20 Aislamiento y manipulación de genes TEXTO Preguntas clave - ¿Cómo se puede aislar y amplificar un gen mediante clonación? - ¿Cómo se pueden identificar DNAs o RNAs específicos en mezclas? - ¿Cómo se puede amplificar DNA sin clonarlo? - ¿Cómo se utiliza el DNA amplificado en la genética? - ¿Cómo se puede aplicar la tecnología del DNA a la medicina? Esquema 20.1 Generación de moléculas de DNA recombinantes 20.2 Amplificación de DNA in vitro: la reacción en cadena de la polimerasa 20.3 Determinación de la secuencia de bases de un segmento de DNA 20.4 Análisis genético directo mediante clonación posicional 20.5 Detección de alelos causantes de enfermedades humanas: diagnóstico mediante genética molecular 20.6 Ingeniería genética Las plantas y animales domesticados proceden de la selección artificial realizada por el hombre sobre caracteres deseables que se pueden encontrar en las poblaciones naturales. La revolución agrícola, que tuvo lugar hace más de 10 000 años, fue impulsada por los 1 primeros agricultores que escogieron sembrar semillas de plantas que expresaban ciertos caracteres que incrementarían su valor como fuente de alimento. Un ejemplo de uno de estos caracteres en la domesticación de varias especies de plantas es la retención de las semillas. Las semillas de las plantas salvajes normalmente se caen de las plantas (el llamado desgrane), de manera que la descendencia es dispersada lejos del progenitor. En cambio, las semillas de muchas plantas de cultivo no se desgranan y son, por tanto, cosechadas más fácilmente. No es difícil imaginar una situación en que una antigua tribu estaba recogiendo semillas para alimentarse y encontró un individuo o población que retenía las semillas. No sólo se comerían estas semillas, sino que las guardarían y plantarían. El desgrane es uno de los muchos caracteres que han transformado las especies salvajes en cultivos domesticados. A veces, esta transformación ha sido tan drástica que es (pág. 715) (pág. 716) difícil identificar el progenitor salvaje de un determinado cultivo. Uno de estos casos es el maíz, que aunque es una gramínea, no se parece a ninguna especie de gramínea existente. En 1939, George Beadle propuso que, a pesar de las evidentes diferencias morfológicas, el progenitor más probable del maíz es una gramínea llamada teosinte, que aún crece en estado salvaje en México (Figura 20-1). ¿Cómo fueron capaces los primeros agricultores de provocar la transformación radical del teosinte en maíz? Como veremos, utilizando las técnicas descritas en este capítulo, los genetistas han aislado uno de los genes más importantes de esta transformación. Los genes, como los que fueron seleccionados por los humanos en la domesticación de plantas y animales, son el principal elemento de estudio de los genetistas, y por tanto, es claramente necesario ser capaz de aislar un gen de interés (o 2 cualquier región del DNA) en un genoma y amplificarlo para obtener una cantidad suficiente para su estudio. La tecnología del DNA es un término que se utiliza para describir el conjunto de técnicas para obtener, amplificar y manipular fragmentos específicos del DNA. Desde la mitad de los años setenta, el desarrollo de la tecnología del DNA ha revolucionado el estudio de la biología, abriendo muchas áreas de estudio a la investigación molecular. La ingeniería genética, la aplicación de la tecnología del DNA a problemas biológicos, médicos o agrícolas específicos, es actualmente una rama bien establecida de la tecnología. La genómica es la extensión de esta tecnología al análisis global de los ácidos nucleicos presentes en un núcleo, una célula, un organismo o un grupo de especies relacionadas (véase el Capítulo 13). En este capítulo, veremos como las técnicas de la tecnología del DNA y la genómica, junto con los métodos presentados en los Capítulos 2 y 4, pueden ser utilizados para aislar e identificar un gen. 20.1 Generación de moléculas de DNA recombinantes ¿Cómo se pueden aislar cantidades suficientes de determinados segmentos de DNA? Esta tarea podría parecer de entrada como encontrar una aguja en un pajar. Se produjo un avance decisivo cuando los investigadores consiguieron crear las grandes cantidades de DNA que necesitaban engañando a la maquinaria de replicación de DNA para que replicara el segmento en cuestión. Esta replicación se podía realizar dentro de células bacterianas vivas (in vivo) o en un tubo de ensayo (in vitro). El método in vitro se explicará en la Sección 20.2. En el método in vivo, un investigador empieza con una muestra de moléculas de DNA que contenga el gen de interés. Esta muestra se denomina DNA donante y con frecuencia es un genoma entero. Fragmentos de este DNA donante son insertados dentro de cromosomas “accesorios” no esenciales (tales como plásmidos o virus 3 bacterianos modificados). Estos cromosomas accesorios serán “portadores” del gen de interés y lo amplificarán, y de ahí que sean llamados vectores. Primero, las largas moléculas de DNA donante se cortan en cientos o miles de fragmentos de una medida más manejable. A continuación, cada fragmento es fusionado con un cromosoma vector cortado para formar moléculas de DNA recombinante. Las moléculas de DNA recombinante se introducen dentro de células bacterianas y, generalmente, sólo una molécula recombinante es aceptada en cada célula. Como el cromosoma accesorio se amplifica normalmente por replicación, la molécula recombinante será amplificada de manera similar durante el crecimiento y la división de la célula bacteriana en que se encuentra. Este proceso resulta en un clon de células idénticas, en que cada una contiene la molécula de DNA recombinante, y por tanto, esta técnica de amplificación se llama clonación de DNA. El siguiente paso es encontrar el clon que contiene el DNA de interés, que estará presente en muy baja frecuencia. Para ilustrar como se genera el DNA recombinante, examinaremos la clonación del gen de la insulina humana, una hormona proteica utilizada en el tratamiento de la diabetes. La diabetes es una enfermedad en que los niveles de azúcar en la sangre son anormalmente altos debido a que el cuerpo no produce suficiente insulina (diabetes tipo I) o a que las células son incapaces de responder a la insulina (diabetes tipo II). En casos leves de diabetes tipo I, (pág. 716) (pág. 717) la enfermedad se puede tratar mediante restricciones dietéticas, pero para muchos pacientes son necesarios tratamientos diarios con insulina. Hasta hace 20 años, las vacas eran la principal fuente de insulina. La proteína se obtenía de los páncreas de animales sacrificados en el matadero y era purificada a gran escala para eliminar la mayor parte de proteínas y otros contaminantes presentes en los extractos de páncreas. Entonces, en 4 1982, salió al mercado la primera insulina humana recombinante. La insulina humana se podía fabricar en una forma más pura, a un coste más bajo y a escala industrial porque era producida en bacterias mediante técnicas de DNA recombinante. La insulina recombinante se encuentra en una mayor proporción dentro de las proteínas de la célula bacteriana que en el caso de la insulina bovina, de manera que la purificación de proteínas es mucho más fácil. En este capítulo, seguiremos los pasos generales necesarios para producir cualquier DNA recombinante y los aplicaremos al caso de la insulina. Tipos de DNA donante La elección del DNA que se utilizará como donante podría parecer obvia, pero de hecho hay tres posibilidades. - DNA genómico. Este DNA es obtenido directamente de los cromosomas del organismo estudiado. Es la fuente de DNA más sencilla. El DNA cromosómico necesita ser cortado para que la clonación sea posible. - cDNA. El DNA complementario (cDNA) es una versión en DNA de doble cadena de una molécula de mRNA. En eucariotas superiores, el mRNA es más útil que una secuencia genómica para predecir una secuencia de polipéptidos, porque los intrones ya han sido eliminados. Los investigadores prefieren utilizar cDNA en lugar del propio mRNA porque los RNAs son intrínsecamente menos estables que el DNA y porque no existen técnicas rutinarias para amplificar y purificar una molécula de RNA en particular. El cDNA se sintetiza a partir de mRNA utilizando una enzima especial llamada transcriptasa inversa, aislada originalmente en los retrovirus. Utilizando una molécula de mRNA como molde, la transcriptasa inversa sintetiza 5 una molécula de DNA de cadena simple que entonces puede ser usada como molde para la síntesis de DNA de doble cadena. El cDNA no necesita ser cortado para poder ser clonado. - DNA sintetizado químicamente. A veces, un investigador necesita incluir en una molécula de DNA recombinante una secuencia específica que, por alguna razón, no puede ser aislada a partir de los DNAs genómicos o cDNAs naturales disponibles. Si la secuencia de DNA es conocida (con frecuencia porque existe una secuencia de genoma completo), el gen puede ser sintetizado químicamente usando técnicas automatizadas. Para crear bacterias que expresen insulina humana, el cDNA fue la elección inicial porque las bacterias no poseen la habilidad de eliminar los intrones presentes en el DNA genómico. Además, debido a un fenómeno llamado sesgo en el uso de codones, el cDNA humano tuvo que ser modificado químicamente para que pudiera ser expresado óptimamente en bacterias. El sesgo en el uso de codones proviene de la degeneración del código genético (el hecho que ciertos aminoácidos son codificados por múltiples codones; véase la Figura 9-6). Por ejemplo, el código genético incluye seis codones leucina y cuatro codones serina. El sesgo se refiere a la preferencia de un organismo por uno o más codones para un aminoácido concreto. Para fabricar grandes cantidades de insulina humana, el cDNA humano tuvo que ser modificado químicamente para concordar con el sesgo en el uso de codones de E. coli. Corte del DNA genómico Las largas moléculas de DNA del tamaño de un cromosoma deben ser cortadas en fragmentos de un tamaño mucho más pequeño. Este corte se realiza mediante el uso de 6 enzimas de restricción bacterianas. Estas enzimas cortan en secuencias de DNA específicas llamadas dianas de restricción, y esta propiedad es una de las características principales que hacen que las enzimas de restricción sean idóneas para la manipulación del DNA. Por pura casualidad, cualquier molécula de DNA, sea derivada de virus, moscas o humanos, contiene secuencias diana para las enzimas de restricción. Por lo (pág. 717) (pág. 718) tanto, una enzima de restricción cortará el DNA en un conjunto de fragmentos de restricción determinados por la localización de las diferentes dianas de restricción. Otra propiedad clave de algunas enzimas de restricción es que crean extremos cohesivos o “pegajosos”. Veamos un ejemplo. La enzima de restricción EcoRI (de E. coli) reconoce la siguiente secuencia de seis pares de nucleótidos en el DNA de cualquier organismo: 5’ -GAATTC- 3’ 3’ -CTTAAG- 5’ Este tipo de segmento se denomina secuencia palindrómica, lo que significa que ambas cadenas de DNA tienen la misma secuencia de nucleótidos pero en orientación antiparalela. Diferentes enzimas de restricción cortan en diferentes secuencias palindrómicas. A veces los cortes están en la misma posición en ambas cadenas antiparalelas, pero las enzimas de restricción más útiles son las que hacen cortes desfasados o escalonados. Por ejemplo, la enzima EcoRI hace cortes solamente entre los nucleótidos G y A en cada cadena del palíndrome: ↓ 5’ -GAATTC- 3’ 7 3’ -CTTAAG- 5’ ↑ Estos cortes escalonados dejan un par de extremos cohesivos idénticos de cadena simple de cuatro bases de longitud. Los extremos se llaman cohesivos porque, al ser de cadena simple, pueden aparearse (o sea, pegarse) con una secuencia complementaria. Este tipo de apareamiento de cadenas simples a veces se denomina hibridación. La Figura 20-2 (arriba, a la izquierda) representa la enzima de restricción EcoRI realizando un único corte en una molécula de DNA circular como un (pág. 718) (pág. 719) plásmido; el corte abre el círculo, y la molécula lineal resultante tiene dos extremos cohesivos. Ahora puede hibridar con un fragmento de una molécula de DNA diferente con los mismos extremos cohesivos complementarios. Actualmente se conocen decenas de enzimas de restricción con diferentes especificidades de secuencia. Algunas enzimas, como EcoRI o PstI, hacen cortes escalonados, mientras que otras, como SmaI, hacen cortes nivelados y dejan extremos romos. Incluso los cortes nivelados, que carecen de extremos cohesivos, pueden ser utilizados para generar DNA recombinante. Mensaje. Las enzimas de restricción cortan el DNA en fragmentos de un tamaño manejable, y muchos de ellos generan extremos cohesivos de cadena simple que son muy apropiados para producir DNA recombinante. Unión del DNA donante con el vector Normalmente se digieren tanto el DNA donante como el vector con una enzima de restricción que produzca extremos cohesivos complementarios, y entonces se mezclan 8 en un tubo de ensayo para permitir que los extremos cohesivos del vector y del DNA donante se unan entre sí y formen moléculas recombinantes. La Figura 20-3a muestra un DNA de plásmido bacteriano que tiene una única diana de restricción para EcoRI; por tanto, la digestión con esta enzima de restricción convertirá el DNA circular en una molécula lineal con extremos cohesivos. El DNA donante proveniente de cualquier otra fuente, como DNA humano, es también tratado con la enzima EcoRI para producir un conjunto de fragmentos con los mismos extremos cohesivos. Cuando las dos muestras se mezclan bajo las condiciones fisiológicas apropiadas, los fragmentos de DNA de ambos tipos pueden hibridar gracias a la formación de dobles hélices entre sus extremos cohesivos (Figura 20-3b). En la solución existen muchas (pág. 719) (pág. 720) moléculas de plásmido abiertas, así como muchos fragmentos diferentes de DNA donante cortados con EcoRI. Por tanto, el resultado será un conjunto variado de plásmidos recombinados con diferentes fragmentos donantes. En este momento, las moléculas híbridas no tienen todavía un esqueleto azúcar-fosfato unido covalentemente. Sin embargo, esta estructura puede ser sellada mediante la adición de la enzima DNA ligasa, que crea enlaces fosfodiéster en los puntos de unión (Figura 20-3c). El cDNA puede unirse a un vector sólo utilizando la ligasa. También pueden añadirse unos extremos cohesivos cortos a cada extremo del cDNA y del vector. Otra consideración a tener en cuenta en este paso es que, si el gen clonado se debe transcribir y traducir en el hospedador bacteriano, éste debe ser insertado cerca de secuencias reguladoras bacterianas. Así pues, para ser capaz de producir insulina humana en células bacterianas, el gen debe encontrarse adyacente a las secuencias reguladoras bacterianas correctas. 9 Amplificación dentro de una célula bacteriana La amplificación aprovecha diversos procesos genéticos procarióticos, incluyendo los de transformación bacteriana, replicación de plásmidos y crecimiento de bacteriófagos, todos ellos comentados en el Capítulo 5. La Figura 20-4 ilustra la clonación de un segmento de DNA donante. Un único vector recombinante entra en una célula bacteriana y es amplificado mediante la replicación (pág. 720) (pág. 721) que tiene lugar durante la división celular. Generalmente hay muchas copias del vector en cada célula bacteriana. Por tanto, después de la amplificación, una colonia de bacterias normalmente contendrá billones de copias del único inserto de DNA donante que se encuentra fusionado a su cromosoma accesorio. Este conjunto de copias amplificadas del fragmento de DNA donante inicial dentro del vector de clonación es el clon de DNA recombinante. La replicación de moléculas recombinantes explota los mecanismos que la célula bacteriana usa normalmente para replicar el DNA cromosómico. Un requisito básico es la presencia de un origen de replicación del DNA (descritos en el Capítulo 7). Elección de vectores de clonación. Los vectores deben ser moléculas pequeñas para permitir una manipulación cómoda. También deben ser capaces de replicarse prolíficamente en una célula viva para poder amplificar el fragmento donante insertado, y deben tener las dianas de restricción adecuadas en las cuales se pueda insertar el DNA que se quiere clonar. Idealmente, la diana de restricción debería estar presente sólo una vez en el vector porque entonces los fragmentos de restricción del DNA donante se insertarán en una única posición dentro del vector. También es importante tener una manera de identificar y recuperar la molécula recombinante con rapidez. Actualmente se 10 utilizan un gran número de vectores de clonación según los diferentes tamaños de inserto o los diferentes usos del clon. A continuación se explican las características de diversas clases generales de vectores de clonación. Plásmidos. Como se ha descrito anteriormente, los plásmidos bacterianos son pequeñas moléculas circulares de DNA que replican su DNA independientemente del cromosoma bacteriano. Los plásmidos usados rutinariamente como vectores son los que llevan genes que confieren resistencia a fármacos. Estos genes proporcionan un método práctico para seleccionar las células transformadas por los plásmidos: aquellas células que aún estén vivas después de la exposición al fármaco deben poseer el vector plasmídico que contiene el inserto de DNA. La Figura 20-5 ilustra como las características de un vector, llamado pUC18, permiten la detección de plásmidos que contienen DNA insertado. Bacteriófagos. Diferentes clases de bacteriófagos pueden contener insertos de DNA donante de diferentes tamaños. Un bacteriófago concreto puede albergar una cantidad estándar de DNA como inserto “empaquetado” dentro de la partícula de fago. El bacteriófago λ (lambda) es un vector de clonación efectivo para insertos de DNA de doble cadena de hasta 15 kb. Las cápsides de fago λ pueden empaquetar moléculas de DNA de hasta 50 kb de longitud (el tamaño de un cromosoma λ normal). La parte central del genoma del fago no es necesaria para la replicación y el empaquetamiento de moléculas de DNA de λ en E. coli y por tanto puede ser cortada mediante enzimas de restricción y desechada. La parte central delecionada puede ser entonces sustituida por insertos de DNA donante. El inserto tendrá de 10 a 15 kb de longitud, pues un inserto de esta medida hace que la longitud total del cromosoma sea de nuevo las 50 kb normales. 