TALLER DE GENÉTICA 3 PRUEBAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR Guía de actividades 2008 1 Taller de Genética III: Pruebas de diagnóstico molecular Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los fundamentos moleculares de la electroforesis de ácidos nucleicos y su uso en las técnicas de Southern blot, PCR y secuenciación. Los objetivos del Taller III son los siguientes: 1- Identificar en qué casos son aplicables las técnicas de diagnóstico molecular 2- Interpretar la información que surge de la aplicación de esas pruebas Ejercicio 1 Introducción. La anemia de células falciformes es una enfermedad sanguínea caracterizada por la presencia de glóbulos rojos con forma anormal (de hoz). La forma de hoz está asociada a una pérdida de flexibilidad celular y resulta en movimientos restringidos de los glóbulos rojos a través de los capilares más pequeños, provocando disminuciones en la disponibilidad de oxígeno de los tejidos por ellos irrigados. La enfermedad es crónica: los individuos se encuentran en buen estado la mayor parte del tiempo, pero sufren periódicamente de dolorosos ataques y su esperanza de vida está disminuida. La anemia de células falciformes es una enfermedad monogénica con un patrón de herencia autosómico recesivo. La causa es una sustitución puntual (A por T) en el gen de la globina que provoca un cambio de sentido en la cadena polipeptídica en dónde ácido glutámico es globina reemplazado por valina. La globina resultante (globina mutante) se denomina hemoglobina S. La hemoglobina S es soluble cuando está completamente oxigenada, pero cuando las tensiones de oxígeno disminuyen sufre un marcado cambio conformacional que conduce a la deformación del glóbulo rojo y a la hemólisis. El diagnóstico molecular para la mutación descripta consiste en amplificar mediante PCR una región de ADN de 233 pb que abarca el sitio de la mutación y luego tratar al producto amplificado con la enzima de restricción Dde I. Esta enzima produce dos fragmentos de 178 y 55 pb, respectivamente. La discriminación de esta prueba se debe a que la mutación produce la pérdida del sitio de restricción para esta enzima. De esta manera, la resolución electroforética puede revelar la presencia o ausencia de la mutación. Problema. Una pareja ha tenido dos hijos: una niña de diez años sana y un niño de cuatro años con anemia de células falciformes. La mujer está esperando un nuevo hijo y se ha realizado un muestreo de vellosidades coriónicas para determinar si su nuevo hijo (el probando), heredará la enfermedad. Se muestra el resultado de la prueba de diagnóstico tal como se describió previamente: M: marcadores de peso molecular 1: control 2: padre 3: madre 4: probando 5: hija de 10 años 6: hijo de 4 años 2 A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cómo interpreta el patrón de bandas en cada caso. B- Con los datos obtenidos, dibuje el árbol genealógico de la familia A- Según esta prueba molecular los productos de amplificación del alelo mutado, no van a ser clivados por la enzima de restricción, generando una banda de alto peso molecular, correspondiente a los 233 pb. La presencia en el gel de esta única banda de alto peso implica que ambos alelos de ese individuo son mutantes, es decir, se trata de un homocigota recesivo (ejm. calles 1 y 6 del gel). El alelo no mutado, en cambio, será digerido por la enzima y exhibirá 2 bandas, una correspondiente al fragmento de 178 pb y otra correspondiente al fragmento de 55 pb. Un individuo homocigota para los alelos wild type quedará evidenciado por la presencia de estas dos bandas en el gel (ejm. calle 4 del gel). Un individuo heterocigota presentará una banda de alto peso correspondiente al alelo mutado y las dos bandas restantes que pertenecen al alelo wild type, es decir, tres bandas en total (ejms. calles 2,3 y 5). En cosecuencia, los genotipos son los siguientes: Madre, padre e hija de 10 años heterocigotas, hijo de 4 años homocigota recesivo, probando homocigota para el alelo normal. B- Ejercicio 2 Introducción. En función de la tasa de mutación –que en el genoma humano es muy variable– se pueden distinguir dos