales .
JUSTIFICACION
La cunicultura en México esta en fase de desarrollo. Actualmente no se cuenta
con sistemas tecnificados para la producción, tampoco se cuenta con líneas
comerciales de animales mejorados genéticamente, ni con un programa de
vigilancia genética que permita ir mejorando las razas que actualmente se
emplean en las explotaciones. Normalmente los programas de mejoramiento
genético son caros y consumen tiempo debido a
las pruebas de
comportamiento que se tienen que realizar en al menos tres generaciones. Con
el advenimiento de la biología molecular y la utilización de marcadores
moleculares asociados a rasgos de producción el tiempo y costo de la
caracterización
genética
de
las
poblaciones
animales
ha
disminuido
considerablemente. Lo que ha permitido en otras especies de animales un
avance muy rápido en obtener líneas de animales mejorados.
Este trabajo se enfocara en el conocimiento del genoma de los animales
utilizados en explotaciones del estado de México; para poder obtener
marcadores moleculares que permitan elaborar programas de mejoramiento
genético apropiados para la producción que se requiere en las granjas del
estado.
MATERIAL Y METODOS.
Se seleccionaran aquellas granjas ubicadas en el estado de México que
cumplan con el requisito de contar al menos con un núcleo de producción de 20
hembras y dos machos y que este núcleo sea dedicado a la reproducción para
obtener los animales tanto de pie de cría como para producción. Un total de 20
granjas serán seleccionadas para realizar un análisis de relaciones genéticas
entre los animales del núcleo y entre los núcleos de diferentes granjas. De esta
manera se obtendrá un panorama del grado de endogamia que existe entre los
núcleos de animales dedicados a la reproducción cunícula.
Para la tipificación genética de cada conejo se utilizará como marcador
molecular DNA mitocondrial. Este será obtenido mediante purificación a partir
de una muestra de sangre (0.5 ml) obtenida por venopunción de la oreja.
Purificación del DNA mt.
La sangre se procesara empleando el kit comercial
Genomic DNA Purification Kit (Fermentas International INC, Canadá) siguiendo
las instrucciones del fabricante.
Las concentraciones del DNA obtenido se
determinaran mediante espectrofotometría utilizando el equipo NanoDrop TM
1000 (Thermo Scientific, Estados Unidos).
Se utilizarán un par de iniciadores que permitan amplificar por PCR una region
del D-Loop del DNA mitocondrial. 100 ng de DNA mt de cada conejo se
procesarán bajo el siguiente esquema. En un volumen final de 25 l se
realizará la siguiente mezcla; 2
l de DNA (50ng/ l); 2.
l de Ammonium
Reaction Buffer (75mM Tris-HCl pH 8.5, 20mM (NH4)2SO4,
.5mM MgCl2, 1%
Tween 20), 1 l de la mezcla de dNTP´s (10mM de cada deoxinucleótido),
20μM del oligonucléotido iniciador sentido y antisentido, 2.5 U de Gene
Choice® Taq DNA Polymerase (CLP, California) . Las condiciones de las
temperaturas para la PCR serán; desnaturalización 94ºC, por 5 minutos, 30
ciclos a 30 seg a 94º C, 30 seg a la temperatura de hibridación de cada par de
oligonucléotidos iniciadores (50- 60 °C) y 30 seg a 72ºC, y una extensión final
de 7 min a 94°C.
Secuenciación de nucleótidos de los fragmentos de DNA amplificados
por PCR. Los productos de PCR se purificarán según kit de Bioclean (USB) y
se secuenciarán mediante el sistema “ABI PRISM Dye Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Mix” de Perkin Elmer.
Análisis filogenético. Las secuencias obtenidas usando el programa de
alineación, serán analizados en formato secuencial continuo
aplicando el
Método de Distancia usando programa DNADIST y mediante el Método de
Parsimonia usando el programa DNAPARS de PHYLIP (Phylogeny Inference
Package) versión 3.2.
Los datos serán alineados de acuerdo a formato
PHYLIP y se hará análisis de dichas secuencias aplicando valor de 500 a 1000
booststrap para dar confianza a la formación de grupos.
Los árboles
filogenéticos se crearán en la modalidad sin raíz unrooted, de los cuales se
generará un árbol de consenso (Consense Tree) el cual representará la
formación de grupos. La visualización final de los árboles filogenéticos se hará
mediante el programa TreeView (versión 3.0) para generar archivos tipo .wmf,
los cuales podrán ser visualizados en programas Windows para efectos de
presentación mediante código de colores y mejorar la interpretación.
BIBLIOGRAFIA
Arruga, MV; Monteagudo; Tejedor MT. (2004). Detección de relaciones
genéticas en líneas comerciales de conejos. Archivos de zootecnia., 53: 99102.
Clavel, C. et al., (2004) Small cuniculture family faro on south coast of Guerrero
satate, México, procededings 8th. World Rabbit Congress Puebla, México.
Demeterova, C. M.; Lopes, P.; Dade, A. C. (1989). Rabbit production under
tropical conditions in Mozambique, FAO.
FAO.
(2006).
El
enfoque
de
género
http://www.fao.org/Gender/static/Method/2statds1.htm
Lundy, N., et al., (2003). Diseño de estrategias para aumentar la competitividad
de cadenas productivas con productores de pequeña escala, Manual de
campo, Proyecto de desarrollo de agroempresas rurales (CIAT), Colombia.
Martínez, A. L.
(1997). Renace la cunicultura en México, impulsada por el
centro Nacional de Cunicultura. Lagomorpha.
Mendoza, A. B. (2006a). Aplicación de tecnologías modernas en la producción
cunícola. Conejo Internacional, pp. 1- 6. México D. F.
Mendoza, A. B. (2006b). Estudio de mercado de la carne de conejo, Memoria
del primer foro internacional de cunicultura, Toluca México
Mendoza, B. J.; Guadarrama, V. M.; Jasso, G. C. (2001). Diagnóstico estático
de la cunicultura en Jocotitlán, Estado de México. Memoria del XV congreso
internacional de administración agropecuaria. Sonora, México.
Mendoza, B. J. (2000). La producción de conejos para carne: una oportunidad
de negocios para nuestro país. Memoria del XIV Congreso Internacional de
Administración Agropecuaria. Texcoco, México.
Orrtega, B.E. (2007).
SAGARPA. (2004). Volumen de producción de carne de conejo en canal (SIAP)
México D.F.
Boletín de Cunicultura, ISSN 1696-6074, Nº 104, 1999 , pags. 52-56
Eding, H., Meuwissen, T. H. 2001. Marker-Based estimates of between and
within populations kinships for the consevación of genetic diversty. Journal of
animal Breed Genetics. 118 (3) 141- 159.
Falconer, D. S., y T. Mackay. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. Ed.
Longman. United Kingdom.
Lander, R. y S. Shannon. 1996. The role of genetic variation in adaptation and
population persistence in chaging environment. Evolution 50: 434-437.
Neff B. y R. Gross. 2001. Microsatellite Evolution in Vertebrates: Inference from
AC Dinucleotide Repeats. Evolution, 50 (9): 1717-1733.
Simons, D. L. 1984. Conservación of animal genetic resources. A Science 11:
23-36.
Tristan A. 2000. Book of Mammals, National Geographic, Washington D.C.
427pp.
Tveten John L. 2001. The Mammals of Texas. Texas Tech University. 356pp.
Cheng, H.H. y Crittenden, L.B. 1994. Microsatellite markers for genetic mapping
in the chicken. Poultry Science, 73 (539-546).