11 Tal como muestra la Figura 20-6, las moléculas recombinantes pueden ser directamente empaquetadas dentro de cápsides del fago in vitro y luego introducidas en la bacteria. Alternativamente, las moléculas recombinantes pueden ser transformadas directamente en E. coli. En cualquier caso, la presencia de calvas de fago en el confluente bacteriano indica automáticamente la presencia de fagos recombinantes que llevan un inserto. Vectores para insertos de DNA de mayor tamaño. Los vectores estándar como los plásmidos o el fago λ descritos anteriormente pueden aceptar DNA donante de tamaños hasta 25 ó 30 kb. Sin embargo, muchos experimentos requieren insertos de tamaños muy por encima de este límite superior. Para satisfacer esta necesidad, se han creado los siguientes vectores especiales. En cada caso, después de que los DNAs se hayan introducido en la bacteria, los vectores se replican como plásmidos grandes. Los cósmidos son vectores que pueden contener insertos de 35 a 45 kb. Son híbridos creados a partir de DNA de fago λ y de plásmido bacteriano. Los cósmidos se insertan dentro de partículas de fago λ, que actúan como “jeringas” para introducir estos grandes trozos de DNA recombinante dentro de células receptoras de E. coli. El componente plasmídico del cósmido proporciona las secuencias necesarias para su replicación. Cuando ya se encuentran (pág. 721) (pág. 722) dentro de la célula, estos híbridos forman moléculas circulares que se replican extracromosómicamente del mismo modo que los plásmidos. Los vectores PAC o cromosomas artificiales de P1 (del inglés, P1 artificial chromosome) introducen el DNA mediante un sistema similar pero pueden aceptar insertos de entre 80 y 100 kb. En este caso, el vector es un derivado del bacteriófago P1, un tipo de fago que naturalmente 12 tiene un genoma más grande que el de λ. Los BAC o cromosomas bacterianos artificiales (del inglés, bacterial artificial chromosome), derivados del plásmido F, pueden contener insertos de 150 a 300 kb (Figura 20-7). El DNA que se quiere clonar se inserta dentro del plásmido, y este gran DNA recombinante circular se introduce dentro de la bacteria mediante un tipo especial de transformación. Los BACs son los vectores utilizados para la clonación a gran escala requerida en los proyectos de secuenciación de genomas (comentados en el Capítulo 13). Finalmente, los insertos mayores de 300 kb necesitan un vector eucariótico llamado YAC o cromosoma artificial de levadura (del inglés, yeast artificial chromosome). Para construir un YAC, se añaden a un plásmido un centrómero y orígenes de replicación de un cromosoma de levadura. El plásmido es linealizado, pasándolo de una forma circular a una lineal y se le añade DNA de telómeros de levadura. Esta construcción se comporta como un pequeño cromosoma de levadura durante la mitosis y la meiosis. Para clonar el gen de la insulina humana, se seleccionó un plásmido adecuado para que portase los insertos relativamente cortos de cDNA de aproximadamente 450 pb. Este vector era un tipo especial de plásmido llamado vector de expresión. Los vectores de expresión contienen promotores (pág. 722) (pág. 723) bacterianos que inician la transcripción a altos niveles cuando se añade al medio de cultivo el regulador alostérico apropiado. Por tanto, el vector de expresión inducirá la producción de grandes cantidades de insulina humana recombinante en cada bacteria que contenga el plásmido. Entrada de las moléculas recombinantes en la célula bacteriana 13 Las moléculas de DNA foráneo pueden entrar en una célula bacteriana básicamente mediante dos rutas: transformación y transducción (Figura 20-8). En la transformación, las bacterias se bañan en una solución que contiene la molécula de DNA recombinante, la cual entra en la célula y pasa a comportarse como un plásmido (Figura 20-8a). En la transducción, la molécula recombinante se combina con proteínas de la cápside y la cola de un fago. Entonces, estos fagos manipulados se mezclan con las bacterias e inyectan su carga de DNA dentro de las células bacterianas. El resultado de la inyección puede ser la introducción de un nuevo plásmido recombinante (Figura 20-8b) o la producción de una progenie de fagos portadores de la molécula de DNA recombinante (Figura 208c), dependiendo del vector utilizado. En este último caso, las partículas libres de fago resultantes infectan a las bacterias cercanas. Cuando se usa el fago λ, a través de ciclos repetidos de infección, se forma una calva llena de partículas de fago a partir de cada bacteria infectada inicial. Cada partícula de fago en una calva contendrá una copia del cromosoma λ recombinante original. Recuperación de las moléculas recombinantes amplificadas El DNA recombinante empaquetado dentro de partículas de fago se puede obtener fácilmente recogiendo el lisado celular resultante y aislando el DNA que contiene. Para los plásmidos, las bacterias se rompen química o mecánicamente. El DNA del plásmido recombinante se puede separar del cromosoma bacteriano principal, que es mucho mayor, por centrifugación, electroforesis u otras técnicas selectivas. Mensaje. La clonación de genes se realiza a través de la introducción de vectores recombinantes únicos dentro de células bacterianas receptoras, seguida de la 14 amplificación de estas moléculas como resultado de la tendencia natural de estos vectores a replicarse. (pág. 723) (pág. 724) Construcción de genotecas genómicas y de cDNA Hasta este momento se ha visto cómo construir y amplificar moléculas concretas de DNA recombinante. Sin embargo, cualquiera de estos clones representa sólo una pequeña parte del genoma de un organismo o una de las miles de moléculas de mRNA que un organismo puede sintetizar. Para asegurarse de que se ha clonado el segmento de DNA de interés, se tienen que crear grandes colecciones de segmentos de DNA que lo incluyan todo. Por ejemplo, se toma todo el DNA de un genoma, se corta en segmentos del tamaño correcto para el vector de clonación que se usará, y se inserta cada segmento en una copia diferente del vector, de manera que se crea una colección de moléculas de DNA recombinantes que, tomadas en conjunto, representan el genoma completo. Entonces estas moléculas son transformadas o transducidas en células bacterianas receptoras donde serán amplificadas en células separadas. La colección resultante de bacterias o bacteriófagos portadores del DNA recombinante se denomina genoteca genómica. Si se utiliza un vector que acepta insertos de un tamaño medio de 10 kb y la medida del genoma completo es de 100 000 kb (aproximadamente el tamaño del genoma del nematodo Caenorhabditis elegans), entonces 10 000 clones recombinantes independientes contendrán el DNA equivalente a un genoma. Para asegurarse de que todas las secuencias del genoma que puedan ser clonadas están representadas dentro de la colección, las genotecas genómicas normalmente contienen un segmento determinado del genoma repetido al menos cinco veces (y por tanto, en nuestro ejemplo, habrá 50 000 clones independientes en la genoteca genómica). Esta representación múltiple hace 15 que sea altamente improbable que, por casualidad, una secuencia no se encuentre al menos una vez en la genoteca. Del mismo modo, las colecciones representativas de insertos de cDNA requieren decenas o cientos de miles de clones de cDNA independientes. Estas colecciones son genotecas de cDNA y representan solamente las regiones codificadoras de proteínas del genoma. Una genoteca de cDNA exhaustiva estaría basada en muestras de mRNA de diferentes tejidos, diferentes fases del desarrollo y organismos que hayan crecido en diferentes condiciones ambientales. La elección sobre si construir una genoteca de DNA genómico o de cDNA depende de cada situación. Si se busca un gen específico que es activo en un determinado tipo de tejido en una planta o animal, entonces lo más lógico es construir una genoteca de cDNA de una muestra de ese tejido. Por ejemplo, suponga que queremos identificar cDNAs correspondientes al mRNA de la insulina. Las células de los islotes B del páncreas son la fuente más abundante de insulina, y por tanto, los mRNAs de células del páncreas serán el material apropiado para hacer una genoteca de cDNA, ya que estos mRNAs deberían contener el gen en cuestión en mayor proporción. Una genoteca de cDNA representa un subconjunto de las regiones transcritas del genoma y, por tanto, será inevitablemente más pequeña que una genoteca genómica completa. Aunque las genotecas genómicas son mayores, éstas tienen la ventaja de contener los genes en su estado nativo, incluyendo intrones y secuencias reguladoras que no se transcriben. Una genoteca genómica casi siempre es necesaria en las etapas previas a la clonación de un gen completo o de un genoma en su totalidad. 16 Mensaje. La tarea de aislar un clon de un gen específico empieza con la construcción de una genoteca de DNA genómico o de cDNA, si es posible, enriquecida en secuencias que contengan el gen en cuestión. Búsqueda de un clon específico La construcción de una genoteca como se acaba de describir a veces se denomina clonación “al azar” porque el investigador clona una muestra grande de fragmentos con la esperanza de que uno de los clones contenga el gen deseado. El problema entonces es encontrar ese clon en particular. Búsqueda de clones específicos mediante el uso de sondas. Una genoteca puede contener cientos o miles de fragmentos clonados. Esta gran colección de fragmentos debe ser rastreada para encontrar la molécula de DNA recombinante que contiene el gen de interés (pág. 724) (pág. 725) para el investigador. Este rastreo se puede efectuar utilizando una sonda específica que marcará únicamente el clon deseado. Existen dos tipos de sondas: (1) las que reconocen una secuencia de ácidos nucleicos específica y (2) las que reconocen una proteína específica. Sondas para encontrar una secuencia de DNA. El uso de sondas para el DNA se basa en la complementariedad de bases. Dos ácidos nucleicos de cadena simple con secuencias de bases complementarias total o parcialmente se “encontrarán” una a otra en una solución por colisión al azar. Después de unirse, forman un híbrido estable de doble cadena. Esta propiedad del DNA ha proporcionado un procedimiento muy valioso 17 para encontrar secuencias de interés específicas. El uso de sondas para el DNA requiere que todas las moléculas se conviertan en moléculas de cadena simple mediante calor. Una sonda de cadena simple, marcada radioactiva o químicamente, encontrará su secuencia diana complementaria en una población de DNAs como, por ejemplo, una genoteca. Sondas pequeñas de tan sólo 15 o 20 pares de bases hibridarán con secuencias complementarias específicas dentro de DNAs clonados mucho mayores. Así pues, se pueden considerar las sondas como un “cebo” para identificar “presas” de mayor tamaño. La identificación de un clon específico en una genoteca es un procedimiento que se realiza en dos pasos (Figura 20-9). Primero, se transfieren las colonias o calvas de la genoteca sembradas en una placa de Petri a una membrana absorbente simplemente extendiendo la membrana sobre la superficie del medio. A continuación se separa la membrana, las colonias o calvas adheridas a la superficie se lisan in situ, y se desnaturaliza el DNA. En segundo lugar, la membrana se sumerge en una solución con una sonda de cadena simple específica para el DNA buscado. Generalmente, la sonda es a su vez un trozo de DNA clonado que tiene una secuencia homóloga a la del gen deseado. Esta sonda debe estar marcada con un isótopo radioactivo o un fluorocromo. Así, la posición de un clon positivo será detectada por la concentración de señal radioactiva o fluorescente. Para los marcajes radioactivos, la membrana se coloca encima de un fragmento de película para rayos X y la desintegración del radioisótopo produce partículas subatómicas que “exponen” la película, produciendo una mancha negra en la porción de película situada justo encima del punto en que se encuentra concentrado el radioisótopo. Esta película expuesta se llama autorradiografía. Si se utiliza un fluorocromo como marcaje, se expone la membrana a luz de la longitud de 18 onda correcta para activar la fluorescencia del fluorocromo y se toma una fotografía de la membrana para registrar su localización. ¿De donde proviene el DNA para hacer una sonda? El DNA puede proceder de varias fuentes. - DNA complementario de un tejido que expresa el gen de interés a un alto nivel. Para el gen de la insulina, el páncreas sería la elección obvia. - Un gen homólogo de un organismo relacionado. Este método depende de la conservación evolutiva de las secuencias de DNA a lo largo del tiempo. Aunque el DNA de la sonda y el DNA del clon deseado (pág. 725) (pág. 726) podrían no ser idénticos, con frecuencia son suficientemente similares como para inducir la hibridación. El método se suele llamar humorísticamente “clon por teléfono” (en inglés, clone by phone), porque si un investigador puede llamar a un colega que tenga un clon del gen de interés en un organismo relacionado, entonces el trabajo de clonarlo en una nueva especie se vuelve relativamente fácil. - El producto proteico del gen de interés. La secuencia de aminoácidos de parte de la proteína es traducida a la inversa utilizando la tabla del código genético en sentido contrario (de aminoácido a codón), para obtener la secuencia de DNA que codifica la proteína. Entonces se puede diseñar una sonda de DNA sintético que encaje con esa secuencia. Recuerde, sin embargo, que el código genético es degenerado, es decir, la mayoría de los aminoácidos son (pág. 726) (pág. 727) 19 codificados por múltiples codones. Por tanto, hay varias secuencias de DNA posibles que podrían en teoría codificar la proteína en cuestión, pero sólo una de estas secuencias es realmente la del gen que codifica la proteína. Para resolver este problema, se selecciona un tramo corto de aminoácidos con la mínima degeneración posible. Entonces, se diseña un conjunto de sondas mezcladas que contengan todas las secuencias de DNA posibles que pueden codificar esa secuencia de aminoácidos y se utiliza como sonda este “cóctel” de oligonucleótidos. La cadena correcta dentro de este cóctel encontrará al gen de interés. Alrededor de 20 nucleótidos ya proporcionan suficiente especificidad para hibridar con una única secuencia de DNA complementaria en la genoteca. - RNA marcado. Es posible utilizar este tipo de sonda cuando se puede aislar de forma casi pura un conjunto de moléculas idénticas de RNA, como por ejemplo el rRNA. Sondas para encontrar proteínas. Si el producto proteico de un gen es conocido y ha sido aislado en forma pura, entonces esta proteína puede ser utilizada para detectar el clon del gen correspondiente en una genoteca. El proceso, descrito en la Figura 20-10, requiere dos componentes esenciales. Primero, una genoteca de expresión, construida utilizando vectores de expresión. Para construir esta genoteca, se inserta cDNA dentro del vector en el marco de lectura correcto dentro de una proteína bacteriana (en este caso, β-galactosidasa), para que las células que contienen el vector y su inserto produzcan una proteína “de fusión” formada en parte por una traducción del inserto de cDNA y en parte por un fragmento de la β-galactosidasa normal. En segundo lugar, el proceso requiere un anticuerpo para el producto proteico específico del gen de interés. (Un anticuerpo es una proteína sintetizada por el sistema inmune de un animal que se une con gran afinidad a una determinada molécula). Este anticuerpo se utiliza para 20 rastrear la genoteca de expresión en busca de esa proteína. Se extiende una membrana sobre la superficie del medio y se vuelve a separar de manera que sólo algunas de las células de cada colonia queden adheridas a la membrana en las localizaciones correspondientes a sus posiciones en la placa de Petri original (véase la Figura 20-10). Entonces la membrana así “impresa” se seca y se sumerge en una solución con el anticuerpo, que se unirá al rastro de cualquier colonia que contenga la proteína de fusión buscada. Los clones positivos se pueden revelar mediante un anticuerpo secundario marcado que se une al primer anticuerpo. Al detectar la proteína correcta, el anticuerpo identifica el clon que contiene el gen que debe haber sintetizado esa proteína y que, por tanto, contiene el cDNA deseado. Mensaje. Un gen clonado puede ser seleccionado en una genoteca utilizando sondas para la secuencia de DNA del gen o para el producto proteico de ese gen. Sondas para encontrar un ácido nucleico específico en una mezcla. Como se verá más tarde en el capítulo, en el curso de la manipulación de genes y genomas, a menudo es necesario detectar y aislar una molécula de DNA o RNA específica que se encuentra formando parte de una mezcla compleja. El método más extensamente utilizado para detectar una molécula concreta dentro de una mezcla es la transferencia, que empieza con una electroforesis en gel para separar las moléculas de la mezcla. Primero nos fijaremos en el DNA. Una mezcla de moléculas de DNA lineales se deposita dentro de un pocillo en un gel de agarosa, y el extremo del gel donde se encuentra este pocillo se conecta al cátodo de un campo eléctrico. Como las moléculas de DNA tienen cargas, los fragmentos migrarán a través del gel hacia el ánodo a velocidades inversamente proporcionales a su tamaño (Figura 21 20-11). De este modo, los fragmentos de distintos tamaños formarán bandas definidas en el gel. Estas bandas pueden visualizarse tiñendo el DNA con bromuro de etidio, que hace que el DNA emita fluorescencia bajo la luz ultravioleta. El tamaño absoluto de cada fragmento de la mezcla puede ser determinado mediante la comparación de su (pág. 727) (pág. 728) distancia de migración con un conjunto de fragmentos estándar de tamaño conocido. Si las bandas están bien separadas, una banda determinada se puede cortar del gel y la muestra de DNA puede ser purificada. La electroforesis de DNA puede utilizarse tanto con fines diagnósticos (mostrando los tamaños y las cantidades relativas de los fragmentos de DNA presentes) como preparativos (útil para aislar fragmentos específicos de DNA). La digestión de DNA genómico con