PROTOCOLO DE ISH DE RNAm SECCIÓN 1

Hibridación in situ
Técnicas Histológicas: curso 2002/2003
OBTENCION DE LA SONDA DE RNAm MARCADA CON DIG-11-UTP
1. Calcular los volúmenes de los reactivos de la reacción de transcripción teniendo en cuenta
que para producir la transcripción de 1 g de DNA (inserto + plásmido linearizado) se
requieren 20 l de volumen total de reacción.
2. Poner en un eppendorf:
- DNA molde, 1 g (el volumen en l depende de la concentración del DNA).
- Solución de transcripción: 2 l si es 10x. Se utiliza el que viene con la RNA polimerasa .
- Mezcla de NTP, con Dig-11-UTP (Dig RNA labeling mix) 10x, 2 l.
- 1 l de inhibidor de RNasas (RNasin)
- H2O tratada con DEPC, hasta completar los 20 l (contando el volumen de la RNA
polimerasa).
- RNApolimerasa, la correspondiente al promotor que lleve el plásmido ( T7 o SP6), 2 l
(40 u).
Dar un pulso breve de centrífuga.
3. Incubar los eppendorf 2 h en baño a 37 ºC (pueden estar más tiempo). Tapar con Parafilm.
Dar un pulso breve de centrífuga.
4. Añadir 2 l (20 u) de DNasa, libre de RNasas, e incubar 15 min a 37 ºC. Dar un pulso
breve de centrífuga.
5. Añadir 2 l de EDTA 0,2 M pH=8, para detener la reacción.
6. Precipitar el RNA añadiendo 2,5 l de LiCl 4 M y 75 l de etanol absoluto preenfriado a 20 ºC. Agitar bien con la micropipeta.
7. Mantener a -20 ºC, al menos durante 2 h.
8. Sacar los eppendorf del congelador y centrifugar a 14.000 r.p.m. durante 15 min (se suele
ver "pellet"). Retirar el sobrenadante volcando el tubo por el lado contrario al "pellet".
9. Añadir a cada tubo 50 l de etanol 70º y agitar suavemente para no llevarse el "pellet".
10. Volver a centrifugar 5 min. Decantar el sobrenadante.
11. Secar en recipiente de vacío 10-15 min (no deben quedar gotas).
12. Añadir 20 l de H2O tratada con DEPC y 1 l de RNasin.
13. Incubar a 37 ºC 45-60 min en el baño.
14. Si no se va a utilizar de inmediato se puede conservar a -20 ºC.
Dpto. Histología y Anatomía Patológica
Universidad de Navarra
Hibridación in situ
Técnicas Histológicas: curso 2002/2003
Nota: para verificar si ha habido transcripción se puede realizar una electroforesis en gel de agarosa y para
conocer la concentración de RNAm se puede medir en el espectrofotómetro. El rendimiento de la transcripción
es aproximadamente de 10 g de RNA por g de DNA.
TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN IN SITU DE RNAm
CON RIBOSONDAS MARCADAS CON DIGOXIGENINA
- Material fijado en formol 10% o paraformaldehído al 4% e incluido en parafina.
- Cortes de 4-5 m en porta objetos preparados para hibridación. Las preparaciones se tienen
una noche en estufa a 37 ºC.
A. DESPARAFINACIÓN E HIDRATACIÓN DE LOS CORTES
1. Desparafinar los cortes en:
- Estufa de 60 ºC, 15 min.
- Xilol (nuevo), 20 min.
2. Hidratación:
- Etanol absoluto (nuevo), 5 min.
- Etanol 90º, 5 min en agua con DEPC.
- Etanol 70º, 5 min en agua con DEPC.
- Agua tratada con DEPC, 5 min.
- Lavado en PBS, 5 min.
3. Incubar las preparaciones en 0,2% Tritón/PBS durante 15 min en agitación.
4. Lavar en PBS, 5 min.
Nota: todos los pasos de la desparafinación se realizan en el coplin.