tipos de mutaciones: mutaciones estáticas y mutaciones dinámicas. En las primeras, la tasa de mutación es la misma tanto para la secuencia originada tras la mutación como para la secuencia predecesora. Sin embargo, las mutaciones dinámicas que ocurren en secuencias de ADN repetitivo, se caracterizan por un tipo muy particular de mutación: la expansión de tripletes. En este caso, la tasa de mutación depende del número de copias, por lo que la mutabilidad de una nueva secuencia originada por mutación es diferente de la de la secuencia de la que proviene. Se ha demostrado que las mutaciones dinámicas que originan un aumento en el número de repeticiones en secuencias polimórficas de tripletes repetidos constituyen un nuevo mecanismo de mutación que conduce finalmente a diversas enfermedades neurológicas hereditarias, un ejemplo d estas es la distrofia miotónica (DM) La DM es una enfermedad neuromuscular de herencia autosómica dominante con una incidencia estimada de 1/7.500, siendo la forma más común de distrofia muscular en adultos. El cuadro clínico de los pacientes afectados de DM es muy variable, y aunque son características 3 la miotonía y la progresiva debilidad consecuente, también se ven afectado otros sistemas, produciéndose defectos en la conducción cardíaca, cataratas, hipersomnia, atrofia testicular y calvicie prematura en los varones. Esta extraordinaria variación fenotípica, que tiene lugar tanto entre las distintas familias afectadas como entre los individuos de una misma familia, es una de las características más notables de la DM. El fenómeno de la anticipación (la enfermedad se manifiesta en edades cada vez más tempranas en generaciones sucesivas, presentando además síntomas más severos) junto con el grado variable de penetrancia, son otras características destacables de la DM. Desde el punto de vista clínico, los pacientes se clasifican en tres categorías principales de acuerdo con la edad de manifestación de la enfermedad y la expresión fenotípica de la misma: 1. De manifestación tardía. En muchos casos es difícil de diagnosticar por el ligero grado de afectación que muestran los pacientes. 2. De manifestación en adultos 3. De manifestación temprana, que es la forma más severa de la enfermedad y se ve frecuentemente asociada con un profundo retraso mental neonatal. El defecto molecular subyacente a la DM se ha identificado como un fragmento de ADN inestable que contiene repeticiones de triplete (CTG)n y que sufre expansión en los pacientes afectados por la enfermedad. El número de repeticiones del triplete (CTG)n es muy variable en la población normal, oscilando entre 5 y 27 repeticiones; los pacientes mínimamente afectados tienen al menos 50 repeticiones, mientras que los individuos más severamente afectados portan expansiones de dicha secuencia con cientos e incluso miles de repeticiones. El triplete CTG se localiza en el extremo 3’ no traducido (3’UTR) del ARNm de la proteína quinasa de la miotonina (MDPK), es decir, por fuera de la región codificante. El gen MDPK está ubicado en el cromosoma 19 y contiene 15 exones que se extienden aproximadamente 13 kb, produciendo finalmente un polipéptido de 524 aminoácidos. Una vez identificada la amplificación en el número de repeticiones CTG como la base genética de la DM, se ha realizado un gran esfuerzo para desentrañar cómo la expansión podría producir la enfermedad. Algunos grupos de investigación han demostrado que en células en cultivo, la expansión del número de tripletes conduce a la ausencia del ARNm de la proteína MDPK i. El mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce, aunque se cree que un elevado número de repeticiones CTG en el extremo 3’ del gen podría de algún modo producir una disminución en la tasa de síntesis o de procesamiento del ARNm correspondiente. Problema. Un niño es diagnosticado clínicamente con la forma temprana de la DM. Las entrevistas y el estudio clínico de los familiares determinan que su madre posee una forma leve de la enfermedad, y permiten la construcción del siguiente árbol genealógico 1: 1 Los números que figuran en el árbol genealógico hacen referencia al estudio molecular posterior. 