Prob1-3IG2011

Problemas Genética Molecular e Ingeniería Genética Curso 2011-12
APELLIDOS
NOMBRE:
Grupo:
Problema 1
Para los siguientes 3 enzimas, indica en cada caso a) el tipo de extremos que genera, b) el número
de sitios de corte y c) el tamaño medio de los fragmentos obtenidos al fragmentar DNA genómico
(tamaño de 3 x 109 pares de bases) y un contenido en CG del 40%?.
AccI: GT (A/C)(T/G)AC
BglI : GCCNNNN NGGC
HhaI: GCG C
Según estos datos, ¿hay correlación precisa entre la longitud en pb de las dianas de restricción y la
probabilidad de encontrar dicha secuencia en un genoma?
Si algunos de los enzimas listados a continuación genera fragmentos compatibles con los obtenidos
por otra enzima de la lista, indícalo conectando sus nombres con una línea.
BamHI: G GATCC
EcoRI: G AATTC
HinfI: G ANTC
HaelII: GG CC
Sau3AI: GATC
HindIII: A AGCTT
HpaII: C CGG
MboI GATC
Hsp92I: G(A/G) CG(T/C)C
¿Hay algún enzima que genere fragmentos que sean incompatibles entre sí?, En caso positivo,
subráyalo(s)
Decidimos que nos interesa clonar los fragmentos de restricción genómicos en el sitio BamHI de
nuestro vector favorito, aunque nos gustaría producir un mayor número de segmentos genómicos
que los que genera BamHI. ¿Sería posible con algún otro enzima de la lista? ¿Con cual(es)?
Si es así, ¿cual sería ahora el tamaño medio de los fragmentos genómicos generados?
¿Qué porcentaje de los sitios que reconoce BamHI en el genoma serían cortados por este otro
enzima?
¿Y viceversa?
1
Problemas Genética Molecular e Ingeniería Genética Curso 2011-12
APELLIDOS
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Problema 2
El objetivo del experimento del que forma parte este análisis es conseguir expresar constitutivamente, de forma estable
y a niveles relativamente altos el gen pipX de la cianobacteria Synechococcus. Para ello se clonó previamente un
segmento genómico de 1,8 kb que contiene este gen en el MCS de un vector que se replica en E. coli pero no en
cianobacterias. A continuación se introdujo un inserto de 1,2 Kb (cassette Kmr) que contiene un marcador de
resistencia a kanamicina con un promotor muy fuerte que permite transcribir también las secuencias aguas abajo (en
nuestro caso pipX). El plásmido recombinante (P. Recomb) se transformó en Synechococcus. De la placa donde
crecieron transformantes resistentes a kanamicina (muchos) se aislaron 4 clones con la misma apariencia, dos de los
cuales (1 y 2) se usaron directamente para un análisis por PCR amplificando con los cebadores OLI-F y OLI-R (Fig 1).
La estirpe silvestre (“wt”, de wild type) sirvió de control. Los otros 2 transformantes se transfirieron a placas de medio
con kanamicina para obtener más biomasa.
Dibuja esquemáticamente, incluyendo todas las distancias
conocidas entre sitios, elementos y/o cebadores
M wt
clon
1 2
clon
3 4
M
La región genómica de PipX, versión silvestre
3530
3530
2027
1584
1375
2027
1584
1375
947
831
947
831
564
564
El inserto del P. Recomb
Fig. 1
Fig. 2
Indica el tamaño en kb de la banda que se esperaría al amplificar con los cebadores OLI-F y OLI-R si la región
genómica silvestre hubiera sido sustituida por la región equivalente del plásmido recombinante.
¿Concuerda tu predicción con los resultados que se muestran en la Fig.1? En caso negativo apunta una posible
explicación y, si procede, también una sugerencia para averiguar qué ha pasado.
Dos semanas más tarde los clones 3 y 4, que habían sido transferidos otra vez a placas de medio fresco con kanamicina
se usaron como fuente de ADN para una nueva PCR con los mismos cebadores, aunque usando un programa
ligeramente distinto. Se obtuvieron los resultados de la Fig 2. Sugiere posibles causas de las diferencias encontradas con
los clones 1 y 2. Indica “clon”, si crees que la estructura de la región pipX es distinta entre los transformantes 1 y 2 y los
3 y 4? En caso contrario indica “otras causas” y/o precisa lo que puedas.
