20. NUTRICIÓN NITROGENADA. Introducción. Fijación simbióntica. Nodulación. Mecanismo bioquímico de la fijación. Reducción asimiladora de nitratos. Asimilación del amonio en las plantas. Control de la asimilación del nitrógeno por la planta. OBJETIVOS: Comprender los procesos relacionados con la asimilación del nitrógeno y su utilidad posterior. Introducción El nitrógeno es un elemento esencial para la planta. Es muy abundante en el medio pero aún así, existen muchas posibilidades de mineralización o evaporación gaseosa, que hacen que estas fuentes de nitrógeno no sean asimilables. Muchos suelos además no tienen nitrógeno disponible y por ello es necesario el uso de fertilizantes (que siempre suelen llevar Nitrógeno y otros dos elementos más). Su deficiencia es muy visible en la planta porque su existencia es muy importante como componente de moléculas imprescindibles: clorofila, auxinas, fitoquininas, aminoácidos, proteinas… Fig.1 Efectos de la deficiencia en N Las fuentes de nitrógeno más importantes para las plantas son: N atmosférico: (N2) es una gran fuente (80% de la atmósfera). Se asimila cuando la planta entra en simbiosis con una bacteria. Este proceso tiene un 1 importante impacto ecológico así como gran importancia agronómica. En otros casos la planta no puede fijar esta forma. No biológica: nitratos, amonio…son formas asimilables por la planta pero generalmente no están disponibles. Fijación simbióntica Se produce en simbiosis con bacterias que sí son capaces de asimilar el nitrógeno atmosférico (bien sea sólo en simbiosis o también de forma independiente), como puede ser Rhizobium (llega a fijar 8x107 T al año). En este caso la simbiosis se produce entre la bacteria y una leguminosa. Esta fijación es muy efectiva y suele utilizarse para la recuperación de suelos degradados (fitorremediación). La asociación es recíproca entre ambos, es decir, los dos organismos se benefician de la asociación. Depende de procesos que hacen que los dos se reconozcan mutuamente. Se conoce muy bien el modelo de Rhizobium y por eso es el tipo que vamos a estudiar. En este caso, como en muchos otros, la asociación se produce en la raíz. Se da un proceso de expresión génica diferencial que dará lugar a una estructura llamada simbiosoma que contendrá a las bacterias modificadas (bacteroides). De esta forma se va a poder llevar a cabo la reducción de N atmosférico a amonio, porque las condiciones del simbiosoma van a permitir la función del enzima nitrogenasa, que necesita ausencia de oxígeno. Todo el proceso está regulado por la disponibilidad de nitrógeno que tenga la planta. Los pasos del establecimiento de la simbiosis son: Reconocimiento celular modulado por aproximación y señalización Infección: crecimiento desorganizado Establecimiento de la simbiosis DIAZOTROFA. Nodulación Es el resultado de la infección. Se forman en la zona de los pelos radicales en la raíz. Esto sólo se produce cuando existe un déficit de N en la planta. Suele darse en regiones radicales jóvenes 2 y en sus primeras etapas van acompañadas de una curvatura del pelo radical. Fig.2 Curvatura del pelo radical y formación del nódulo Sólo cuando se produce el cambio de bacteria a bacteroide con la simbiosis, la bacteria es capaz de fijar N atmosférico porque es capaz de activar el enzima Nitrogenasa. Cuando la planta necesita N comienza a excretar elicitores, que son moléculas que la planta excreta y generan una respuesta. Suelen ser flavonoides que producen la aproximación de la bacteria por quimiotaxis y la expresión de los genes NOD (nodulación). La bacteria, a su vez, libera lipopolisacáridos y la planta expone en la zona de infección moléculas tipo lectina. Así se va a provocar la expresión en la bacteria de los genes NIF (fijación). El bacteroide se forma porque la bacteria entra formando un canal de infección mediante tejidos de la planta, y en su entrada la bacteria queda envuelta en restos de membrana de la célula vegetal (membrana peribacteroide). Varios bacteroides se incorporan a zonas diferenciadas formando los simbiosomas. Fig.3 Ejemplo de nódulo Dependiendo del clima nos podemos encontrar con distintos tipo de nódulos: C. templados: nódulos con crecimiento determinado. Sin células meristemáticas. Ejem. Judía. C. tropicales: nódulos con crecimiento ilimitado. Con diferentes poblaciones celulares, entre ellas meristemáticas. Ejem. Alfalfa. 3 Ambos van a estar formados por un núcleo con células con actividad nitrogenasa (central) y células con vacuolas rodeándolo, que sirven como células de tranferencia. Los indeterminados suelen tener espacios intercelulares y más vacuolas en las células periféricas. Los determinados tienen lentécelas externas para facilitar el intercambio de amonio yu nio suelen tener células de transferencia. En todo el proceso hay una potente interacción entre la efectividad del núcleo y la actividad del simbiosoma. El N entra por las raíces hacia el simbiosoma donde se reduce a amonio. Éste es excretado al citroplasma de la célula vegetal y es en los cloroplastos o también en el propio citoplasma donde se forman los compuestos orgánicos necesarios. Desde ellos se transportan a las zonas de consumo. Mecanismo bioquímico de la fijación El N atmosférico es un compuesto muy estable y debe ser activado para transformarlo en otros compuestos. Para que se produzca de forma espontánea se requieren presiones y temperaturas muy altas. Este proceso se conoce como proceso Haber- Bosch. Pero el enzima nitrogenasa permite esta reducción de forma más rápida y sin necesidad de estas condiciones. Necesita, eso sí, un ambiente de anaerobiosis y gasto de ATP. Este ambiente anaerobio lo proporciona la Leghemoglobina