4 Para realizar un estudio detallado de los portadores, a los individuos que figuran en el árbol genealógico se les realizó una prueba de diagnóstico molecular. Partiendo de sangre periférica, la prueba consiste en realizar un Southern blot, digiriendo al ADN con la enzima de restricción NcoI y usando como sonda específica una secuencia que hibrida con una región del gen MDPK muy cercana a la ubicación de los tripletes CTG. El resultado se muestra a continuación. Los números corresponden con los individuos del árbol genealógico. M: marcador de peso molecular A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cómo interpreta el patrón de bandas en cada caso. B- Explique las diferencias en el patrón de bandas de los individuos 2, 3 y 6. Relacione con la expresión fenotípica C- ¿Encuentra discordancias entre los resultados de la prueba molecular y el diagnóstico clínico? En caso afirmativo, indique a qué pueden deberse. A- Por tratarse de una mutación por expansión de tripletes, el fragmento que contiene la zona de los tripletes, que es dónde hibridará la sonda, será de mayor tamaño en los alelos mutados que en los no mutados. Además, la longitud será proporcional a la expansión que se haya producido. De esta manera un individuo normal presentará únicamente una banda correspondiente a los alelos no mutados (ejm. individuos 1,4,5,7,8,9), y los individuos portadores de un alelo mutado (o premutado) presentarán una segunda banda, correspondiente a un fragmento de mayor tamaño (ejm. individuos 2,3,6,10) B- Las diferencias entre esos partones de bandas se deben a las distintas expansiones que ha sufrido el alelo mutado a lo largo de las generaciones, que se evidencian en el Southern como bandas correspondientes a fragmentos de distinto tamaño. Se observa una expansión progresiva entre la abuela (6), la madre (3) y el niño (2). Esta expansión progresiva se correlaciona (y explica) el fenómeno de anticipación. C- Las discordancias son que los individuos 6 y 10 son portadores de un alelo mutado (resultado diagnóstico molecular) pero sin embargo no fueron diagnosticados positivamente ante el examen clínico. Se pueden discutir varios factores: penetrancia incompleta, expresividad variable, edad de desarrollo de la enfermedad, formas premutadas, etc… 5 Ejercicio 3 Introducción. La Fibrosis quística es la enfermedad autosómica recesiva más común en la población de origen caucásico, y se presenta en uno de cada 2000 a 2500 nacidos vivos y tiene una frecuencia de portadores de uno cada 20 a 25 nacidos vivos. Los pacientes con fibrosis quística tienen una conducción anormal de cloruros a través de la membrana apical de las células epiteliales, causando secreciones espesas en las vías aéreas, páncreas, intestinos, y vas deferens. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) que está ubicado en el cromosoma 7q31-32., el cual codifica una proteína de 1480 aminoácidos que funciona como un canal de cloruro regulado por AMP cíclico. Se han descripto más de 1000 mutaciones en este gen, muchas de las cuales son muy poco frecuentes. Pero una mutación se destaca por ser la más frecuente. Está presente en cerca del 57% de los cromosomas fibroquísticos en Argentina y se denomina F508, y consiste en una deleción de tres pares de bases (CTT) en el exón 10 que resulta en la pérdida del aminoácido fenilalanina en la posición 508 de la proteína. Problema. Una niña recién nacida presenta signos compatibles con la fibrosis quística, pero el diagnóstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnóstico molecular para determinar la presencia de la mutación F508. La prueba consiste en amplificar mediante PCR una región del gen que contiene el triplete CTT del exón 10. Los productos de amplificación se resuelven luego en un gel de poliacrilamida. A continuación se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia (ver correspondencia numérica) C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido) A- Explique el patrón de bandas para cada individuo. ¿Pude explicarse el diagnóstico clínico del probando con esta prueba? Posteriormente, se realizó la búsqueda