enzimas de restricción normalmente genera tantos fragmentos que cuando se someten a electroforesis en gel obtenemos como resultado una mancha amplia y difusa de DNA en lugar de bandas discretas. Utilizando una sonda podemos identificar un fragmento específico de la mezcla mediante la técnica desarrollada por E. M. Southern y conocida como transferencia de Southern (Figura 20-12). Al igual que la (pág. 728) (pág. 729) identificación de clones (Figura 20-9), está técnica conlleva obtener una impresión de las moléculas de DNA en una membrana realizando una transferencia del gel a la membrana después de completar la electroforesis. El DNA debe ser desnaturalizado previamente, lo que permite que se pegue a la membrana. A continuación, la membrana es hibridada con la sonda marcada. Una autorradiografía o una fotografía de las bandas fluorescentes revelarán la presencia de cualquier banda en el gel que sea 22 complementaria a la sonda. Si procede, las bandas pueden cortarse del gel y ser procesadas. La técnica de transferencia de Southern puede hacerse extensiva a la detección de una molécula de RNA específica a partir de una mezcla de RNAs fraccionados en un gel. En este caso se denomina transferencia de Northern (gracias al sentido del humor de algún científico), para distinguirla de la técnica desarrollada por Southern para el análisis de DNA. El RNA separado por electroforesis se transfiere a una membrana y se hibrida con una sonda de la misma manera descrita para la técnica de Southern. Una aplicación de la técnica de Northern es determinar si un gen específico se transcribe en un cierto tejido o bajo unas determinadas condiciones ambientales. Por tanto, el DNA clonado tiene muchas aplicaciones utilizado como sonda para detectar un clon específico, un fragmento de DNA o una molécula de RNA. En todos estos casos, nótese que la técnica explota la capacidad que tienen los ácidos nucleicos de secuencia nucleotídica complementaria de encontrarse y unirse entre ellos. Mensaje. Las técnicas de DNA recombinante que dependen de la complementariedad a una sonda de DNA clonado incluyen los sistemas de transferencia e hibridación para la identificación de clones específicos, fragmentos de restricción o mRNAs, así como para la determinación del tamaño de DNAs o RNAs específicos. Búsqueda de clones específicos mediante complementación funcional. En muchos casos, no disponemos de una sonda para el gen con la que empezar, pero tenemos una mutación recesiva en el gen de interés. Si podemos introducir DNA funcional dentro de la especie que lleva este alelo recesivo (véase la Sección 20.6, Ingeniería genética), se podrán detectar clones en una genoteca de bacterias o fagos por su capacidad de 23 restablecer la función eliminada por la mutación recesiva en ese organismo. Este procedimiento se denomina complementación funcional o rescate de mutantes. El esquema general del procedimiento es el siguiente: Construir una genoteca de bacterias o fagos que contenga insertos de DNA donante recombinante del tipo salvaje a+. ↓ Transformar células de la línea celular con la mutación recesiva a– utilizando el DNA de clones individuales de la genoteca. ↓ Identificar los clones de la genoteca que producen células transformadas con el fenotipo a+. ↓ Recuperar el gen a+ del clon bacteriano o fago obtenido. Búsqueda de clones específicos basada en su localización en el mapa genético: clonación posicional. La información sobre la posición de un gen en el genoma permite evitar la ardua tarea de analizar una genoteca completa en busca de un clon de interés. El término clonación posicional puede aplicarse a cualquier método para encontrar un clon específico que haga uso de la información sobre la posición del gen dentro del cromosoma. Para la clonación posicional se requieren dos elementos: - Marcadores genéticos que puedan establecer unos límites dentro de los cuales podría encontrarse el gen. Si es posible, es mejor disponer de marcadores a ambos lados del gen de interés, porque 24 (pág. 729) (pág. 730) así delimitan su posible localización. Estos marcadores pueden ser RFLPs (polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción; del inglés, restriction fragment length polymorphisms), SNPs (polimorfismos de un único nucleótido; del inglés, single nucleotide polymorphisms) u otros polimorfismos moleculares (véanse los Capítulos 4 y 13), incluso podría tratarse de puntos de rotura cromosómicos bien cartografiados (véase el Capítulo 16). - La capacidad de investigar el segmento de DNA continuo que se extiende entre los marcadores genéticos delimitantes. En los organismos modelo, se conocen los genes contenidos en este bloque por la secuencia del genoma (véase el Capítulo 13). A partir de estos genes, se pueden escoger candidatos que podrían ser el gen buscado. En otras especies, se utiliza un proceso conocido como paseo cromosómico para encontrar y ordenar los clones que caigan entre los marcadores genéticos. La Figura 20-13 resume este procedimiento. La idea básica consiste en usar la secuencia del marcador más cercano como sonda para identificar un segundo grupo de clones que solape con el clon que contiene el marcador, pero que se extiendan fuera de él en una de las dos direcciones (hacia el gen diana o alejándose de él). Los fragmentos del extremo del nuevo conjunto de clones pueden ser utilizados como sondas para identificar un tercer grupo de clones que solapen entre ellos en la genoteca genómica. De esta manera, paso a paso, se puede analizar el conjunto de clones que representa la región del genoma que se extiende a partir de un marcador hasta determinar los clones que incluyen el gen diana, quizás mediante el rescate de un mutante en el gen diana. Este proceso se denomina paseo cromosómico porque consiste en una serie de pasos de un clon al siguiente clon adyacente. 25 (pág. 730) (pág. 731) 20.2 Amplificación de DNA in vitro: la reacción en cadena de la polimerasa En el caso de que la secuencia de al menos algunas partes del gen o secuencia de interés sea conocida, éstas se pueden amplificar en un tubo de ensayo en lugar de recurrir a la clonación. Este procedimiento se denomina reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés, polymerase chain reaction). La estrategia básica de la PCR está resumida en la Figura 20-14. El proceso utiliza múltiples copias de un par de cebadores cortos sintetizados químicamente, de 15 a 20 bases de longitud, que se unen cada uno a un extremo diferente del gen o región que se quiere amplificar. Los dos cebadores se unen uno a cada cadena del DNA, con sus extremos 3’ apuntándose el uno al otro. La polimerasa añade bases a estos cebadores y el proceso de polimerización va y viene entre ellos, formando un número de moléculas de DNA de doble cadena que crece exponencialmente. A continuación, veremos el proceso en más detalle. Se empieza con una solución que contiene la fuente de DNA, los cebadores, los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato y una DNA polimerasa especial. El DNA es desnaturalizado mediante calor, lo que resulta en moléculas de DNA de cadena simple. Los cebadores hibridan con sus secuencias complementarias en estas moléculas de DNA de cadena simple cuando se enfría la solución. Una DNA polimerasa especial tolerante al calor replica los segmentos de DNA de cadena simple partiendo de un cebador. La DNA polimerasa conocida como Taq polimerasa, de la bacteria Thermus aquaticus, es la enzima utilizada normalmente. (Esta bacteria generalmente crece en fumarolas termales y por tanto ha desarrollado proteínas que son extremadamente resistentes al calor. Así puede sobrevivir a las altas temperaturas necesarias para desnaturalizar el dúplex de DNA, y que desnaturalizarían e inactivarían la DNA polimerasa de la mayoría de las especies). Esta enzima sintetiza nuevas cadenas 26 complementarias como en la replicación normal del DNA en las células, formando dos moléculas de DNA de doble cadena idénticas a la molécula de doble cadena parental. Estos pasos que llevan a una única replicación del segmento situado entre los dos cebadores representan un ciclo. (pág. 731) (pág. 732) Después de completar la replicación del segmento entre los dos cebadores, los dos nuevos dúplex se desnaturalizan de nuevo al calentarse para generar moldes de cadena simple, y se lleva a cabo un segundo ciclo de replicación bajando la temperatura en presencia de todos los componentes necesarios para la polimerización. La repetición de ciclos de desnaturalización, unión y síntesis resulta en un aumento exponencial en el número de segmentos replicados. Se pueden conseguir amplificaciones de un millón de veces en 1 ó 2 horas. La gran ventaja de la PCR es que se necesitan menos procedimientos en comparación con la clonación porque la localización de los cebadores determina la especificidad del segmento de DNA que es amplificado. Si las secuencias que corresponden a los cebadores están presentes sólo una vez en el genoma y están suficientemente juntas (a una distancia máxima de unas 2 kb), el único segmento de DNA que puede ser amplificado es el comprendido entre los dos cebadores. Esta amplificación tendrá lugar incluso si el segmento de DNA se encuentra a concentraciones muy bajas (como por ejemplo, una parte en un millón) en una mezcla compleja de fragmentos de DNA como la generada por una preparación de DNA genómico humano. Como la PCR es una técnica muy sensible, tiene muchas aplicaciones en biología. Mientras se usen cebadores específicos, esta técnica permite amplificar secuencias diana presentes en un número de copias extremadamente bajo en una 27 muestra. Por ejemplo, los investigadores de crímenes pueden amplificar segmentos de DNA humano a partir de unas pocas células foliculares alrededor del extremo de un pelo arrancado. Aunque la sensibilidad y especificidad de la PCR representan ventajas obvias, la técnica tiene algunas limitaciones significativas. Para diseñar los cebadores, se debe disponer de información sobre la secuencia de la porción de DNA que se quiere amplificar; si no existe tal información, la PCR no puede aplicarse. Mensaje. La reacción en cadena de la polimerasa utiliza cebadores diseñados especialmente para la amplificación directa en un tubo de ensayo de regiones específicas del DNA. 20.3 Determinación de la secuencia de bases de un segmento de DNA Después de clonar el gen deseado o de haberlo amplificado mediante PCR, empieza la labor de tratar de comprender su función. El lenguaje básico del genoma está compuesto de ristras de los nucleótidos A, T, C y G. Obtener la secuencia nucleotídica completa de un segmento de DNA es normalmente un paso importante para entender la organización de un gen y su regulación, su relación con otros genes o la función del RNA o proteína que codifica. Es más, generalmente, para descubrir la secuencia de aminoácidos de una cadena polipeptídica es más simple traducir la secuencia de ácidos nucleicos de la molécula de cDNA que lo codifica, que secuenciar directamente el propio polipéptido. En esta sección se explicarán las técnicas utilizadas para obtener la secuencia de nucleótidos del DNA. Al igual que la tecnología del DNA recombinante y la PCR, la secuenciación de DNA explota la complementariedad de bases junto con el conocimiento de la 28 bioquímica básica de la replicación del DNA. Se han desarrollado varias técnicas, pero una de ellas es con diferencia la más utilizada. Se llama secuenciación didesoxi o secuenciación Sanger, en honor a su inventor. El término didesoxi proviene de un nucleótido modificado especial llamado didesoxinucleótido trifosfato (genéricamente, ddNTP). Este nucleótido modificado es clave en la técnica de Sanger por su capacidad de bloquear la continuación de la síntesis de DNA. ¿Qué es un didesoxinucleótido trifosfato? ¿Y cómo bloquea la síntesis de DNA? Un didesoxinucleótido carece del grupo 3’-hidroxilo así como del grupo 2’-hidroxilo, también ausente en un desoxinucleótido (pág. 732) (pág. 733) (Figura 20-15). Para que tenga lugar la síntesis de DNA, la DNA polimerasa debe catalizar la reacción de condensación entre el grupo 3’-hidroxilo del último nucleótido añadido a la cadena creciente y el grupo 5’-fosfato del siguiente nucleótido que va a ser añadido, liberando agua y formado un enlace fosfodiéster con el átomo de carbono 3’ del azúcar adyacente. Como un didesoxinucleótido no tiene el grupo 3’-hidroxilo, esta reacción no puede tener lugar, y por tanto la síntesis de DNA queda bloqueada en el punto de adición del didesoxinucleótido. La lógica de la secuenciación didesoxi es muy sencilla. Supongamos que queremos leer la secuencia de un segmento de DNA clonado de, por ejemplo, 5000 pares de bases. Primero, se desnaturalizan las dos cadenas de este segmento. A continuación, creamos un cebador para la síntesis de DNA que hibridará en una única posición dentro del segmento de DNA clonado y entonces añadimos un “cóctel” especial de DNA polimerasa, desoxinucleótidos trifosfato normales (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y una pequeña cantidad de un didesoxinucleótido especial para una de las cuatro bases (por ejemplo, didesoxiadenosina trifosfato, abreviado ddATP). La 29 polimerasa empezará a sintetizar la cadena complementaria de DNA empezando a partir del cebador, pero parará en cualquier punto en que se incorpore un didesoxinucleótido trifosfato a la cadena creciente en lugar del desoxinucleótido trifosfato normal. Supongamos que la secuencia de DNA del segmento que estamos intentando secuenciar es: 5’ ATGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3’ La síntesis de DNA empezaría a partir de un cebador complementario: 5’ ATGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3’ 3’ CGGCCTCGGT 5’ ← Dirección de la síntesis de DNA Utilizando el cóctel especial con ddATP para la síntesis de DNA, se crean una serie de fragmentos de DNA con el mismo punto de inicio pero diferentes puntos finales, ya que los fragmentos acaban en cualquier punto en que la inserción de un ddATP en lugar de dATP detuvo la replicación del DNA. El conjunto de diferentes cadenas de DNA truncadas por el ddATP tiene el aspecto de la lista de secuencias siguiente. (*A indica el didesoxinucleótido.) 5’ ATGGGATAGCTAATTGTTTACCGCCGGAGCCA 3’ Clon de DNA molde 3’ CGGCCTCGGT 5’ Cebador ← Dirección de la síntesis de DNA *ATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 1 30 *AATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 2 *AAATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 3 *ACAAATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 4 *AACAAATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 5 *ATTAACAAATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 6 *ATCGATTAACAAATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 7 *ACCCTATCGATTAACAAATGGCGGCCTCGGT 5’ Fragmento didesoxi 8 Se puede generar esta serie de fragmentos para cada uno de los cuatro posibles didesoxinucleótidos trifosfato en cuatro reacciones separadas (una que incluya ddATP, otra con ddCTP, otra con ddGTP y una última con ddTTP). Cada reacción producirá un conjunto diferente de fragmentos pero en ninguna de las reacciones se producirán fragmentos del mismo tamaño. Es más, si juntamos los resultados de las cuatro reacciones, veremos que (pág. 733) (pág. 734) los fragmentos se pueden ordenar en función de su longitud, con las longitudes aumentando de base en base. Los pasos finales del proceso son: 1. Separar los fragmentos por orden de tamaño mediante electroforesis en gel. Aparecerán en cuatro columnas separadas señaladas como C, A, G y T. 2. Marcar las cadenas sintetizadas de manera que se puedan visualizar después de que se hayan separado según su tamaño por electroforesis. Esto se puede conseguir (pág. 734) (pág. 735) 31 marcando radioactivamente o con fluorescencia bien el cebador (marcaje de iniciación) o los didesoxinucleótidos trifosfato (marcaje de terminación). Los productos de las reacciones de secuenciación con didesoxinucleótidos se muestran en la Figura 20-16. El resultado es una escalera de cadenas de DNA marcadas que aumentan de tamaño una base cada peldaño. Por tanto, todo lo que hay que hacer es leer el gel para leer la secuencia de DNA de la cadena sintetizada en la dirección de 5’ a 3’. Si el marcaje es por fluorescencia y se ha utilizado un fluorocromo de diferente color para cada una de las cuatro reacciones con ddNTP, entonces las cuatro se pueden realizar en el mismo tubo y los cuatro conjuntos de cadenas de DNA pueden cargarse juntos en el mismo carril para hacer la electroforesis. De este modo, se pueden producir cuatro veces más secuencias en el mismo tiempo que si se hacen las reacciones por separado. Esta lógica es utilizada en la detección de fluorescencia en las máquinas de secuenciación automática de DNA. Gracias a estas máquinas, la secuenciación de DNA puede realizarse de forma muy rápida y, aumentando la escala de todos los procesos descritos en esta sección, se pueden obtener secuencias de genomas completos. La Figura 20-17 muestra el resultado obtenido en un secuenciador automático. Cada pico de color representa un fragmento de DNA de diferente tamaño que termina con una base fluorescente detectada por el escáner fluorescente del secuenciador. Los cuatro colores diferentes corresponden a las cuatro bases del DNA. La aplicación a escala genómica de la tecnología de secuenciación automática es uno de los principales puntos tratados en el Capítulo 13. 32 Mensaje. Un segmento de DNA clonado puede ser secuenciado mediante la caracterización de una serie de fragmentos de DNA sintéticos truncados, terminado cada uno en las diferentes posiciones en que ha tenido lugar la incorporación de un didesoxinucleótido. 