Sugiere posibles causas de que aparezcan varias bandas en las PCR de los clones 3 y 4.
Idem para que se vea claramente una banda de unos 800pb en el 4 que no parece estar en el 3.
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Problemas Genética Molecular e Ingeniería Genética Curso 2011-12
APELLIDOS
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Problema 3
Estamos interesados en clonar nuestro gen Favorito en un vector de sobre-expresión (tipo pGEX).
Tras una búsqueda en los archivos del laboratorio comprobamos que lo tenemos ya clonado en un
vector distinto, denominado pGAD424(+2), que no nos sirve para nuestro propósito. No obstante,
podemos intentar sacar el inserto del plásmido recombinante (pGADgenFavorito) para re-clonarlo
en vectores pGEX. Al no encontrar en los archivos como se hizo la clonación decidimos buscar en
el congelador oligonucleótidos no fichados. Encontramos 4 oligos y sus secuencias (Fig. 1).
Con la información de las secuencias que flanquean al gen Favorito (Fig. 2) y las de los oligos
encontrados, indica que oligo(s) han podido servir para construir el plásmido pGADgenFavorito.
¿En que características te has basado para escoger los cebadores?
¿Qué enzima(s) se ha(n) usado para abrir el vector pGAD424(+2) (Fig. 3)?
¿Sirven los dos vectores derivados de pGEX, y cuyos sitios de clonación múltiple se especifican
(Fig. 4), para sobre-expresar nuestra proteína favorita? Indica que vector(es) y que sitios utilizarías
para la clonación.
Escribe la secuencia (unas 15 bases) de la(s) frontera(s) vector-inserto relevante(s), resaltando los
sitios usados en la clonación.
Con la clonación que has diseñado, y tras obtener plásmidos recombinantes del tamaño esperado
¿Qué proporción esperarías que fueran buenos, es decir contuvieran la fusión proteica correcta entre
la proteína del vector y la Favorita?
Además de tu(s) sitio(s) de restricción elegido(s), ¿existían otras posibilidades igualmente sencillas?
Si es así, indícalas.
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Problemas Genética Molecular e Ingeniería Genética Curso 2011-12
Oligo A: 5’-CGGGATCCATGGCAACAGGCACA-3’
Oligo B: 5’-CGGGATCCTCACCCTTTATCGTTTGG-3’
Oligo C: 5’-CGGGATCCATGAATACCCTTCCAGAAC-3’
Oligo D: 5’-CGGGATCCTACTTCCGAATAGGCAG-3’
Fig. 1: Secuencias de los oligonucleótidos encontrados
5’-GTGGCGCACAATGAATACCCTTCCAGAACAGTAC…….CCCTCAATCCAAACGATAAAGGGTGATGTGTTTACT-3’
Fig. 2: Secuencia del gen favorito
pGAD424(+2)
EcoRI
SmaI
BamHI
SalI
PstI
BglII
CCA AAA AAA GAG ATC GAA TTG AAT TCC CGG GGA TCC GTC GAC CTG CAG AGA TCT ATG AAT
P
K
K
E
I
E
L
N
S
R
G
S
V
D
L
Q
R
S
M
N
Fig 3: Vector pGAD424(+2). Secuencia detallada del MCS
MCS
pGEX-4T
Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Asn Ser Arg Val Asp Ser Ser Gly Arg Ile Val Thr Asp
CTG GGT CCG GGT GGA TCC CCG AAT TCC CGG GTC GAC TCG AGC GGC CGC ATC GTG ACT GAC TGA
BamHI
EcoRI
SmaI
SalI
XhoI
NotI
STOP
pGEX-5X
Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Glu Phe Pro Gly Arg Leu Glu Arg Pro Hir Arg Asp
ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GAA TTC CCG GGT CGA CTC GAG CGG CCG CAT CGT GAC TGA
BamHI
EcoRI
SmaI
SalI
XhoI
NotI
STOP
Fig. 4: Vectores pGEX. Secuencia detallada del MCS de las variantes 4T y 5X
¡ESTA HOJA NO HAY QUE ENTREGARLA!
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