de la segunda mutación más frecuente, llamada G551D, que es una mutación de sustitución con cambio de sentido que provoca un cambio de un aminoácido de glicina (G) por un ácido aspártico (D) en la posición 551 de la cadena polipeptídica. B- Determine si la siguiente estrategia experimental es adecuada para detectar la mutación G551D. Justifique su respuesta: “Se utilizan primers adecuados para amplificar una región que contenga a la zona de la sustitución. Los productos de amplificación se resuelven en un gel de poliacrilamida” 6 Para realizar la búsqueda de la mutación G551D se utilizó PCR alelo específica. En este abordaje experimental uno de los primers del par utilizado sólo puede hibridar con la secuencia si está presente la mutación buscada. De modo tal que sólo habrá amplificación en ese caso, y de allí viene el nombre de esta variante de la técnica de PCR. El siguiente es el resultado de la PCR alelo específica (los números hacen referencia los individuos analizados): M: marcadores de peso molecular CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido) C- ¿Por qué es especialmente importante en esta técnica usar controles? Expliqué cuál es el genotipo de los controles utilizados (CA,CB)en función de su patrón de bandas D- ¿Qué conclusión puede sacar de esta prueba para la familia analizada? Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar el 84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada. Por esta razón se decidió pasar a otra estrategia experimental: secuenciar el gen de CFTR de los miembros de la familia y compararlo con la secuencia normal. Se utilizó el método de los ‘dideoxi’ automatizado, en donde cada dideoxi (A,T,C,G) está marcado con un fluoróforo diferente, y la secuencia aparece como una sucesión de picos de fluorescencia de diferentes colores. Durante la secuenciación del exón 3, en la posición 113, apareció una mutación que estaba presente en los individuos 2 y 4, pero no en los individuos 1 y 3. A continuación se muestra el fragmento de la secuenciación que compara la secuencia normal y la mutada: secuencia normal secuencia mutada 7 E- ¿Por qué hay un ‘doble pico’ en la posición mutada? F- ¿Puede concluirse que la mutación hallada explica el diagnóstico clínico de fibrosis quística? Discuta A- Dado que F508 es una mutación de deleción, el producto de amplificación del alelo normal será de mayor tamaño (tres nucleótidos mayor) que el producto de amplificación del alelo mutado. Los controles C1 y C2 muestran dos individuos homocigotas para el alelo normal y el mutado (F508), respectivamente. Los heterocigotas para esta mutación presentarán un patrón de dos bandas (ejms. individuos 1 y 4). De esta prueba puede concluirse que el padre y su hija afectada (probando) son heterocigotas para la mutación F508, en tano que la madre y la hermana no afectada no portan esa mutación. De esta manera, no puede explicarse con esta prueba que el probando padezca fibrosis quística, porque sólo hemos hallado un alelo mutado. B- La estrategia es inadecuada pues los productos de amplificación del alelo normal y el mutado tendrían el mismo tamaño por tratarse de una mutación de sustitución. Por eso no podrían diferenciarse por su migración diferencial en la electroforesis. C- En la PCR alelo específica es crítico usar controles, pues las conclusiones se extraen por la presencia y/o ausencia de los productos de amplificación. Hay que demostrar que la reacción funciona cuando está presente la mutación (CA, control positivo, homocigota para la mutación G551D) y que no amplifica nada en ausencia de esa mutación (CB, control negativo, homocigota normal). D- La conclusión de esta prueba es que ningún miembro de la familia es portador de un alelo G551D. E- El ‘doble pico’ implica que la mutación está en estado de heterocigosis. Es decir, había secuencias que en esa posición tenían T (normal) y otras que en esa posición tenían C (mutada). F- Si bien parece plausible que la presencia de esta mutación, en cooperación con el alelo F508, sean lacausa de a fibrosis quística del probando, habría que corroborar que la mutación encontrada no sea un mero