20.4 Análisis genético directo mediante clonación posicional Gracias a la veloz acumulación de gran cantidad de recursos genómicos (por ejemplo, secuencias genómicas completas, cartografía de polimorfismos en las poblaciones, colecciones de marcadores moleculares), cada vez es más factible el aislamiento de genes basándose únicamente en el conocimiento de su posición en un mapa genético. La estrategia global se denomina clonación posicional y es ilustrada en esta sección mediante dos casos prácticos. (pág. 735) (pág. 736) La potencia de la clonación posicional reside en que tanto mutantes como variantes naturales pueden ser utilizados como puntos de partida para el descubrimiento de genes. En muchos casos, un genetista quiere inspeccionar el genoma en busca de todos los genes que contribuyan en un proceso biológico concreto, por ejemplo, el desarrollo del cerebro. En estos casos, después de mutagenizar una gran población de genomas, el reto es cribar esta colección de individuos e identificar esos pocos con fenotipos que parezcan tener una mutación que afecte el proceso de interés. El paso siguiente para aislar el gen es determinar una posición aproximada del gen mutante en el mapa. Una vez determinada esta posición, ya se puede aplicar la clonación posicional para precisar la localización exacta del gen y, finalmente, su secuencia. Con esta información disponible, el genetista frecuentemente ya puede encontrar qué hay de incorrecto en el gen mutante y cuál es la función normal del gen salvaje. La clonación 33 posicional también ha sido una estrategia efectiva para comprender la base molecular de la variación natural. En el ejemplo presentado más tarde en esta sección, se podrá ver como se está utilizando la clonación posicional para identificar los genes seleccionados por los nativos americanos en la domesticación del maíz a partir del teosinte, su progenitor salvaje. Estos casos pueden ser considerados como genética directa, porque el genetista analiza fenotipos heredables a nivel genético antes de realizar el análisis molecular de mutantes o variantes. Con las técnicas descritas en este capítulo y muchas otras, podemos ver como se lleva a cabo un análisis genético directo, desde el rastreo de mutantes a la identificación molecular de un gen. 1. Normalmente, un análisis genético directo empieza con el genoma salvaje, el cual es mutado al azar con un mutágeno e inspeccionado sistemáticamente en busca de mutaciones que tengan algún fenotipo en común. Este procedimiento se denomina a veces caza de mutantes. Idealmente, el investigador identificará mutaciones en literalmente todos los genes del genoma que puedan ser mutados para producir un fenotipo particular. Entonces, se puede decir que el genoma ha sido saturado por mutaciones de esa clase. Por ejemplo, el rastreo de mutantes fue un primer paso importante en el aislamiento de los genes herramientas de Drosophila (véase el Capítulo 12) 2. Se identifican mutantes causados por mutaciones en un único gen, tal como se describe en el Capítulo 2. 3. Se sitúa el gen en una posición aproximada dentro del cromosoma con el uso de las técnicas descritas en el Capítulo 4. 34 4. Se usan marcadores moleculares ligados al gen para aislar clones de una genoteca ya existente o de una genoteca construida a propósito para el caso que nos ocupa. 5. Como los genomas de los organismos superiores son normalmente muy grandes (el genoma humano, por ejemplo, tiene casi 3000 MB), los marcadores moleculares ligados disponibles podrían estar aún a más de 1 millón de pares de bases del gen de interés. En este caso, estos clones distantes sirven como punto de partida para obtener marcadores moleculares adicionales en la región de interés (véase el Capítulo 4). 6. Se buscan genes candidatos (ORFs) en la secuencia de DNA del clon seleccionado. 7. Se pueden usar una gran variedad de técnicas para determinar cual de los ORFs es el gen diana. Estos pasos se pueden aplicar tanto si está disponible la secuencia completa y anotada del genoma del organismo estudiado como si no. Sin embargo, el proceso es mucho más rápido y simple cuando se conoce la secuencia genómica completa, como es el caso del ejemplo ilustrado en la siguiente sección. Un análisis directo para identificar el gen causante de una enfermedad humana A continuación, se explicarán los métodos usados para identificar la secuencia genómica del gen de la fibrosis quística (FQ). En el momento en que el gen fue aislado no se conocía ningún defecto bioquímico primario, y por tanto se trataba de un caso de un gen en busca de una función. (pág. 736) (pág. 737) Los rastreos genéticos se pueden utilizar para diseccionar cualquier proceso biológico. Su efectividad depende únicamente del ingenio del investigador en el diseño 35 de un protocolo que revele la clase deseada de mutaciones. Sin embargo, los rastreos genéticos no pueden realizarse en seres humanos, porque no se pueden crear mutantes humanos intencionadamente. Por tanto, se realizan análisis de genealogías de grandes familias con la enfermedad (el análisis de genealogías es descrito en el Capítulo 2) cuando se dispone de esta información, para determinar la posición del defecto genético causante de una enfermedad como la fibrosis quística o la enfermedad de Huntington. Los miembros de una familia portadora de la enfermedad tendrán uno o más marcadores moleculares en común que no se encuentran en otras familias (véase una discusión sobre marcadores moleculares en el Capítulo 4). La localización del marcador proporciona la posición aproximada del gen (paso 3 de la lista anterior). El ligamiento a marcadores moleculares había situado el gen FQ en el brazo largo del cromosoma 7, entre las bandas 7q22 y 7q31.1. Se pensaba que el gen FQ se encontraba dentro de esta región, flanqueado por el gen met (un proto-oncogen; véase el Capítulo 15) en un lado y un marcador molecular, D788, en el otro. Pero entre estos dos marcadores, había 1.5 centimorgans (unidades de mapa) de cromosoma, una enorme extensión no cartografiada de más de 1 millón de bases. Para acercarse, era necesario generar más marcadores moleculares dentro de esta región. El método general para aislar marcadores moleculares (descrito en el Capítulo 4) consiste en identificar una región de DNA que sea polimórfica en individuos o poblaciones que difieren en el carácter de interés. Al encontrar marcadores moleculares adicionales ligados al gen FQ, los genetistas redujeron la región que contenía el gen FQ a unas 500 kbp, aún una distancia considerable. Entonces se elaboró un mapa físico completo de esta región; es decir, se colocó en el orden correcto un conjunto al azar de clones de esta región. La ordenación de estos clones requirió el uso de dos técnicas capaces de atravesar esta enorme distancia 36 genética: el paseo cromosómico y una técnica relacionada llamada salto cromosómico. Esta última técnica proporciona un modo de saltar a través de áreas de DNA potencialmente inclonables y genera marcadores ampliamente espaciados a lo largo de la secuencia que pueden ser utilizados como puntos de partida para múltiples paseos cromosómicos bidireccionales. Estos paseos cromosómicos sirven para ordenar los clones tal como se muestra en la Figura 20-13. El salto cromosómico está representado en la Figura 20-18. Finalmente, se secuenció el clon que contenía marcadores moleculares más estrechamente ligados al carácter FQ, y se pudo empezar la búsqueda de todos los genes situados en este fragmento de DNA que contenía tanto secuencias génicas como no codificadoras. Los genes candidatos fueron identificados por ciertas características comunes de los genes, como islas CpG y señales de inicio o terminación (véase el Capítulo 13). En el ejemplo de la FQ, las secuencias de genes candidatos y cDNAs se compararon entre personas sanas y pacientes de FQ. Sólo el gen FQ contenía una mutación en todos los pacientes de FQ analizados. La comparación de la secuencia de un cDNA de este gen candidato en personas sanas y pacientes de FQ reveló una deleción de tres pares de bases en los pacientes de FQ que eliminaba una fenilalanina de la proteína. A su vez, se predijo la estructura tridimensional de la proteína a partir de la secuencia inferida del gen. Esta proteína resultó ser estructuralmente similar a las proteínas de transporte de iones de otros sistemas, lo que sugiere que un defecto en el transporte es la causa principal de la FQ. Cuando se utilizó la secuencia del gen salvaje para transformar líneas celulares mutantes de pacientes de FQ, se restableció la función (pág. 737) (pág. 738) normal, así que este “rescate” fenotípico fue la confirmación final de que la secuencia aislada era de hecho el gen FQ. 37 Los protocolos de paseo y salto cromosómicos son todavía estrategias útiles para la clonación posicional en organismos para los que no se dispone de la secuencia de su genoma. Este era el caso para el genoma humano en 1989 cuando se aisló el gen FQ. Sin embargo, la disponibilidad de la secuencia genómica completa ha disminuido drásticamente el tiempo necesario para identificar un gen de una enfermedad humana haciendo que muchas técnicas laboriosas como el paseo y el salto cromosómico queden obsoletas. En su lugar, las búsquedas informáticas de las bases de datos de la información genómica humana sirven para identificar clones que contienen marcadores moleculares y regiones adyacentes. Además, estas bases de datos incluyen información sobre el contenido de genes de estas regiones (véase el Capítulo 13, en referencia a la anotación), lo que permite a los genetistas identificar uno o más posibles genes candidatos. Uno de estos genes puede ser reconocido como el gen de interés a través del mismo tipo de técnicas utilizadas para identificar el gen FQ, como por ejemplo, la comparación de las secuencias de los genes candidatos entre personas sanas y pacientes de FQ. Un análisis directo para identificar un gen importante en la domesticación del maíz (margen) QUÉ ESTÁN HACIENDO LOS GENETISTAS EN LA ACTUALIDAD Como se ha mencionado al principio del capítulo, George Beadle propuso que, a pesar de las destacadas diferencias morfológicas, la gramínea salvaje teosinte es el ancestro del maíz domesticado moderno. Mediante la realización de miles de cruces genéticos entre maíz y teosinte (cuyos híbridos son interfértiles) Beadle concluyó que tan sólo cinco loci de caracteres cuantitativos (QTL, véanse los Capítulos 3 y 18) de efecto mayor serían suficientes para explicar sus diferencias morfológicas (Figura 20-19). 38 El aislamiento de los genes que transformaron el teosinte en maíz ha sido de gran interés, especialmente para el genetista John Doebley, quien ha escrito que el paso crítico en la domesticación del maíz fue “la liberación del grano de la (pág. 738) (pág. 739) envoltura protectora endurecida que lo envuelve en el teosinte”. Una envoltura dura permite que la semilla de teosinte sea dispersada después de pasar a través del tracto digestivo de un animal sin resultar dañada. Para ser útil como fuente de alimento, sin embargo, una planta necesita tener una semilla expuesta que carezca de envoltura. El QTL responsable de los “granos desnudos de maíz” se denomina tga1 (arquitectura de la gluma del teosinte; del inglés, teosinte glume architecture). Basándose en cruces genéticos, Doebley y sus colegas plantearon la hipótesis de que el alelo del maíz de tga1 (llamado Tga1-maize) produce granos desnudos, mientras que el alelo del teosinte (llamado tga1) produce granos endurecidos. Para aislar el gen tga1, Doebley en primer lugar tuvo que generar una línea de maíz que contuviera la región del cromosoma del teosinte con el alelo de esta especie (esta línea se denominó maize:tga1). En esta situación, se dice que el alelo del teosinte está introgresado en el fondo genético del maíz. [De un modo similar, la región del cromosoma del maíz que contiene Tga1-maize puede ser introgresada en el fondo genético del teosinte (teosinte:Tga1-maize); Figura 20-20]. La línea maize:tga1 sirvió entonces como punto de partida para una estrategia de clonación posicional. En términos generales, la línea maize:tga1 difiere del maíz sólo en que contiene un trozo del cromosoma del teosinte con su alelo tga1 (y varios genes más). Mediante la comparación de los marcadores genéticos en las dos líneas, Doebley fue finalmente capaz de aislar la diferencia entre ellas, es decir, el fragmento de cromosoma de teosinte que contiene varios genes incluido tga1. El último paso, como en la mayoría de 39 estrategias de clonación posicional, consistió en determinar cuál de los genes en esta región era tga1. Y, al igual que en otras estrategias de clonación posicional, esta determinación se basó en un análisis comparativo de las secuencias de los alelos de maíz y teosinte. Este análisis finalmente llevó a Doebley y sus colegas a identificar tga1 como un supuesto factor de transcripción (véase el Capítulo 11) que difería entre el maíz y el teosinte en unos cuantos cambios de pares de bases que incluían una diferencia en un aminoácido. Además, determinaron que las líneas con tga1 tienen más proteína TGA1 en la mazorca en desarrollo que las líneas con Tga1-maize. La investigación continuó hasta demostrar que esta diferencia era debida a una diferencia en las regiones reguladoras del gen que estaban situadas más de 40 kb (40 000 pares de base) aguas arriba del punto de inicio de la transcripción. Este descubrimiento les llevó a formular la hipótesis de que las complejas diferencias entre las semillas recubiertas del teosinte y los granos desnudos del maíz son el resultado de la expresión de variantes alélicas diferentes de tga1. Es decir, el gen del maíz probablemente no es un alelo nulo de tga1 sino una forma alternativa del gen que conduce a una forma alternativa de desarrollo de la mazorca. Las secciones anteriores han introducido las técnicas fundamentales que han revolucionado la genética. Las dos secciones finales de este capítulo se centrarán en la aplicación de estas técnicas al diagnóstico de enfermedades humanas y a la ingeniería genética. 20.5 Detección de alelos causantes de enfermedades humanas: diagnóstico mediante genética molecular 40 En más de 500 enfermedades genéticas humanas, como por ejemplo la alcaptonuria, uno de los factores contribuyentes es un alelo mutante recesivo en un único gen. Para las familias con riesgo de estas enfermedades es importante detectar a los futuros padres heterocigóticos para permitir que puedan ser aconsejados. También es necesario ser capaz de detectar tempranamente la descendencia homocigótica, idealmente en la etapa fetal, para que los médicos puedan aplicar lo antes posible terapias dietéticas o farmacológicas. En el futuro, podría incluso existir la posibilidad de la terapia génica. Los desórdenes dominantes también requieren un diagnóstico genético. Por ejemplo, las personas con riesgo para la enfermedad de Huntington de aparición tardía necesitan saber si son portadoras del alelo de la enfermedad antes de tener hijos. Diversas pruebas ampliamente utilizadas son capaces de detectar alelos defectivos en homocigosis en células fetales. Las células fetales se obtienen del líquido amniótico, se separan de los otros componentes y se cultivan para llevar a cabo el análisis de cromosomas, proteínas, reacciones (pág. 739) (pág. 740) enzimáticas y otras propiedades bioquímicas. Este proceso, la amniocentesis (Figura 20-21), puede identificar un cierto número de desórdenes conocidos. En la Tabla 20-1 se enumeran algunos ejemplos. La biopsia de corion (CVS; del inglés, chorionic villus sampling) es una técnica relacionada en la que se aspira una pequeña muestra de células de la placenta con una jeringa larga. Durante el embarazo la CVS se puede realizar antes que la amniocentesis, que debe esperar al desarrollo de un volumen de líquido amniótico suficiente. Tradicionalmente, estos procedimientos han servido sólo para identificar desórdenes que pueden ser detectados como un defecto químico en las células cultivadas. Sin embargo, con la tecnología del DNA recombinante, se puede analizar el 41 DNA directamente. En principio, el gen fetal causante de la enfermedad podría ser clonado y su secuencia comparada con la de un gen normal clonado para ver si el gen fetal es normal. Sin embargo, este procedimiento sería largo y poco práctico, y por tanto se han concebido métodos más rápidos y sencillos. Por ejemplo, como la PCR permite a un investigador centrarse en cualquier gen deseado, se puede utilizar esta técnica para amplificar y posteriormente secuenciar cualquier fragmento de DNA potencialmente defectivo. En un método aún más simple, se pueden diseñar cebadores que hibriden con el alelo normal y por tanto permitan su amplificación, pero que no hibriden con el alelo mutante. Con esta técnica se pueden diagnosticar enfermedades causadas por la presencia de una mutación específica. Mensaje. La tecnología del DNA recombinante proporciona muchas técnicas sensibles que son útiles para hacer pruebas de detección de alelos defectivos. (pág. 740) (pág. 741) 20.6 Ingeniería genética Gracias a la tecnología del DNA recombinante, los genes se pueden aislar en un tubo de ensayo y caracterizarse como secuencias nucleotídicas específicas. Pero incluso este logro no es el final de la historia. A continuación veremos que el conocimiento de una secuencia es con frecuencia el principio de toda una nueva serie de procesos de manipulación genética. Cuando una secuencia ya está caracterizada, se puede manipular para alterar el genotipo de un organismo. La introducción de un gen alterado en un organismo se ha convertido en un aspecto central de la investigación genética básica, pero también ha encontrado una amplia aplicación comercial. Dos ejemplos de esto último son (1) cabras que secretan en su leche antibióticos derivados de un hongo y (2) plantas protegidas de la congelación por la incorporación en su genoma de genes 42 “anticongelantes” de peces árticos. El uso de las técnicas del DNA recombinante para de este modo alterar el genotipo y fenotipo se denomina ingeniería genética. Las técnicas de ingeniería genética descritas en la primera parte de este capítulo fueron desarrolladas originalmente en bacterias y tuvieron que ser extendidas a los eucariotas modelo, los cuales constituyen una gran proporción de los organismos modelo utilizados en la investigación. Los genes eucariotas normalmente aún se clonan y secuencian en hospedadores bacterianos, pero al final son introducidos en un eucariota, tanto en la misma especie donante original como en otra completamente diferente. El gen transferido se denomina transgén, y el resultado de esta manipulación es un organismo transgénico. El transgén puede ser introducido dentro de una célula eucariota mediante un cierto número de técnicas, incluidas las de transformación, inyección, infección bacteriana o viral y bombardeo con partículas de tungsteno u oro recubiertas de DNA (Figura 20-22). Cuando el transgén entra en una célula, es capaz de viajar al núcleo, donde, para convertirse en parte estable del genoma, debe insertarse en un cromosoma o (sólo en algunas especies) replicarse como parte de un plásmido. Si la inserción tiene lugar, el transgén puede reemplazar al gen endógeno o insertarse ectópicamente, es decir, en otras posiciones en el genoma. Los transgenes de otras especies generalmente se insertan ectópicamente. Mensaje. La transgénesis puede introducir material genético nuevo o modificado dentro de células eucariotas. Ahora pasaremos a ver algunos ejemplos en hongos, plantas y animales, así como algunas tentativas de terapia génica humana. 