B. PRETRATAMIENTO CON PROTEINASA K
1. Preparar la solución de proteinasa K en 0,1 M Tris/50 mM EDTA, pH=8, a la
concentración que se desee. Calentarla a 37 ºC. Stock a 0.2 mg/ml
2. Colocar la solución de proteinasa K con micropipeta encima del tejido (100-200 l).
3. Incubar a 37 ºC en cámara húmeda, 30 min.
4. Detener la digestión en el coplin sumergiendo las preparaciones en 0,1 M glicina/PBS,
min.
5. Lavar brevemente en PBS, dos veces.
C. ACETILACIÓN
1. Incubar en agitación con 0,25% anhídrido acético en 0,1 M trietanolamina pH=8, 10 min.
2. Lavar brevemente en H2O tratada con DEPC.
Dpto. Histología y Anatomía Patológica
Universidad de Navarra
5
Hibridación in situ
Técnicas Histológicas: curso 2002/2003
3. Dejar secar las preparaciones a Tª ambiente.
D. HIBRIDACIÓN
1. Calentar la solución de hibridación a 50 ºC (una vez descongelada no se debe volver a
congelar).
2. Mezclar bien (en vortex) en un tubo 1 parte de sonda con 9 partes de solución de
hibridación. Mantener a 50 ºC. La concentración final de la sonda es aproximadamente de 50
ng/l.
3. Poner una gota de unos 15-20 l en un cubre. Colocar encima del corte SIN QUE SE
FORMEN BURBUJAS. Sellar el cubre con laca de uñas.
4. Colocar las preparaciones en una cámara húmeda con 5xSSC. Incubar en estufa a 48 ºC (la
Tª puede ser variable) de 16 a 20 h (overnight).
E. LAVADOS POST-HIBRIDACIÓN
1. Sacar las preparaciones de la estufa. Retirar el cubre levantándolo cuidadosamente con una
cuchilla.
2. Incubar las preparaciones en agitación en 2xSSC/0,1% SDS a Tª ambiente, 5 min 4 veces.
3. Incubar las preparaciones en agitación 0,1xSSC/0,1% SDS a 48 ºC, 2 x 10 min.
4. Lavar las preparaciones brevemente en 2xSSC dos veces, para retirar restos de SDS.
5. Incubar en una solución de RNasa en 2xSSC, a una concentración de 20 g/ml (puede ser
variable) a 37 ºC durante 15 min y en agitación.
6. Lavar brevemente en 2xSSC.
F. INCUBACIÓN CON EL ANTICUERPO ANTI-DIGOXIGENINA
1. Lavar las preparaciones en tampón 1, 10 min a Tª ambiente y en agitación.
2. Preparar otra solución como la anterior, con el anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con
fosfatasa alcalina a una dilución 1:500. Incubar durante 2 h a Tª ambiente.
3. Lavar con tampón 1, 5 min a Tª ambiente.
4. Lavar en agitación con tampón 2, 5 min a Tª ambiente.
Dpto. Histología y Anatomía Patológica
Universidad de Navarra
Hibridación in situ
Técnicas Histológicas: curso 2002/2003
G. REVELADO Y VISUALIZACIÓN DEL MARCAJE
1. Preparar la solución de revelado:
- 10 ml de tampón 2
- 10 l de levamisol 1 M
- 35 l de solución X-fosfato
- 45 l de NBT
2. Incubar de 2 a 6 h en la oscuridad (este tiempo puede ser variable). Controlar bajo el
microscopio.
3. Cuando ya se ha completado el marcaje, lavar en tampón 3, 5 min a Tª ambiente.
4. Montar las preparaciones con glicerol/PBS (1:1).
Dpto. Histología y Anatomía Patológica
Universidad de Navarra
Hibridación in situ
Técnicas Histológicas: curso 2002/2003
ANEXO ISH mRNA: PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
Los volúmenes se han calculado teniendo en cuenta que en una cubeta pequeña caben 50 ml y
en una grande 75 ml.