polimorfismo. Podría buscarse si consta en los bancos de datos como mutación ‘eficiente’ o como polimorfismo. Es decir, puede discutirse que un cambio en la secuencia normal no debe interpretarse necesariamente como la causa de la diminución de la función del alelo. Podría haber otros cambios que aún no han sido hallados… Ejercicio 4 Introducción. A excepción de los gemelos idénticos, el material genético de cada individuo es único. Se ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren aproximadamente en uno cada 500 nucleótidos. Si el genoma humano contiene 3 109 bases, existen entonces, 6 109 bases diferentes entre dos personas ii . Esa variabilidad interindividual _ _ 2 8 puede ser estudiada a nivel fenotípico, es decir, a través del producto génico, o a nivel genotípico mediante el análisis directo del ADN. Uno de los objetivos del estudio de la variabilidad humana de interés cada vez mayor con el curso de los años, es su aplicación en pruebas de paternidad y otras relaciones genéticas y para la identificación de seres humanos involucrados en hechos delictivos, ya sea como víctimas o criminales. Con esos objetivos, la identificación se realizaba inicialmente con análisis morfológicos, bioquímicos e inmunológicos, correspondientes éstos últimos a productos de genes ubicados en una fracción del genoma menor del 10%. Quedaba así un 90% de ADN, no codificante, cuyo potencial para el estudio de la variabilidad humana empezó a ser descubierto a partir de los años 80, cuando se reconoció que estaba repleto de polimorfismos de secuencia que fueron puestos en evidencia con el uso de las enzimas de restricción y los fragmentos de longitud variable que éstas generaban (RFLP)iii. El genoma humano nuclear extragénico está constituido por secuencias únicas y repetidas. Un subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las secuencias repetidas en tándem, que constituyen un ADN altamente polimórfico y que abrieron nuevas posibilidades, inimaginables para la identificación de marcadores con elevado poder de discriminacióniv El ADN repetitivo en tándem está constituido por secuencias que no incluyen genes funcionales y que se disponen en arreglos de repeticiones, una al lado de la otra y cada una de ellas contiene una secuencia central básica Se clasifican de acuerdo al tamaño promedio del arreglo en: ADN satélite, ADN minisatélite y ADN microsatélite (Figura 1). De estos tipos de ADN, el minisatélite y el microsatélite son los que mayor importancia tienen hoy día para resolver problemas en identificación humana y pruebas de paternidad. Los loci más variables descubiertos en el genoma humano son las secuencias minisatélites, conocidas como regiones hipervariables y posteriormente, como repeticiones en tandem de número variable (VNTR). Su hipervariabilidad es debida a la diversidad en el número de reiteraciones de Figura 1. Repeticiones en tándem de número variable: determinadas secuencias de nucleótidos las mini y microsatélites cuales para estos loci, oscilan entre 7 y unos 30 nucleótidos. Existen grandes similitudes en las secuencias de la unidad central que se repite en un gran número de minisatélites. Esta similaridad le sugirió a Alec Jeffreys, en Inglaterra, que si se empleaban sondas que contuvieran repeticiones de esa unidad central se podrían detectar fragmentos de ADN de longitud variable a través del método de transferencia de Southern y producir, para cada individuo un patrón específico de bandas de ADN al cual denominó "DNA fingerprinting" o huella digital de ADN Metodología. Este proceso involucra la digestión del ADN por una enzima de restricción, seguida por la separación de los fragmentos mediante una electroforesis, transferencia del ADN y la hibridación con una sonda marcada que reconoce la unidad repetitiva (Southern propiamente dicho). La identificación de individuos, mediante el análisis de ADN, se basa en el alto nivel de polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un número muy alto de genotipos posibles, a diferencia de los sistemas biológicos de identificación clásicos proteicos, tales como enzimas, grupos sanguíneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prácticamente en cada caso Otra ventaja del análisis del ADN con respecto a los marcadores proteícos, es su ubicuidad, ya que puede aplicarse en cualquier célula nucleada y es muy resistente a la degradación Con las sondas multilocus o con una batería de 5 a 6 sondas unilocus, con heterocigosis de alrededor del 90%, el poder de exclusión puede llegar a 99,99%. 