43 Ingeniería genética en Saccharomyces cerevisiae Es justo decir que S. cerevisiae es el modelo genético eucariótico más sofisticado. Muchas de las técnicas utilizadas en la ingeniería genética eucariótica en general fueron desarrolladas en levaduras, así que explicaremos brevemente las rutas generales de transgénesis en levaduras. Los vectores más simples de levaduras son los plásmidos integradores de levaduras (YIps; del inglés, yeast integrative plasmids), derivados de plásmidos bacterianos en que se ha insertado el DNA de levaduras de interés. Cuando son introducidos por transformación en células de levadura, estos plásmidos se insertan en los cromosomas de levadura, generalmente por recombinación homóloga con el gen endógeno, mediante un entrecruzamiento simple o doble (Figura 20-23). Como resultado, o bien se inserta el plásmido entero o el alelo diana es sustituido por el alelo del plásmido. Esto último es un ejemplo de sustitución génica (en este caso, la sustitución de un gen manipulado por el gen original de la célula de levadura). La sustitución génica puede utilizarse para delecionar un gen o sustituir un alelo mutante por su homólogo salvaje, o, a la inversa, para sustituir (pág. 741) (pág. 742) un alelo salvaje por uno mutante. Estas sustituciones pueden ser detectadas mediante la siembra de las células en un medio que seleccione para un alelo marcador del plásmido. El origen de replicación bacteriano es diferente de los orígenes eucarióticos, por lo que los plásmidos bacterianos no se replican en levaduras. Por tanto, la única manera de que estos vectores puedan generar un genotipo modificado estable es que sean integrados en los cromosomas de levadura. 44 Ingeniería genética en plantas Debido a su importancia económica en la agricultura, muchas plantas han sido objeto de análisis genéticos con la finalidad de desarrollar variedades mejoradas. La tecnología del DNA recombinante ha introducido una nueva dimensión en este empeño porque las modificaciones genómicas posibles mediante esta tecnología son prácticamente infinitas. La diversidad genética ya no se consigue solamente mediante la selección de variantes dentro de una determinada especie. Ahora se puede introducir DNA de otra especie de planta, animal, o incluso de bacterias. En respuesta a estas nuevas posibilidades, un sector de la opinión pública ha expresado su preocupación sobre que la introducción de organismos modificados genéticamente (GMOs; del inglés, genetically modified organisms) en el suministro de comida pueda producir problemas de salud inesperados. La preocupación por los GMOs es una faceta del actual debate público sobre los complejos temas de salud pública, seguridad, ética y educación planteados por las nuevas técnicas genéticas. El sistema del plásmido Ti. Un vector utilizado rutinariamente para producir plantas transgénicas es el plásmido Ti, un plásmido natural derivado de una bacteria del suelo llamada Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria causa lo que se conoce como enfermedad de la agalla de la corona, en que la planta infectada produce crecimientos descontrolados denominados tumores o agallas. Estas agallas normalmente se forman en la base (corona) del tallo de la planta. La clave para la producción de un tumor es un gran plásmido circular de DNA (200 kb), el plásmido Ti o inductor de tumores (del inglés, tumor inducing). (pág. 742) (pág. 743) 45 Cuando la bacteria infecta una célula de la planta, una parte del plásmido Ti es transferida e insertada, aparentemente de forma más o menos aleatoria, en el genoma de la planta hospedadora (Figura 20-24). La región del plásmido Ti que se inserta en la planta hospedadora se conoce como T-DNA o DNA transferido (del inglés, transfer DNA). En la Figura 20-25 se muestra la estructura de un plásmido Ti. Los genes cuyos productos catalizan esta transferencia del T-DNA se encuentran en una región del plásmido Ti separada del propio T-DNA. La región del T-DNA codifica varias funciones interesantes que contribuyen a la capacidad de la bacteria de crecer y dividirse dentro de la célula vegetal. Estas funciones incluyen enzimas que contribuyen a la producción del tumor y otras proteínas que dirigen la síntesis de unos compuestos llamados opinas, que son sustratos importantes para el crecimiento de la bacteria. Una opina importante es la nopalina. De hecho, las opinas son sintetizadas por las células de la planta infectada, que expresan los genes de síntesis de opinas situados en la región TDNA transferida. Las opinas son importadas al interior de las células bacterianas del tumor creciente y metabolizadas por enzimas de la bacteria codificadas por los genes de la utilización de opinas en el propio plásmido Ti. El comportamiento natural del plásmido Ti lo hace muy adecuado para el papel de vector en ingeniería genética de plantas. Si se pudiera empalmar el DNA de interés dentro del T-DNA, entonces el paquete completo se insertaría de forma estable en un cromosoma vegetal. Este sistema ha sido diseñado para funcionar esencialmente de este modo pero con algunas modificaciones necesarias. A continuación, examinaremos un protocolo. Los plásmidos Ti son demasiado grandes para ser manipulados fácilmente y no pueden hacerse más pequeños de un modo sencillo porque contienen pocas dianas de restricción únicas y porque gran parte del 46 (pág. 743) (pág. 744) plásmido es necesario para su replicación o para el proceso de infección y transferencia. Por lo tanto, la modificación de un plásmido Ti se realiza en diversos pasos. Los primeros pasos de clonación tienen lugar en E. coli, con el uso de un vector intermediario considerablemente más pequeño que Ti. El vector intermediario con el transgén se inserta dentro del T-DNA. Este vector intermediario puede entonces recombinar con un segundo plásmido Ti atenuado o “desarmado”, formando un plásmido cointegrado que se puede introducir dentro de una célula vegetal mediante infección y transformación con Agrobacterium. Un elemento importante del plásmido cointegrado es un marcador seleccionable que pueda servir para detectar las células transformadas. La resistencia a la kanamicina es uno de estos marcadores. Tal como muestra la Figura 20-26, las bacterias que contienen el plásmido cointegrado se utilizan para infectar segmentos cortados de tejido vegetal, como discos perforados en una hoja. En las células infectadas, cualquier material genético situado entre las secuencias de T-DNA adyacentes puede insertarse en un cromosoma de la planta. Si los discos de hoja se colocan en un medio que contenga kanamicina, las únicas células vegetales que experimentarán división celular serán aquellas que hayan adquirido el gen kanR introducido en el plásmido cointegrado. Las células transformadas crecen formando una agrupación o callo que puede ser inducida a formar brotes o raíces. Entonces estos callos se transfieren al suelo, donde se desarrollarán como plantas transgénicas (véase la Figura 20-26). Normalmente, se inserta una única copia de la región T-DNA en un determinado genoma, donde segregará en la meiosis como un alelo mendeliano normal (Figura 20-27). La presencia del inserto puede ser verificada mediante el rastreo del tejido (pág. 744) 47 (pág. 745) transgénico en busca de marcadores genéticos transgénicos o la presencia de nopalina, o mediante transferencia de Southern usando una sonda de DNA purificado correspondiente al T-DNA. En la actualidad se utilizan plantas transgénicas portadoras de uno o varios genes foráneos, incluyendo plantas cultivadas portadoras de genes que confieren resistencia a ciertas plagas bacterianas o fúngicas, y se están desarrollando muchas más. Además, no sólo se están manipulando las cualidades de las propias plantas, sino que, como los microorganismos, las plantas también se están utilizando como “fábricas” de producción de proteínas codificadas por genes foráneos. Ingeniería genética en animales La tecnología transgénica se está usando en la actualidad en muchos sistemas animales modelo. Nos centraremos en los tres modelos animales más utilizados en investigación genética básica: el nematodo Caenorhabditis elegans, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y el ratón Mus musculus. En estos sistemas animales también pueden aplicarse versiones diferentes de muchas de las técnicas explicadas hasta ahora. Transgénesis en C. elegans. El método utilizado para introducir transgenes en C. elegans es simple: los DNAs transgénicos se inyectan directamente dentro del organismo, normalmente como plásmidos, cósmidos u otros tipos de DNAs clonados en bacterias. La estrategia de la inyección viene determinada por la biología reproductora del gusano. Las gónadas del gusano son sincitiales, lo que significa que hay muchos núcleos dentro de la misma célula gonadal. Una célula sincitial constituye una gran proporción de un brazo de la gónada, y la otra célula sincitial forma la mayor parte del 48 otro brazo (Figura 20-28a). Estos núcleos no se convertirán en células individuales hasta la meiosis, cuando empiezan su transformación en huevos o esperma. Si se inyecta una solución de DNA en la región sincitial de uno de los brazos, más de 100 núcleos son expuestos al DNA transformante. Por casualidad, unos cuantos de estos núcleos incorporarán el DNA (recuerde, la membrana nuclear se rompe en el curso de la división, y por tanto el citoplasma en el cual se inyecta el DNA se vuelve continuo con el nucleoplasma). Normalmente, el DNA transgénico forma conjuntos extracromosomales de múltiples copias (Figura 20-28b) que existen como unidades independientes fuera de los cromosomas. Ocasionalmente, los transgenes se integrarán en una posición ectópica en un cromosoma, también como un conjunto de copias. (pág. 745) (pág. 746) Desafortunadamente, las secuencias se pueden desordenar dentro del grupo multicopia, lo que complica el trabajo del investigador. Transgénesis en D. melanogaster. La transgénesis en D. melanogaster requiere una técnica más compleja pero evita las dificultades causadas por los grupos de múltiples copias del transgén. Se realiza por un mecanismo diferente de los discutidos hasta este momento, pues se basa en las propiedades de un elemento transponible llamado elemento P y que actúa como vector. Los elementos transponibles son el tema principal del Capítulo 14. Para el propósito que nos ocupa, todo lo que necesitamos saber es que hay dos tipos de elementos P (Figura 20-29a): - Un tipo de elemento, de 2912 pb de longitud, codifica una proteína llamada transposasa que es necesaria para que se puedan mover los elementos P a nuevas 49 posiciones en el genoma. Recuerde que este tipo de elemento es denominado “autónomo” porque puede transponerse a través de la acción de su propia enzima transposasa. - La transposasa ha sido delecionada en el segundo tipo de elemento, que es, por tanto, un elemento no autónomo. Un elemento no autónomo aún puede moverse a una nueva localización genómica si la transposasa es suministrada por un elemento autónomo. El único requerimiento es que el elemento no autónomo contenga los primeros y los últimos 200 pb del elemento autónomo, que incluyen las secuencias que la transposasa necesita para reconocerlo. Además, cualquier DNA insertado entre los extremos de un elemento P no autónomo será también transpuesto. Como con C. elegans, el DNA es inyectado en un sincitio, que en este caso es el embrión de Drosophila en sus primeras etapas de desarrollo (Figura 20-29b). Más concretamente, el DNA es inyectado en el lugar donde se forman las células de la línea germinal, en el polo posterior del embrión. Los adultos que crecen a partir de un embrión inyectado normalmente no expresarán el transgén pero contendrán algunas células germinales transgénicas, y estas células expresarán el transgén en la descendencia. ¿Qué tipo de vector contiene el DNA inyectado? Para producir Drosophila transgénicas, se deben inyectar dos plásmidos bacterianos recombinantes separados. Uno contiene el elemento P autónomo que suministra las secuencias codificadoras de la transposasa. Éste es el plásmido ayudante. El otro es el vector del elemento P y lleva el transgén. Este vector del elemento P contiene un elemento no autónomo modificado formado por los extremos del elemento P y el trozo de DNA clonado que se quiere incorporar como transgén en el genoma de la mosca insertado entre ellos. Una solución 50 de DNA que contenga los dos plásmidos se inyecta en el polo posterior del embrión sincitial, y la transposasa de P expresada a partir del plásmido ayudante inyectado catalizará la inserción del vector del elemento P en el genoma de la mosca. La naturaleza de la reacción enzimática de la transposasa garantiza que una única copia del elemento se inserte en un punto determinado (Figura 20-29c). ¿Cómo se puede detectar la descendencia que se desarrolló a partir de gametos que incorporaron el DNA clonado? Normalmente se detectan porque expresan un alelo transgénico salvaje dominante de un gen para el cual la cepa receptora lleva un alelo mutante recesivo. Como se mencionó en el Capítulo 13, los elementos transponibles son ampliamente utilizados en transgénesis en plantas así como en insectos. Quizás el ejemplo mejor conocido en plantas es el sistema del (pág. 746) (pág. 747) elemento Ac descrito por primera vez en Zea mays (maíz), que ha sido perfeccionado como vector de clonación para transgénesis en muchas plantas. Transgénesis en M. musculus. Los ratones son los modelos más importantes para la genética de mamíferos. Lo más interesante es que mucha de la tecnología desarrollada en ratones es potencialmente aplicable a los humanos. Hay dos estrategias para la transgénesis en ratones, cada una con sus ventajas y desventajas: - Inserciones ectópicas. Los transgenes se insertan al azar en el genoma, generalmente como grupos o conjuntos desordenados formados por múltiples copias del transgén. 51 - Transgenia dirigida. La secuencia transgénica se inserta en una posición del genoma ocupada por una secuencia homóloga. Es decir, el transgén sustituye a la secuencia homóloga equivalente. Inserciones ectópicas. Para insertar transgenes en posiciones al azar, el procedimiento consiste simplemente en inyectar una solución con DNA clonado en bacterias dentro del núcleo de un óvulo fertilizado (Figura 20-30a). Varios óvulos inyectados son depositados en el oviducto de la hembra, donde algunos de ellos se desarrollarán para formar crías de ratón. En una fase posterior, el transgén se integra en los cromosomas de núcleos aleatorios. En algunas ocasiones, las células transgénicas forman parte de la línea germinal, y, en estos casos, el embrión inyectado se convertirá en un ratón adulto cuyas células germinales contienen el transgén insertado en alguna posición dentro de uno de sus cromosomas (Figura 20-30b). Algunos de los descendientes de estos adultos heredarán el transgén en todas sus células. En cada punto de inserción habrá múltiples copias del gen, pero la localización, el tamaño y la estructura de estos grupos de transgenes será diferente cada vez que ocurra una integración. Esta técnica origina algunos problemas: (1) el patrón de expresión de los genes insertados aleatoriamente podría ser anormal (lo que es denominado como efecto de posición) porque el contexto cromosómico local carece de las secuencias reguladoras normales del gen, y (2) pueden tener lugar reordenamientos en el DNA de estos grupos de múltiples copias del transgén (lo que produce, en esencia, mutaciones en las secuencias). Sin embargo, esta técnica es mucho más eficaz y menos laboriosa que la transgenia dirigida. Transgenia dirigida. La transgenia dirigida permite a los investigadores eliminar o modificar la función codificada por un gen. Un alelo mutante se puede reparar a través 52 de una sustitución génica en la cual un alelo salvaje sustituye uno mutante en su misma localización cromosómica. La sustitución génica evita los efectos de posición y los reordenamientos asociados con las inserciones ectópicas, ya que se inserta una sola copia del gen en su contexto cromosómico normal. La transgenia dirigida en el ratón se lleva a cabo en células madre embrionarias (células ES; del inglés embryonic stem cells) cultivadas. En general, una célula madre es una célula indiferenciada de un determinado órgano o tejido que (pág. 747) (pág. 748) Figura (pág. 748) (pág. 749) se divide asimétricamente para producir como descendientes una célula madre y una célula que se diferenciará en un tipo celular terminal. Las células ES son células madre especiales que se pueden diferenciar para formar cualquier tipo celular del cuerpo, incluyendo, lo que es más importante, la línea germinal. Para ilustrar el proceso de transgenia dirigida, miraremos como se consigue uno de sus resultados habituales, a saber, la sustitución de un gen normal por un gen inactivo. Esta inactivación génica dirigida se suele denominar noqueado de genes (del inglés, knockout, fuera de combate). Primero, un gen interrumpido inactivo es clonado y utilizado para reemplazar al gen funcional en un cultivo de células ES, produciendo células ES que contienen el gen noqueado (Figura 20-31a). Las construcciones de DNA con el gen defectivo son inyectadas en el núcleo de células ES cultivadas. El gen defectivo se inserta con mucha más frecuencia en posiciones no homólogas (ectópicas) que en las posiciones homólogas (Figura 20-31b), y por tanto el siguiente paso consiste en seleccionar las pocas células en las cuales el gen defectivo ha sustituido el gen 53 funcional tal como se deseaba. ¿Cómo es posible seleccionar células ES que contienen una sustitución génica rara? El