o, en otros casos, el que la reacción se produzca en heterocistes (estructuras celulares diferenciadas donde no hay oxígeno). El poder energético y reductor proceden fundamentalmente del proceso fotosintético. La nitrogenasa es un complejo proteico. Facilita una reacción sencilla pero a la vez compleja, porque tiene que modificar la estabilidad de la molécula de N2. Partes de la actividad nitrogenasa cambian conformacionalmente frente a flujos energéticos o procesos de oxido-reducción. En plantas superiores se desconoce parte de su funcionamiento pero se sabe más en plantas más simples. Las características de la nitrogenasa fueron postuladas por Postgate en 1987 y son las siguientes: Es inhibida por O2 Consta de dos sistemas proteicos 4 Contiene átomos de metales de transición para facilitar el trasiego de electrones y generalmente se acepta que son Fe y Mb. Necesita Mg Su actividad requiere gasto de ATP Es inhibida por ADP Como decimos la nitrogenasa esta formada por dos unidades proteicas (fig.4): Unidad 1: es el centro donde se reduce el N2 y el que tiene la actividad reductora. Formada por 4 subunidades proteicas de unos 200 KDa. Lleva Fe, Mb y S. Unidad2: formada por una Fe-proteína son 2 subunidades con 4 átomos de Fe y 4 de S. Fig.4 Actividad y estructura tridimensional de la Nitrogenasa La unidad 1 recibe electrones de la unidad 2 de forma coordinada para producir la reducción efectiva del N2. La Ferredoxina reduce a la unidad 2 que, por activación con ATP y Mg reduce posteriormente a la unidad 1. La reacción global sería: N2 + 6H+ + 6e- ---NITROGENASA--- 2 NH3 2H+ + 2e- -------------------- H2 N2 + 8e- + 8H+ + n ATP ------------ 2NH3 + H2 + n ADP + nPi 5 Luego necesitamos 8 e- para reducir el nitrógeno atmosférico. Generalmente por cada electrón se necesitan 2 moléculas de ATP luego serán necesarias 16 moléculas de ATP para reducir una molécula de N2 . El aporte de energía procede de la sacarosa que se forma por el proceso fotosintético, luego como es observable, la reducción del nitrógeno es un proceso que conlleva un gasto importante de energía. Al simbiosoma no llega sacarosa sino malato, que proporciona el poder asimilatorio necesario. Éste es incorporado por el simbiosoma mediante transportadores activados. El amonio va a ser fijado en el citoplasma o en los plastos de la célula infectada. Dependiendo del tipo de nódulo se formarán amidas (en nódulos indeterminados) o ureidos (en nódulos determinados de zonas tropicales). Fig. 5 Fijación en raíz con nódulo y transporte a las hojas Reducción asimiladora de nitratos (fijación no biológica) Se da en las plantas donde no ocurre la fijación biológica por simbiosis con microorganismos. Fijan entonces formas nitrogenadas del suelo asimilables por la raíz, preferentemente NO3. Algunas también pueden absorber amonio. En estos dos casos se produce una entrada selectiva a la célula receptora. En el caso del nitrato pueden darse dos situaciones: Utilización inmediata en la célula Acumulación en vacuolas: ocurre cuando no es utilizado ya que, a determinadas concentraciones, puede resultar tóxico. Puede ser utilizado en momentos de escasez. El proceso consiste en la reducción de nitrato a nitrito. Este entra en los plastidios y se transforma en amonio que dará lugar, en último término, a aminoácidos. Estos aminoácidos son 6 transportados a los lugares de consumo mediante el xilema. La fijación de nitrato es selectiva y activa y se produce por cambios de membrana generados por una ATPasa. La reacción general sería: NO3- -------------------- NO2- -----------------------NH4+ Fig.6 Fijación de nitrato en la raíz y transporte a los centros de consumo. El paso de nitrato a nitrito está catalizado por el enzima nitrato reductasa. Es un enzima citoplásmico que toma e- del NADH preferentemente y produce reducción del nitrato con participación de FAD, Citocromo b-557 y Molibdeno. El paso de nitrito a amonio está catalizado por el enzima nitrito reductasa, que se encuentra en los plastos y toma ede la Ferredoxina. En su caso participa el Sirohemo (tetrapirrol de Fe y S). Asimilación de amonio en plantas El amonio de transforma en productos susceptibles de ser transportados y que son necesarios para en crecimiento de la planta. Hay un gasto de ATP para que, mediante la glutamina sintetasa se transfiera el amonio al glutamato para dar lugar a glutamina. Para formar elementos más complejos se realiza una transaminación con participación de Ferredoxina o nADP, generando Aspartato y Asparragina que van a ser los vehículos de transporte. En algunos casos también se pueden formar ureidos. 7 Fig.7 Proceso global de la asimilación no biológica de nitrógeno. Control de la asimilación de nitrógeno en plantas El proceso de captación está sometido a regulación. Sabemos que la mayoría de los elementos necesarios para el crecimiento y desarrollo de la planta pueden llegar a ser nocivos si su concentración en la planta es demasiado alta y por ello es necesaria esta regulación. En el caso de la asimilación de nitrógeno existe una regulación tanto de la actividad génica como de la enzimática. En esta regulación intervienen varios factores como son: Disponibilidad de Nitrato en el entorno Presencia o ausencia de luz Disponibilidad de Glucosa Concentración de productos (Ejem. la presencia de Glutamina inhibe el proceso) La nitrato reductasa se inactiva por fosforilación en el último residuo de Serina por acción de una kinasa. La activación se ve favorecida por el Calcio (porque favorece hidrólisis de ATP) y desfavorecida por la presencia de triosas fosfato. La luz es un efector positivo porque elimina restos de fosfato de la serina. NOEMÍ TRABANCO MARTÍN 3º C 8 9