24 ; 16 1v5 18 3 9 Problema. Los casos 1 y 2, que se muestran más abajo, intentan determinar si un individuo que alega ser el padre de un niño es su padre biológico. A tal fin se ha analizado los VNTR de un locus de minisatélite con la metodología descripta previamente. A- Explique por qué el patrón de bandas de cada individuo consta de dos bandas B- Teniendo en cuenta los patrones de bandas ¿Qué conclusiones puede sacar en cada uno de los casos acerca del lazo biológico entre el padre** y el niño? C- Las conclusiones obtenidas con esta prueba ¿Son un 100% certeras? Discutir A- Cada individuo posee copias de un VNTR dado, uno proveniente del cromosoma materno y otro del cromosoma paterno, casi siempre diferentes en el número de repeticiones que poseen. A esas dos variantes por individuo se corresponden las dos bandas observadas. B- El CASO 1 es compatible con una exclusión de paternidad biológica ya que el hijo posee una variante que no está presente en el genoma del individuo que alega ser el padre, en tanto que la otra variante que posee el niño se corresponde con una presente en el genoma materno. El CASO 2 es compatible con la paternidad biológica ya que de las dos variantes que posee el niño, una se corresponde con una variante materna y la otra con una variante paterna. C- Este ítem sirve para discutir que con el análisis de un único locus de VNTR, como en este caso, las conclusiones distan de la certeza. Esto se debe a que una variante particular puede estar presente, por azar, en dos individuos no relacionados (pensar CASO 2, por ejemplo). Del mismo modo, una variante nueva puede surgir por mutación de la línea germinal y un individuo podría tener una variante no presente en ninguno de sus padres (pensar en CASO 1). Por esta razón en las pruebas de identificación deben analizarse varios loci de VNTR ubicados en cromosomas distintos, y esto mismo es lo que les otroga una confianza que puede llegar al 99,99% Ejercicio 5 Determine para cada uno de los siguientes casos si haría alguna prueba molecular para realizar el diagnóstico. En caso afirmativo, diga cuál es la prueba que considera más adecuada, y describa brevemente como discrimina un diagnóstico positivo de uno negativo. 10 1- Enfermedad monogénica con gen identificado. La mutación más frecuente es una sustitución (A por T) en una posición puntual. 2- Enfermedad monogénica con patrón de herencia ligado al X recesivo y gen no descripto. 3- Enfermedad autosómica dominante con gen identificado. Una de las mutaciones más frecuentes es una inserción de un par de bases en una posición particular. 4- Enfermedad autosómica dominante con gen conocido. El mecanismo mutacional implica expansión de tripletes. 5- Enfermedad multifactorial. Algunos de los genes involucrados se conocen 6- Enfermedad cromosómica. Translocación robertsoniana entre el cromosoma 14 y el 21 1-PCR alelo específica 2-No se puede hacer diagnóstico molecular 3- PCR 4- Southern blot o PCR 5- No corresponde 6-No corresponde (aquí hay que hacer prueba citogenética) i Carango P, et al. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (MDPK) mRNA as a result of a triplet repeat expansion in myotonic dystrophy. Genomics 1993; 18: 340-348. ii Pena, S.D.J, et al. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: 555-564, 1995. iii Bohm, I, et al. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA fingerprinting: State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basiléia, Birkhäuser Verlag, 1993, pp. 257-260. iv Stratan, T. The human genome BIOS Scientific publishers,1972, p. 160. v Jeffreys, A.J., et al. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of family relationship, determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: 824-840,1991. 11