investigador puede incluir en la construcción de DNA alelos de resistencia a fármacos dispuestos de manera que las sustituciones puedan ser distinguidas de las inserciones ectópicas. Se muestra un ejemplo en la Figura 20-31c. En la segunda parte del procedimiento, las células ES que contienen una copia del gen de interés interrumpido son inyectadas en un embrión en las primeras etapas de desarrollo (Figura 20-32a). Los adultos que crecen a partir de estos embriones se cruzan con ratones normales. Los descendientes resultantes son quiméricos, es decir, tienen algunos tejidos derivados de las líneas originales y otros de las líneas ES transplantadas. Estos ratones quiméricos se aparean entonces con sus hermanos para producir ratones homocigotos con el noqueado en ambas copias del gen (Figura 20-32b). Los ratones que contienen el transgén dirigido en todas sus células son identificados mediante sondas moleculares de secuencias únicas del transgén. Mensaje. Las técnicas de transgenia de la línea germinal han sido desarrolladas para todas las especies eucarióticas bien estudiadas. Estas técnicas dependen de nuestra comprensión de la biología reproductora de la especie receptora. Terapia génica humana El objetivo general de la terapia génica es atacar la base genética de las enfermedades en su origen: “curar” o corregir una condición anormal causada por un alelo mutante mediante la introducción de un alelo transgénico salvaje dentro de las células. Esta técnica ha sido (pág. 749) (pág. 750) Figura 54 (pág. 750) (pág. 751) aplicada con éxito en muchos organismos experimentales y tiene el potencial de corregir en los humanos algunas enfermedades hereditarias, particularmente aquellas asociadas a diferencias en un único gen. Aunque la terapia génica ha sido probada en varias de estas enfermedades, hasta ahora no hay casos claros de éxito. Sin embargo, las implicaciones de la terapia génica tienen tal alcance que esta aproximación merece ser considerada en este capítulo. Para entender este método, vamos a tener en cuenta un ejemplo que muestra como la terapia génica corrigió una deficiencia de hormona del crecimiento en ratones (Figura 20-33). Los ratones con la mutación recesiva little (lit) son enanos porque carecen de una proteína (el receptor hormonal liberador de hormona del crecimiento o GHRHR; del inglés growth-hormone-releasing hormone receptor) que es necesario para inducir la secreción por parte de la pituitaria del ratón de la hormona del crecimiento al el sistema circulatorio. El paso inicial para corregir esta deficiencia fue inyectar unas 5000 copias de una construcción (pág. 751) (pág. 752) transgénica en cigotos homocigóticos lit/lit. Esta construcción era un fragmento de DNA lineal de 5 kb que contenía las secuencias codificadoras de la hormona del crecimiento de rata (RGH; del inglés, rat growth hormone) fusionadas con las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína del ratón. Estas secuencias reguladoras inducen la expresión de cualquier gen inmediatamente adyacente en presencia de metales pesados. Entonces los cigotos fueron implantados en los úteros de madres adoptivas, y las crías de ratón nacieron y crecieron. Aproximadamente un 1% de los ratones recién nacidos resultaron ser transgénicos, y alcanzaron un mayor tamaño 55 cuando se les administraban metales pesados a lo largo del desarrollo. Un ratón transgénico representativo se cruzó con una hembra homocigótica lit/lit. El pedigrí resultante se muestra en la Figura 20-33a. Aquí podemos ver que en las generaciones posteriores se producen ratones cuyos pesos son de dos a tres veces el peso de sus parientes lit/lit (Figura 20-33b). Estos ratones más grandes son siempre heterocigóticos en este pedigrí, demostrando que el transgén con la hormona del crecimiento de rata actúa como un alelo dominante. Así pues, la introducción del transgén RGH consiguió una “cura” en el sentido que la descendencia no mostraba el fenotipo alterado. Este ejemplo concreto plantea algunas cuestiones importantes sobre el proceso de terapia génica. El defecto genético ocurre en el gen que codifica GHRHR, un regulador de la producción de la hormona del crecimiento del ratón. Sin embargo, la terapia génica no es un intento de corregir el defecto original en el gen que codifica GHRHR, sino que más bien la terapia génica funciona evitando la necesidad de GHRHR y produciendo hormona del crecimiento mediante otra ruta, específicamente mediante la introducción de un gen de la hormona del crecimiento de rata que no está bajo el control de GHRHR. Este transgén se expresa bajo el control de un promotor inducible y en tejidos donde GHRHR no es necesaria para la liberación de hormona del crecimiento. (El lector puede preguntarse por qué se utilizó hormona del crecimiento de rata en lugar de la de ratón. El gen recombinante de la hormona del crecimiento de rata producía mRNA y proteína con secuencias que se podían distinguir de las versiones correspondientes del ratón, y esto hacía que ambas moléculas pudieran ser medidas directamente.) A continuación dirigiremos nuestra atención a la situación actual de varias aproximaciones técnicas. En humanos pueden aplicarse dos tipos básicos de terapia 56 génica: somática y germinal. El objetivo de la terapia génica en la línea germinal (Figura 20-34a) es el más ambicioso: introducir células (pág. 752) (pág. 753) transgénicas en la línea germinal así como en la población de células somáticas. Este tipo de terapia no sólo conseguiría curar a la persona tratada, sino que también sus hijos serían portadores del transgén terapéutico. La cura del defecto recesivo lit del ratón es un ejemplo de terapia génica en la línea germinal. Actualmente, estas tecnologías dependen de que la integración ectópica o la sustitución génica ocurran por casualidad, y estos sucesos son tan infrecuentes que hacen que la terapia génica no sea viable por ahora. La terapia génica somática (Figura 20-34b) intenta corregir el fenotipo de una enfermedad tratando algunas células somáticas de la persona afectada. Ningún transgén entra en la línea germinal. En la actualidad, no es posible hacer transgénico el cuerpo completo, y por tanto el método se dirige a enfermedades causadas por genes que son expresados predominantemente en un tejido. En estos casos, es probable que no todas las células de ese tejido necesiten convertirse en transgénicas, y que una porción de las células con el transgén ya pueda mitigar los síntomas globales de la enfermedad. El método consiste en extraer células de un paciente con el genotipo defectivo y convertirlas en transgénicas mediante la introducción de copias del gen salvaje clonado. Las células transgénicas se pueden entonces reintroducir en el cuerpo del paciente donde proporcionarán la función génica normal. Los virus se han utilizado como vectores para introducir DNA en los genomas de muchos animales, incluidos los humanos. En el Capítulo 14 se estudió el uso de un retrovirus que contenía el gen normal que codifica la adenosina desaminasa para tratar la enfermedad de la inmunodeficiencia combinada grave (SCID, por sus siglas en 57 inglés) en niños humanos. Recuerde que algunos pacientes con SCID desarrollaban leucemia después de la terapia génica, posiblemente como resultado de la inactivación génica. Otro problema es que un retrovirus solamente infecta a las células proliferantes, como las células sanguíneas, y por tanto no se pueden usar para tratar los muchos desórdenes heredables que afectan tejidos cuyas células raramente o nunca se dividen. Otro vector utilizado en terapia génica humana es el adenovirus. Este virus normalmente infecta los epitelios respiratorios inyectando su genoma dentro de las células epiteliales que revisten la superficie del pulmón. El genoma viral no se integra en un cromosoma sino que persiste extracromosomalmente dentro de las células, lo que elimina el problema de que el vector inactive un gen endógeno. Otra ventaja del adenovirus como vector es que ataca a las células que no se dividen, y por tanto, en principio muchos tejidos son susceptibles de ser infectados. El adenovirus es una elección apropiada como vector para tratar la fibrosis quística, una enfermedad del epitelio respiratorio. La terapia génica para la fibrosis quística se está ensayando introduciendo los virus portadores del alelo salvaje de la fibrosis quística por vía nasal con un pulverizador. Aunque existen algunas razones para creer que los obstáculos técnicos de la terapia génica somática serán superados, estos obstáculos son considerables. Un problema es cómo dirigir la entrega del transgén al tejido apropiado para una determinada enfermedad. Otro es cómo construir el transgén para asegurar unos niveles de expresión altos y estables. Aún otra dificultad es cómo protegerse contra potenciales efectos secundarios dañinos, como los que podrían ser causados por la expresión incorrecta del gen transgénico. Estos puntos constituyen las principales áreas de investigación en terapia génica. 58 Mensaje. Actualmente, las técnicas de transgénesis están siendo aplicadas en humanos con el objetivo específico de utilizar la terapia génica para corregir ciertos desórdenes heredables. Los retos técnicos, sociales y éticos de esta tecnología son considerables y constituyen áreas activas de investigación y debate. Resumen El DNA recombinante se construye cortando el DNA donante en fragmentos que se unen a un vector de DNA. Este vector de DNA es frecuentemente un plásmido bacteriano o DNA viral. El DNA donante y el DNA del vector se cortan con la misma endonucleasa de restricción en secuencias específicas. El DNA del vector y el donante se unen en un tubo para formar enlaces covalentes fosfodiéster, creando un esqueleto azúcar-fosfato intacto para cada cadena de DNA. La construcción formada por el DNA donante y del vector se amplifica dentro de células hospedadoras engañando a la maquinaria básica de replicación de la (pág. 753) (pág. 754) célula para que replique las moléculas recombinantes. Así pues, el vector debe contener todas las señales necesarias para su correcta replicación y segregación en la célula hospedadora. En los sistemas basados en plásmidos, el vector debe incluir un origen de replicación y marcadores seleccionables que confieran, por ejemplo, resistencia a fármacos y que puedan ser utilizados para asegurar que el plásmido no se pierde en la célula hospedadora. En los bacteriófagos, el vector debe incluir todas las secuencias necesarias para llevar al bacteriófago (y al DNA foráneo asociado) a través del ciclo de crecimiento lítico. El resultado de la amplificación son múltiples copias de cada construcción de DNA recombinante denominadas clones. 59 A menudo, la búsqueda de un clon específico requiere el rastreo de una genoteca genómica completa. Una genoteca genómica es un conjunto de clones, empaquetados en el mismo vector, que en total representan todas las regiones del genoma del organismo en cuestión. El número de clones que constituyen una genoteca genómica depende de (1) el tamaño del genoma en cuestión y (2) el tamaño de inserto tolerado por el vector de clonación utilizado. Del mismo modo, una genoteca de cDNA es una representación del conjunto total de mRNAs producidos por un determinado tejido o etapa del desarrollo en un organismo determinado. La comparación de una región genómica y su cDNA puede servir para conocer las posiciones del inicio y terminación de la transcripción y de los límites entre intrones y exones. Las sondas marcadas de DNA o RNA de cadena simple actúan como un “cebo” para pescar secuencias similares o idénticas en mezclas complejas de moléculas, tanto en genotecas genómicas o de cDNA como en transferencias de Southern o Northern. El principio general de la técnica para identificar clones o fragmentos de DNA en un gel es crear una “imagen” de las colonias o calvas de un cultivo en una placa de Petri, o de los ácidos nucleicos que se han separado en la matriz de un gel mediante la aplicación de un campo eléctrico. El DNA o RNA entonces se desnaturaliza y se mezcla con una sonda también desnaturalizada y marcada radioactivamente o con un fluorocromo. Después de lavar la sonda que no se ha unido, se detecta la localización de la sonda mediante observación de la fluorescencia o, si es radioactiva, por la exposición de la muestra a una película de rayos X. Las localizaciones de la sonda corresponden a las posiciones del DNA o RNA pertinente en la placa de Petri o el gel de electroforesis originales. La reacción en cadena de la polimerasa es un método potente para la amplificación directa de una secuencia relativamente pequeña de DNA a partir de una mezcla compleja de DNA, sin la necesidad de una célula hospedadora o demasiado 60 material de partida. La clave es tener cebadores que sean complementarios a las regiones flanqueantes en cada una de las dos cadenas de DNA. Estas regiones actúan como puntos de inicio para la polimerización. Múltiples rondas de desnaturalización, unión de los cebadores y polimerización permiten amplificar la secuencia de interés de forma exponencial. Los vastos recursos genómicos posibilitan cada vez más el aislamiento de genes tan sólo a partir del conocimiento de su posición en un mapa genético. El proceso global es una estrategia genética directa denominada clonación posicional. Tanto mutantes como variantes naturales se han utilizado como punto de partida en el descubrimiento de genes. Con la secuenciación del genoma humano y la disponibilidad de familias con desórdenes heredados, las estrategias de clonación posicional han llevado al aislamiento de genes que cuando están mutados producen enfermedades humanas, como la fibrosis quística. Las estrategias de clonación posicional también se han usado para aislar muchos otros genes, por ejemplo, los genes seleccionados durante la domesticación de plantas de cultivo como el maíz. Los transgenes son moléculas de DNA manipuladas que son introducidas y expresadas en células eucarióticas. Pueden utilizarse para crear una nueva mutación o para estudiar las secuencias reguladoras que forman parte de un gen. Los transgenes pueden introducirse como moléculas extracromosomales o pueden integrarse en un cromosoma, tanto en posiciones aleatorias (ectópicas) como en el lugar del gen homólogo, según el sistema. Normalmente, los mecanismos utilizados para introducir un transgén dependen del conocimiento y la explotación de la biología reproductora del organismo. La terapia génica es la extensión de la tecnología transgénica aplicada al tratamiento de enfermedades humanas. Para corregir la enfermedad, la terapia génica en 61 células somáticas intenta introducir en tejidos somáticos específicos un transgén que o bien sustituye al alelo mutante o suprime el fenotipo mutante. La terapia génica en la línea germinal intenta introducir un transgén en la línea germinal que corrija el defecto mutante o lo evite. Términos clave amniocentesis (pág. 740) anticuerpo (pág. 727) autorradiografía (pág. 725) biopsia de corion (pág. 740) clonación de DNA (pág. 716) clonación posicional (pág. 729) complementación funcional (rescate de mutantes) (pág. 729) cósmido (pág. 721) cromosoma artificial bacteriano (BAC) (pág. 722) cromosoma artificial de levadura (YAC) (pág. 722) cromosoma artificial P1 (PAC) (pág. 722) DNA complementario (cDNA) (pág. 717) DNA donante (pág. 716) DNA ligasa (pág. 720) DNA recombinante (pág. 716) efecto de posición (pág. 747) electroforesis en gel (pág. 727) elemento transponible (pág. 746) enzima de restricción (pág. 717) 62 fragmento de restricción (pág. 718) genética directa (pág. 736) genómica (pág. 716) genoteca de cDNA (pág. 724) (pág. 754) (pág. 755) genoteca genómica (pág. 724) hibridación (pág. 718) ingeniería genética (pág. 716) noqueado (pág. 749) organismo modificado genéticamente (GMO) (pág. 742) organismo transgénico (pág. 741) paseo cromosómico (pág. 730) plásmido Ti (pág. 742) reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (pág. 731) rescate de mutantes (complementación funcional) (pág. 729) secuencia palindrómica (pág. 718) secuenciación didesoxi o Sanger (pág. 732) sesgo en el uso de codones (pág. 717) sonda (pág. 725) sustitución génica (pág. 747) tecnología del DNA (pág. 716) terapia génica en la línea germinal (pág. 752) terapia génica somática (pág. 753) transferencia de Northern (pág. 729) transferencia de Southern (pág. 728) 63 transgén (pág. 741) transposasa (pág. 746) vector (pág. 716) Problemas resueltos Problema resuelto 1. En el Capítulo 9, se estudió la estructura de las moléculas de tRNA. Imagine que quiere clonar un gen fúngico que codifica un cierto tRNA. Dispone de una muestra del tRNA purificado y de un plásmido de E. coli que contiene un único sitio de corte para EcoRI dentro de un gen tetR (resistencia a la tetraciclina), así como un gen de resistencia a la ampicilina (ampR). ¿Cómo se puede clonar el gen de interés? SOLUCIÓN Se puede usar el propio tRNA o una copia de su cDNA clonado como sonda para detectar el gen de interés en el DNA. Un método consiste en digerir el DNA genómico con EcoRI y entonces mezclarlo con el plásmido, también cortado con EcoRI. Después de la transformación en una célula receptora ampS tetS, se seleccionan las colonias AmpR, que indican una transformación exitosa. Dentro de estas colonias AmpR, se seleccionan las que también son TetS. Estas colonias TetS contendrán vectores con insertos en el gen tetR, y será necesario un gran número de ellas para hacer una genoteca. Rastree la genoteca utilizando el tRNA como sonda. Los clones que hibriden con la sonda contendrán el gen de interés. Como alternativa, puede someter el DNA genómico digerido con EcoRI a una electroforesis en gel para luego identificar la banda correcta utilizando el tRNA como sonda. Esta región del gel se puede cortar y utilizar como una fuente enriquecida de 64 DNA para clonar en el plásmido cortado con EcoRI. Por último, se rastrean estos clones con el tRNA para confirmar que contienen el gen de interés. Problemas PROBLEMAS BÁSICOS 1. Basándose en este capítulo, haga una lista de todos los ejemplos de (a) hibridación de DNAs de cadena simple y (b) proteínas que se unen al DNA para realizar su función. 2. ¿Para qué se usa el hidróxido de sodio en la síntesis de cDNA? 3. Compare y contraste el uso de la palabra recombinante en las frases (a) DNA recombinante y (b) frecuencia de recombinantes. 