Alcohol 90º
Etanol absoluto
H2O DEPC
50 ml
45 ml
5 ml
75 ml
67,5 ml
7,5 ml
100 ml
90 ml
10 ml
125 ml
112,5 ml
12,5 ml
150 ml
135 ml
15 ml
Alcohol 70º
Etanol absoluto
H2O DEPC
50 ml
35 ml
15 ml
75 ml
52,5 ml
22,5 ml
100 ml
70 ml
30 ml
125 ml
87,5 ml
37,5 ml
150 ml
105 ml
45 ml
PBS 1x
PBS 10x
H2O DEPC
200 ml
20 ml
180 ml
300 ml
30 ml
270 ml
400 ml
40 ml
360 ml
500 ml
50 ml
450 ml
600 ml
60 ml
540 ml
Proteinasa K
1 ml
1,5 ml
2 ml
2,5 ml
3 ml
Se indica el volumen que hay que poner de proteinasa K stock (0,2 mg/ml) para cada
concentración. El volumen total se completa con Tris/EDTA.
1 g/ml
5 l
7,5 l
10 l
12,5 l
15 l
5 g/ml
25 l
37,5 l
50 l
62,5 l
75 l
10 g/ml
50 l
75 l
100 l
125 l
150 l
20 g/ml
100 l
150 l
200 l
250 l
300 l
40 g/ml
200 l
300 l
400 l
500 l
600 l
60 g/ml
300 l
450 l
600 l
750 l
900 l
80 g/ml
400 l
600 l
800 l
1000 l
1200 l
100 g/ml
500 l
750 l
1000 l
1250 l
1500 l
Glicina 0,1 M
Glicina 1 M
PBS 10x
H2O DEPC
50 ml
5 ml
5 ml
40 ml
75 ml
7,5 ml
7,5 ml
60 ml
100 ml
10 ml
10 ml
80 ml
125 ml
12,5 ml
12,5 ml
100 ml
150 ml
15 ml
15 ml
120 ml
Trietan. 0,1 M
Trietanolamina 1 M
H2O DEPC
Anh. acet. (0,25%)
50 ml
5 ml
45 ml
125 l
75 ml
7,5 ml
67,5 ml
187,5 l
100 ml
10 ml
90 ml
250 l
125 ml
12,5 ml
112,5 ml
312,5 l
150 ml
15 ml
135 ml
375 l
Dilución de la sonda en la solución de hibridación
Sonda
2 l
5 l
10 l
Solución de hibrid.
18 l
45 l
90 l
Dpto. Histología y Anatomía Patológica
20 l
180 l
Universidad de Navarra
Hibridación in situ
Técnicas Histológicas: curso 2002/2003
2xSSC/ 0,1%SDS
10% SDS
10xSSC
H2O dd
200 ml
2 ml
40 ml
158 ml
300 ml
3 ml
60 ml
237 ml
400 ml
4 ml
80 ml
316 ml
500 ml
5 ml
100 ml
395 ml
600 ml
6 ml
120 ml
474 ml
0,1xSSC/ 0,1%SDS 100 ml
10% SDS
1 ml
10xSSC
1 ml
H2O dd
98 ml
150 ml
1,5 ml
1,5 ml
147 ml
200 ml
2 ml
2 ml
196ml
250 ml
2,5 ml
2,5 ml
245 ml
300 ml
3 ml
3 ml
294 ml
2xSSC
10xSSC
H2O dd
200 ml
40 ml
160 ml
300 ml
60 ml
240 ml
400 ml
80 ml
320 ml
500 ml
100 ml
400 ml
600 ml
120 ml
480 ml
RNasa 20g/ml
2xSSC
RNasa 20 mg/ml
50 ml
50 ml
50 l
75 ml
75 ml
75 l
100 ml
100 ml
100 l
150 ml
150 ml
150 l
200 ml
200 ml
200 l
Anti-Dig 1:500
Tampón 1
Anti-Dig
1 ml
998 l
2 l
2 ml
1996 l
4 l
3 ml
2994 l
6 l
4 ml
3992 l
8 l
5 ml
4990 l
10 l
Dpto. Histología y Anatomía Patológica
Universidad de Navarra