4. ¿Por qué se necesita la enzima ligasa para hacer DNA recombinante? ¿Cuál sería la consecuencia inmediata en el proceso de clonación si alguien se olvidara de añadirla? 5. En el proceso de la PCR, si asumimos que cada ciclo tarda 5 minutos, ¿cuántas veces se podría amplificar un fragmento de DNA en 1 hora? 6. Gracias a la secuencia del genoma completo, se conoce la posición del gen de la proteína actina en el hongo haploide Neurospora. Si tuviera un mutante de crecimiento lento que sospechara que es un mutante en el gen de la actina y quisiera verificarlo, ¿qué haría, (a) clonar el mutante utilizando dianas de restricción bien 65 situadas que flanqueen el gen de la actina y entonces secuenciarlo o (b) amplificar la secuencia mutante mediante PCR y luego secuenciarla? 7. Un investigador obtiene la secuencia de DNA de un mutante en un gen de 2 kb en el que está interesado y encuentra diferentes bases en tres posiciones, todas en diferentes codones. Uno es un cambio silencioso, pero los otros dos son mutaciones de cambio de sentido (codifican nuevos aminoácidos). ¿Cómo demostraría que estos cambios son mutaciones reales y no errores de secuenciación? (Asuma que la secuenciación tiene un 99.9% de precisión). 8. En la transformación mediante T-DNA de una planta con un transgén de un hongo (que no se encuentra en plantas), la presunta planta transgénica no expresa el fenotipo esperado del transgén. ¿Cómo demostraría que en realidad la planta contiene el transgen? 9. ¿Cómo produciría un ratón que sea homocigótico para un transgén de una hormona del crecimiento de rata? 10. ¿Por qué se utilizó cDNA y no DNA genómico en la clonación comercial del gen de la insulina humana? (pág. 755) (pág. 756) 11. Después de tratar DNA de Drosophila con una enzima de restricción, los fragmentos son insertados dentro de plásmidos y seleccionados como clones en E. coli. Con el uso de esta técnica “al azar”, cualquier secuencia de DNA de Drosophila puede recuperarse de una genoteca. 66 a. ¿Cómo identificaría un clon que contenga el DNA que codifica la proteína actina, cuya secuencia aminoacídica es conocida? b. ¿Cómo identificaría un clon que codifique un tRNA específico? 12. En cualquier célula eucariota transformada (por ejemplo, de Neurospora), explique cómo podría saber si el DNA transformante (colocado dentro de un vector bacteriano circular) a. ha reemplazado al gen endógeno en el receptor mediante un doble entrecruzamiento o uno simple. b. fue insertado ectópicamente. 13. En un gel de electroforesis a través del cual es aplicado un campo eléctrico pulsante alterno, el DNA del hongo haploide Neurospora crassa (n = 7) se mueve lentamente pero al final forma siete bandas, que representan fracciones de DNA de diferentes tamaños y que, por tanto, se han movido a diferentes velocidades. Se supone que estas bandas son los siete cromosomas. ¿Cómo demostraría qué banda corresponde a cada cromosoma? 14. La proteína codificada por el gen de la alcaptonuria tiene 445 aminoácidos de longitud, aunque el gen se extiende a lo largo de 60 kb. ¿Cómo es posible esta diferencia? 15. En levaduras, un investigador ha secuenciado un trozo de DNA salvaje que claramente contiene un gen, pero no sabe de qué gen se trata. Para investigarlo, le gustaría encontrar su fenotipo mutante. ¿Cómo utilizaría el gen salvaje clonado para 67 conseguirlo? Explique claramente todos los pasos experimentales. PROBLEMAS PARA PENSAR 16. La prototrofia es frecuentemente el fenotipo seleccionado para detectar transformantes. Las células prototróficas se usan para extraer el DNA donante; entonces este DNA se clona y los clones se añaden a un cultivo de un recipiente autotrófico. Los transformantes que han tenido éxito se identifican sembrando el cultivo recipiente en un medio mínimo y buscando colonias. Explique qué diseño experimental usaría para asegurarse de que una colonia que espera que sea un transformante no sea de hecho, a. una célula prototrófica que ha contaminado el cultivo recipiente. b. un revertiente (una segunda mutación en el gen originalmente mutante que revierte el fenotipo de nuevo a prototrofia) de la mutación autotrófica. 17. Se investiga en dos niños la expresión de un gen (D) que codifica una enzima importante para el desarrollo muscular. Los resultados de los estudios del gen y sus productos son los siguientes: (pág. 756) (pág. 757) Para el niño 2, la actividad de la enzima en cada etapa era muy baja y su valor estimado era de aproximadamente 0.1 unidad en las edades de 1, 2, 3 y 4 años. a. Para ambos niños, dibuje gráficos representando la expresión del gen a lo largo del desarrollo. (Indique con claridad qué se representa en cada eje.) b. ¿Cómo explicaría los niveles tan bajos de enzima activa en el niño 2? (La degradación de la proteína es sólo una posibilidad.) c. ¿Cómo explicaría las diferencias entre ambos niños en los resultados del 68 análisis mediante transferencia de Southern? d. Si sólo se ha detectado un alelo mutante en los estudios de familia de los dos niños, defina a cada uno de los niños como homocigoto o heterocigoto para el gen D. (El Problema 17 es cortesía de Joan McPherson. De A. J. F. Griffiths and J. McPherson, 1001 Principles of Genetics. W. H. Freeman and Company, 1989.) 18. Un fragmento clonado de DNA fue secuenciado utilizando el método didesoxi. Una parte de la autorradiografía del gel de secuenciación está representada a continuación. a. Deduzca la secuencia nucleotídica de la cadena de DNA sintetizada a partir del cebador inicial. Marque los extremos 5’ y 3’. b. Deduzca la secuencia nucleotídica de la cadena de DNA utilizada como molde. Marque los extremos 5’ y 3’. c. Escriba la secuencia nucleotídica de la doble hélice de DNA (marque los extremos 5’ y 3’). d. ¿Cuántos de los seis marcos de lectura están “abiertos” en este pequeño fragmento? 19. El clon de cDNA del gen humano que codifica la tirosinasa fue marcado radioactivamente y utilizado en un análisis mediante Southern de DNA genómico de ratones salvajes digerido con EcoRI. Tres fragmentos de ratón resultaron ser radioactivos (tenían la sonda unida). Cuando se utilizaron ratones albinos en este análisis por Southern, ningún fragmento genómico se unió a la sonda. Explique estos resultados en relación a la naturaleza de los alelos salvaje y mutante de ratón. 69 20. Se obtuvieron plantas transgénicas de tabaco en las que el vector plásmido Ti fue diseñado para insertar el gen de interés más un gen adyacente de resistencia a la kanamicina. Se siguió la herencia de la inserción cromosómica sometiendo a la descendencia a una prueba para detectar la resistencia a kanamicina. Dos plantas representan los resultados generales obtenidos. Cuando la planta 1 se retrocruzó con tabaco salvaje, el 50% de los descendientes eran resistentes a la kanamicina y el 50% eran sensibles a este antibiótico. Cuando la planta 2 se retrocruzó con el tipo salvaje, el 75% de la descendencia era resistente a la kanamicina y el 25% sensible. ¿Cuál debe ser la diferencia entre las dos plantas transgénicas? ¿Qué podría predecir respecto a la situación del gen de interés? 21. Una mutación causante de fibrosis quística en una cierta genealogía se debe al cambio de un único par de bases. Este cambio elimina una diana de restricción EcoRI que se encuentra normalmente en esta posición. ¿Cómo podría utilizar esta información para aconsejar a los miembros de esta familia sobre sus probabilidades de ser portadores? Plantee los experimentos necesarios. Asuma que encuentra que una mujer de esta familia es portadora, y resulta que está casada con un hombre no emparentado que también es heterocigótico para la fibrosis quística, pero en este caso, tiene una mutación diferente en el mismo gen. ¿Cómo aconsejaría a esta pareja sobre los riesgos de tener un hijo con fibrosis quística? 22. La glucuronidasa bacteriana convierte una sustancia incolora llamada X-Gluc en un pigmento de un color azul añil brillante. El gen de la glucuronidasa también funciona en plantas si se le incorpora una región promotora de plantas. ¿Cómo 70 usaría este gen como gen informador para encontrar los tejidos en los cuales un gen de planta que acaba de clonar es activo normalmente? (Asuma que el X-Gluc penetra fácilmente en los tejidos vegetales.) 23. La planta Arabidopsis taliana fue transformada utilizando un plásmido Ti en que se había insertado un gen de resistencia a la kanamicina en la región T-DNA. Se seleccionaron dos colonias resistentes a la kanamicina (A y B) y se generaron plantas a partir de ellas. Las plantas se dejaron autopolinizar y los resultados fueron los siguientes: Planta A autopolinizada → 3/4 descendencia resistente a kanamicina 1/4 descendencia sensible a kanamicina Planta B autopolinizada → 15/16 descendencia resistente a kanamicina 1/16 descendencia sensible a kanamicina a. Dibuje los cromosomas relevantes de la planta en los dos casos. b. Explique las dos proporciones diferentes. (pág. 757) 71 PIES DE FIGURAS Figura inicial Inyección de DNA foráneo en una célula animal. A la derecha, se observa la microaguja utilizada para la inyección, y a la izquierda, la pipeta que mantiene a la célula sujeta. [Copyright M. Baret/Photo Researchers]. Figura 20-1 El progenitor del maíz domesticado Una subespecie de teosinte, Zea mays ssp. parviglumis crece en un barranco cerca de Teloloapan en la cuenca del río Balsas en Guerrero, México. Figura 20-2 Formación de una molécula de DNA recombinante Las enzimas de restricción se utilizan para generar DNA recombinante. La enzima de restricción EcoRI corta una molécula circular de DNA que tiene una diana de restricción para dicha enzima, dando lugar a una molécula lineal con extremos cohesivos de cadena simple. Debido a su complementariedad, otras moléculas lineales con extremos cohesivos generados por el corte con EcoRI pueden hibridar con el DNA circular linealizado y formar una molécula de DNA recombinante. Figura 20-3 Inserción de un gen dentro de un plásmido de DNA recombinante Método para generar un plásmido de DNA recombinante portador de genes derivados de un DNA donante. [Según S. N. Cohen, The Manipulation of Genes. Copyright 1975 de Scientific American, Inc. Reservados todos los derechos.] Figura 20-4 Cómo funciona la amplificación 72 Estrategia general usada para clonar un gen. El tratamiento del DNA donante y del vector con enzimas de restricción permite la inserción de fragmentos individuales en el vector. Tras la entrada de una sola molécula recombinante en la célula bacteriana, la replicación y la división celular producen un número elevado de copias del fragmento donante. Figura 20-5 Un vector plasmídico, pUC18 El vector plasmídico pUC18 ha sido diseñado para su uso como vector de clonación de DNA. La inserción en pUC18 se detecta por la inactivación de la función βgalactosidasa de lacZ’, que se traduce en la incapacidad para convertir el sustrato artificial X-Gal en un compuesto de color azul. El sitio de clonación múltiple tiene varias dianas de restricción alternativas en las que se puede insertar el DNA donante. Figura 20-6 Clonación en el fago λ Para clonar en el fago λ se elimina una región central del cromosoma del fago que no es esencial y los extremos se ligan al azar con fragmentos de DNA donante de 15 kb. Se forma un multímero lineal (concatenado), que es utilizado para rellenar las cápsides de los fagos de monómero en monómero mediante un sistema de empaquetamiento in vitro. [Según J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski y M. Zoller. Recombinant DNA. 2ª edición. Copyright 1992 de Scientific American Books.] Figura 20-7 Estructura de un vector BAC Un cromosoma artificial bacteriano (BAC) se utiliza para clonar fragmentos grandes de DNA donante. CMR es un marcador seleccionable de resistencia al cloramfenicol. oriS, repE, parA y parB son genes del plásmido F para la replicación y la regulación del 73 número de copias. cosN es el sitio cos de un fago λ. HindIII y BamHI son sitios de clonación en los que se puede insertar el DNA donante. Los dos promotores permiten transcribir el fragmento insertado. Las dianas NotI se utilizan para liberar el fragmento insertado. F = plásmido F. Figura 20-8 Métodos para introducir el DNA recombinante dentro de células bacterianas El DNA recombinante puede ser introducido dentro de células bacterianas mediante transformación, transducción o infección con un fago. (a) Un vector plasmídico es introducido por transformación de DNA. (b) Ciertos vectores como los cósmidos son introducidos dentro de cápsides de bacteriófago (transducción); sin embargo, después de ser inyectados dentro de la bacteria, forman círculos y se replican como grandes plásmidos. (c) Los bacteriófagos como el fago λ infectan y lisan la bacteria liberando un clon de fagos descendientes, todos portadores de una molécula de DNA recombinante idéntica dentro de su genoma. Figura 20-9 Búsqueda del clon de interés mediante el uso de sondas de DNA o RNA El clon que contiene un gen de interés es identificado rastreando una genoteca genómica, en este caso hecha por clonación de los genes en bacteriófagos λ, con una sonda de DNA o RNA que se sabe que está relacionada con el gen deseado. Una sonda radioactiva hibridará con cualquier DNA recombinante con una secuencia complementaria, y revelará la posición del clon que contiene este DNA en una autorradiografía. Entonces, el gen deseado se puede seleccionar en el espacio correspondiente de la placa de Petri y transferir a un nuevo hospedador bacteriano para 74 poder ser aislado en estado puro. [Según R. A. Weinberg, A Molecular Basis of Cancer y P. Leder, The Genetics of Antibody Diversity. Copyright 1983, 1982 de Scientific American, Inc. Reservados todos los derechos.] Figura 20-10 Búsqueda del clon de interés mediante el uso de anticuerpos Para encontrar el clon de interés, se rastrea una genoteca de expresión construida con un fago λ especial llamado λgt11 como vector con un anticuerpo específico de una proteína. Después de eliminar de la membrana los anticuerpos que no se hayan unido, los anticuerpos retenidos se detectan mediante la unión de un anticuerpo secundario radioactivo. [Según J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski y M. Zoller, Recombinant DNA, 2ª edición. Copyright 1992 de Scientific American Books.] Figura 20-11 Electroforesis en gel Diversas mezclas de fragmentos de DNA de diferentes tamaños se han separado por electroforesis en un gel de agarosa. Las muestras son cinco vectores recombinantes tratados con EcoRI. Las mezclas se depositan en pocillos situados en la parte superior del gel, y los fragmentos se mueven bajo la influencia de un campo eléctrico hasta posiciones diferentes dependiendo de su tamaño (y, por lo tanto, del número de cargas). Las bandas de DNA se han visualizado mediante tinción con bromuro de etidio y fotografía bajo luz ultravioleta. (La letra “M” representa los carriles que contienen marcadores de tamaño para estimar la longitud de los fragmentos de DNA.) [De H. Lodish, D. Baltimore, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira y J. Darnell, Molecular Cell Biology, 3ª edición. Copyright 1995 de Scientific American Books.] 75 Figura 20-12 Búsqueda de ácidos nucleicos específicos mediante el uso de electroforesis en gel y transferencia Para identificar ácidos nucleicos específicos separados por electroforesis en un gel se utiliza una sonda radioactiva. Para empezar, el RNA o los fragmentos de restricción del DNA son depositados en un gel de agarosa que se somete a electroforesis. Los diversos fragmentos migran a diferentes velocidades según sus respectivos tamaños. A continuación, se coloca el gel en un tampón y se cubre con una membrana y un montón de servilletas de papel. Los fragmentos se desnaturalizan para convertirlos en cadenas simples que se puedan pegar a la membrana. Entonces el DNA es transferido a la membrana por el tampón absorbido por las servilletas. El siguiente paso consiste en separar la membrana e incubarla con una sonda de cadena sencilla marcada radioactivamente que sea complementaria a la secuencia diana. Se lava la sonda que no se haya unido y se expone una película de rayos X a la membrana. Como la sonda radioactiva ha hibridado sólo con sus fragmentos de restricción complementarios, la película quedará expuesta solamente en las bandas correspondientes a estos fragmentos. La comparación de estas bandas con marcadores de tamaño radioactivos muestra el número y tamaño de los fragmentos en que se encuentra la secuencia diana. Este procedimiento se denomina transferencia de Southern cuando lo que se transfiere a la membrana es DNA, y transferencia de Northern cuando es RNA. [Según J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski y M. Zoller, Recombinant DNA, 2ª edición. Copyright 1992 de Scientific American Books.) Figura 20-13 Paseo cromosómico Este paseo cromosómico empieza con un fago recombinante obtenido a partir de una genoteca construida mediante digestión parcial con EcoRI de un genoma eucariótico. El 76 fago recombinante se utiliza entonces para aislar otro fago recombinante que contenga un segmento adyacente de DNA eucariótico. Este paseo ilustra cómo empezar en el marcador molecular A y llegar al gen diana D. [Según J. D. Watson, J. Tooze y D. T. Kurtz, Recombinant DNA: A Short Course. Copyright 1983 de W. H. Freeman and Company). Figura 20-14 Reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa copia rápidamente una secuencia de DNA diana. (a) DNA de doble cadena que contiene la secuencia diana. (b) Los dos cebadores escogidos o diseñados poseen secuencias complementarias a los extremos 3’ de la secuencia que se desea amplificar en ambas cadenas de DNA. Las cadenas se separan al calentarse, permitiendo que los cebadores se unan a sus secuencias complementarias. Los dos cebadores flanquean la secuencia diana. (c) La Taq polimerasa sintetiza las primeras cadenas complementarias de la reacción. Estas dos primeras cadenas tienen un tamaño variable, debido a que carecen de una señal de terminación común, y se extienden más allá de la secuencia diana delimitada por los cebadores. (d) Las dos moléculas de doble cadena se desnaturalizan de nuevo, exponiendo cuatro sitios de unión de los cebadores. Los dos cebadores vuelven a unirse a sus respectivas secuencias complementarias en los extremos 3’ de la región diana. (e) La Taq polimerasa sintetiza cuatro cadenas complementarias. Aunque las cadenas molde en este paso son de longitud variable, dos de las cuatro cadenas que se sintetizan a partir de ellas ya tienen exactamente la longitud de la secuencia diana deseada. Esta longitud precisa se debe a que cada cadena nueva comienza donde se une el cebador, en un extremo de la secuencia diana, y avanza hasta alcanzar el final del molde, en el otro extremo de la secuencia. (f) El proceso puede repetirse indefinidamente, produciendo cada vez más 77 moléculas de DNA de doble cadena idénticas a la secuencia diana. [Según J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski y M. Zoller, Recombinant DNA, 2ª edición. Copyright 1992 de Scientific American Books.) Figura 20-15 Estructura de los 2’, 3’-didesoxinucleótidos Los 2’, 3’-didesoxinucleótidos, que se utilizan en el método de secuenciación desarrollado por Sanger, carecen del grupo hidroxilo de la ribosa presente en el DNA. Figura 20-16 El método de secuenciación con didesoxinucleótidos El DNA se puede secuenciar eficazmente mediante la inclusión de didesoxinucleótidos entre los nucleótidos usados para copiar un segmento de DNA. (a) Para iniciar la síntesis, se utiliza un cebador marcado (correspondiente a una secuencia del vector adyacente al inserto). La adición de cuatro didesoxinucleótidos diferentes (en este caso, se muestra el ddATP) detiene la síntesis aleatoriamente. (b) Los fragmentos resultantes se separan por electroforesis y se someten a autorradiografía. A la derecha se muestra la secuencia inferida. (c) Gel de secuenciación por el método de Sanger. [(a y b) De J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski y M. Zoller, Recombinant DNA, 2ª edición. Copyright 1992 de Scientific American Books. (c) De Loida Escote-Carlson.] Figura 20-17 Lectura de una secuencia de DNA obtenida con un secuenciador automático Copia impresa del cromatograma obtenido con un secuenciador automático que utiliza compuestos fluorescentes. Cada uno de los cuatro colores representa una base diferente. La letra “N” representa una base que no puede ser asignada porque los picos son demasiado bajos. Nótese que, si esto fuera un gel como en la Figura 20-16c, cada uno 78 de estos picos correspondería a una de las bandas oscuras en el gel; en otras palabras, estos picos coloreados representan una lectura diferente de la misma clase de datos que los producidos en un gel de secuenciación. Figura 20-18 Salto y paseo cromosómico Manipulación de los fragmentos genómicos clonados para hacer un salto cromosómico, un tipo modificado de paseo cromosómico que puede evitar regiones difíciles de clonar. (a) Después de clonar todos los fragmentos y construir una genoteca, una sonda del principio de la región de DNA investigada (en amarillo) es utilizada para rastrear los clones y encontrar el que contiene la secuencia inicial. Cuando se encuentra este clon, se escinde el otro extremo de la secuencia de empalme (en lila) y se utiliza para rastrear la genoteca de nuevo y hacer un segundo salto. (b) A partir de cada nueva posición obtenida en los saltos, se pueden hacer paseos cromosómicos en ambas direcciones para ordenar un segundo conjunto de fragmentos clonados más pequeños. Figura 20-19 Principales diferencias morfológicas entre el teosinte salvaje y el maíz domesticado La gramínea salvaje teosinte tiene relativamente pocos granos y todos rodeados por cubiertas duras, mientras que el maíz domesticado tiene muchos más granos y todos expuestos. [Cortesía de Nicolle Roger Fuller, National Science Foundation.] Figura 20-20 Resultado de insertar un gen del maíz en el teosinte Una espiga de teosinte con los granos típicos (izquierda) se muestra al lado de una espiga de teosinte con el alelo tga1 del maíz introgresado (maize:tga1). Fíjese en los 79 granos expuestos (derecha). [Cortesía de J. F. Doebley, Departamento de Genética, Universidad de Wisconsin-Madison.] Figura 20-21 Amniocentesis En la amniocentesis, se analizan células obtenidas del líquido amniótico para detectar alelos defectivos en homocigosis. Figura 20-22 Métodos para introducir un transgén Algunos de los diferentes métodos para introducir DNA foráneo en una célula. Figura 20-23 Dos resultados de la transformación con vectores simples de levadura Un plásmido portador de un alelo funcional (gen X+) se inserta en una cepa receptora de levadura con un gen defectivo (X–) mediante recombinación homóloga. El resultado puede ser la sustitución del gen defectivo X– (arriba) o su retención conjuntamente con el nuevo alelo. El sitio mutante del gen X– está representado como una barra vertical negra. Aunque no se muestra, también pueden producirse entrecruzamientos sencillos en la posición 2. Figura 20-24 Infección por el plásmido Ti Para causar la enfermedad de la agalla de la corona, la bacteria A. tumefaciens inserta una parte de su plásmido Ti, una región denominada T-DNA, en un cromosoma de la planta hospedadora. Figura 20-25 El plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens 80 Representación simplificada de las regiones principales del plásmido Ti de A. tumefaciens. El T-DNA, cuando se inserta en el DNA cromosómico de la planta hospedadora, dirige la síntesis de nopalina, que la bacteria utiliza luego para sus propios fines. El T-DNA también provoca la división incontrolada de la célula vegetal, lo que da lugar a la formación de un tumor. Figura 20-26 Generación de una planta transgénica Una planta transgénica es generada a través del crecimiento de una célula transformada mediante T-DNA. Figura 20-27 Patrón de transmisión del T-DNA La región del T-DNA y cualquier DNA que contenga, una vez insertados en un cromosoma de una planta transgénica se transmiten con un patrón de herencia mendeliano. Figura 20-28 Creación de transgenes en Caenorhabditis elegans Los transgenes de C. elegans son creados mediante la inyección de DNA transgénico directamente en una gónada. (a) Método de inyección. (b) Los dos principales tipos de resultados de la transgenia: grupos de transgenes extracromosómicos y grupos integrados en posiciones cromosómicas ectópicas. Figura 20-29 Creación de transgenes en Drosophila melanogaster Los transgenes en D. melanogaster se crean inyectando un vector transponible en un embrión de Drosophila en las primeras fases de su desarrollo. (a) Estructura global de elementos transponibles P autónomos y no autónomos. (b) Método de inyección. (c) El 81 vector circular del elemento P (arriba) y una integración en una posición cromosómica ectópica (abajo). Nótese que las secuencias bacterianas del vector no se integran en el genoma, sino que en la integración, exactamente una única copia del segmento de DNA queda contenida entre los extremos del elemento P. Figura 20-30 Creación de transgenes en Mus musculus Los transgenes son creados en M. musculus por inserción en posiciones cromosómicas ectópicas. (a) Método de inyección. (b) Inserción ectópica típica, con múltiples copias del transgén recombinante insertadas formando un grupo. Figura 20-31 Producción de células que contienen un gen específico noqueado Producción de células que contienen una mutación en un gen específico, también conocida como mutación dirigida o noqueado. (a) Las copias de un gen clonado son alteradas in vitro para obtener un vector dirigido. El gen que se muestra se ha inactivado mediante la inserción del gen de resistencia a la neomicina (neoR) en la región codificadora del gen (exón 2), y esta construcción se ha insertado en un vector. El gen neoR será utilizado posteriormente como marcador para detectar la integración del vector en un cromosoma. El vector contiene un marcador adicional en un extremo, el gen tk de herpes. Estos marcadores son los habituales, pero podrían utilizarse otros en su lugar. El vector completo, con sus dos marcadores, se introduce en células aisladas a partir de un embrión de ratón. (b) Cuando se produce recombinación homóloga (izquierda), las regiones homólogas del vector, junto con cualquier DNA que haya entre ellas pero excluyendo el marcador del extremo, pasan a ocupar el lugar del gen original. Este hecho es importante porque las secuencias del vector constituirán una marca muy útil para detectar la presencia de este gen mutante. En muchas células, sin embargo, el 82 vector completo (incluyendo el marcador del extremo) se inserta ectópicamente (centro) o ni tan solo se integra (abajo). (c) Para aislar células portadoras de la mutación deseada, se cultivan las células en un medio con los compuestos químicos apropiados, en este caso, un análogo de la neomicina (G148), y el ganciclovir. El compuesto G148 es letal para las células que no contengan un gen neoR funcional, y de este modo se eliminan las células en las que el vector no se ha integrado (en amarillo). A su vez, el ganciclovir es tóxico para las células portadoras del gen tk, con lo que se eliminan las células en las que el vector se ha integrado aleatoriamente (en rojo). Por consiguiente, prácticamente las únicas células que sobreviven y proliferan son aquellas en las que se ha producido la integración homóloga (en verde). (Según M. R. Capecchi, Targeted Gene Replacement. Copyright 1994 de Scientific American, Inc. Reservados todos los derechos.) Figura 20-32 Producción de un ratón con un gen específico noqueado Un ratón noqueado se produce mediante la inserción de células ES portadoras de la mutación dirigida. (a) Se aíslan células madre embrionarias (ES) a partir de una línea (A/A) de ratones agouti (marrón) y se les introduce una mutación dirigida (m) en un cromosoma. Las células ES alteradas se introducen en embriones jóvenes como el que se muestra en la figura. El color del pelaje de los recién nacidos permite determinar si las células ES trasplantadas sobrevivieron en el embrión. Las células ES son normalmente implantadas en embriones que, en ausencia de las células ES, tendrían un pelaje totalmente negro. Estos embriones se obtienen de una línea de pelaje negro que carece del alelo agouti dominante (a/a). Los embriones portadores de las células ES se desarrollan en madres adoptivas. El pelaje con parches de color negro y agouti indica en cuáles de los recién nacidos han sobrevivido y proliferado las células ES. (Estos ratones 83 se denominan quimeras porque contienen células derivadas de dos líneas diferentes de ratones.) El color totalmente negro, sin embargo, indica que las células ES se han perdido y estos ratones son descartados. A simboliza agouti; a negro; m es la mutación dirigida y M el alelo salvaje correspondiente. (b) Los machos quiméricos se cruzan con hembras negras (no agouti). Se analiza la descendencia para detectar la mutación introducida (verde, en el círculo) en el gen de interés. El examen directo de estos genes en los ratones agouti permite determinar cuáles de éstos heredaron la mutación (recuadro). Se cruzan machos y hembras portadores de la mutación para dar lugar a ratones cuyas células lleven la mutación introducida en ambas copias del gen (círculo) y que por tanto carecen de un gen funcional. Estos animales (recuadro) son identificados inequívocamente mediante un análisis directo de su DNA. En esto caso, el noqueo resulta en un fenotipo de cola enrollada. (Según M. R. Capecchi, Targeted Gene Replacement. Copyright 1994 de Scientific American, Inc. Reservados todos los derechos). Figura 20-33 Terapia génica en ratones Producción de un ratón portador de un transgén terapéutico para corregir una deficiencia de hormona del crecimiento. (a) El gen de la hormona del crecimiento de la rata (RGH), bajo el control de una región promotora de ratón que responde a la presencia de metales pesados, se inserta en un plásmido y se utiliza para producir un ratón transgénico. RGH compensa el enanismo inherente (lit/lit) del ratón y se hereda con un patrón de herencia mendeliana dominante en el pedigrí resultante. (b) Ratón transgénico. Los ratones son hermanos, pero el de la izquierda deriva de un cigoto al que se inyectó una construcción con el promotor de la metalotioneína fusionado al gen de la hormona del crecimiento de la rata. (Este ratón pesa 44 g, mientras que su hermano no tratado pesa 29 g.) El nuevo 84 gen se transmite a la descendencia de modo mendeliano, lo que demuestra que se ha integrado en un cromosoma. [De R. L. Brinster.] Figura 20-34 Tipos de terapia génica en mamíferos La terapia en la línea germinal introduce un transgén tanto en la línea germinal como en las células somáticas, y por tanto puede ser heredado. La terapia génica somática introduce el transgén sólo en algunas células somáticas. 85 PARCHEADOS Figura 20-2 Formación de una molécula de DNA recombinante 1. Corte con EcoRI 2. Corte con EcoRI 3. Hibridación 4. Molécula de DNA recombinante Figura 20-3 Inserción de un gen dentro de un plásmido de DNA recombinante 1. Plásmido 2. Vector 3. Sitio de corte 4. Corte con endonucleasa EcoRI 5. DNA donante 6. Sitios de corte 7. Corte con endonucleasa EcoRI 8. Hibridación 9. DNA ligasa 10. Plásmido recombinante Figura 20-4 Cómo funciona la amplificación 1. Dianas de restricción 2. DNA donante 3. Fragmentos de restricción 4. Vector recombinante con inserto 1 ó 2 86 5. Genoma bacteriano 6. Transformación 7. Replicación, amplificación y división celular 8. Clon del fragmento donante 1 9. Clon del fragmento donante 2 Figura 20-5 Un vector plasmídico, pUC18 1. Vector pUC18 2. Sitio de clonación múltiple 3. Promotor lac 4. Corte del DNA foráneo y del vector con XbaII. 5. Transformación de las bacterias. 6. Siembra en una placa con ampicilina y X-Gal. 7. Azul 8. Blanco 9. Sin inserto 10. Inserto 11. Inserto Error: sobra la palabra “Insert” sola situada más a la izquierda en la parte inferior de la figura. Figura 20-6 Clonación en el fago λ 1. DNA genómico 2. Dianas Sau3A 3. Digestión parcial con Sau3A (compatible con BamHI) 87 4. Aislamiento de los fragmentos de 15 kb. 5. Se descartan los fragmentos mayores o menores. 6. Vector bacteriófago λ 7. Digestión con BamHI. 8. Aislamiento de los brazos izquierdo y derecho. 9. Ligación. 10. Brazo izquierdo 11. Brazo derecho 12. Unidades de DNA recombinante en tándem 13. DNA genómico 15 kb 14. Unidades empaquetadas in vitro dentro de los fagos 15. Genoteca de DNA genómico 16. Infección de E. coli. 17. Calvas 18. Rastreo de la genoteca con una sonda de ácidos nucleicos. Figura 20-7 Estructura de un vector BAC 1. Promotor T7 2. Promotor SP6 Figura 20-8 Métodos para introducir el DNA recombinante dentro de células bacterianas 1. Transformación 2. Transducción 3. Infección 88 4. Lisis 5. Fagos descendientes Figura 20-9 Búsqueda del clon de interés mediante el uso de sondas de DNA o RNA 1. Genoteca de clones de fago 2. Cultivo confluente de bacterias 3. Calva creada por un clon del fago 4. Transferencia de las calvas a una membrana absorbente. 5. Incubación de la membrana con una sonda radioactiva. 6. Membrana 7. Autorradiografía para localizar el clon deseado. 8. Película 9. Clon deseado 10. Infección de un nuevo hospedador bacteriano. 11. Amplificación del gen deseado. Figura 20-10 Búsqueda del clon de interés mediante el uso de anticuerpos 1. Digestión con EcoRI 2. Promotor lac 3. β-galactosidasa 4. Extremo cohesivo EcoRI 5. Ligación. 6. Proteína de fusión 7. Empaquetamiento in vitro. Siembra sobre un cultivo confluente. 89 8. Colocación de la membrana sobre la placa. 9. Separación de la membrana. 10. Placa original 11. Las proteínas se unen a la membrana. 12. Incubación de la membrana con un anticuerpo primario. Lavado de la membrana. Incubación de la membrana con un anticuerpo secundario marcado radioactivamente. 13. Proteína de fusión unida a la membrana 14. Anticuerpo secundario marcado 15. Anticuerpo primario 16. El anticuerpo identifica algunas calvas específicas. 17. Autorradiografía 18. Película de rayos X Figura 20-11 Electroforesis en gel 1. Clones 2. Dirección de migración Figura 20-12 Búsqueda de ácidos nucleicos específicos mediante el uso de electroforesis en gel y transferencia 1. RNA o DNA 2. Marcador de tamaños marcado con 32P 3. Electroforesis 4. Migración 5. Servilletas de papel 90 6. La solución absorbida por las servilletas de papel pasa a través del gel y la membrana 7. Esponja 8. Membrana 9. Solución salina 10. Gel 11. Gel 12. Membrana 13. DNA transferido a la membrana 14. Hibridación con una sonda de ácidos nucleicos. 15. Membrana en una bolsa sellada. 16. Eliminación de la sonda que no se ha unido. 17. Sonda hibridada a las secuencias complementarias 18. Exposición de una película de rayos X a la membrana. 19. Autorradiografía Figura 20-13 Paseo cromosómico 1. DNA eucariótico 2. Corte con EcoRI; inserción entre los brazos de λ. 3. Brazos de λ 4. Rastreo con una sonda del gen A. 5. Genoteca de λ 6. Clon λ 1 7. Amplificación de un pequeño fragmento mediante clonación. 8. Nuevo rastreo de la genoteca. 91 9. Clon adyacente λ 2 10. Amplificación de un pequeño fragmento mediante clonación, etc. 11. Clones λ que solapan generados por digestión parcial Figura 20-14 Reacción en cadena de la polimerasa 1. Región en el DNA diana que se quiere amplificar 2. 1 Calentamiento para separar las dos cadenas. 3. 2 Adición de cebadores sintéticos; enfriamiento. 4. 3 Adición de DNA polimerasa tolerante al calor para catalizar la reacción de síntesis del DNA 5’ → 3’. 5. Repetición de los pasos 1 y 2. 6. Síntesis de DNA (paso 3) catalizada por la DNA polimerasa tolerante al calor. 7. Repetición de los pasos del 1 al 3. 8. Después de 25 ciclos, la secuencia diana ha sido amplificada unas 106 veces. Figura 20-15 Estructura de los 2’, 3’-didesoxinucleótidos 1. base 2. No se puede formar un enlace fosfodiéster con el siguiente dNTP Figura 20-16 El método de secuenciación con didesoxinucleótidos 1. Cadena de DNA 2. Cebador marcado 3. DNA polimerasa I + 4 dNTPs + ddATP 4. Cebador marcado 5. DNA polimerasa I + 4 dNTPs + 92 6. Gel de acrilamida 7. Secuencia inferida a partir del gel 8. Secuencia de DNA de la cadena original Figura 20-18 Salto y paseo cromosómico 1. (a) Salto cromosómico 2. 1 Corte del DNA de la región que contiene el gen de interés en fragmentos grandes. 3. Fragmento de DNA 4. Punto de inicio 5. 2 Circularización del fragmento. 6. Corte 7. Corte 8. 3 Cortar la región de empalme y 4 clonarla utilizando un fago como vector. 9. Fragmento de empalme 10. Usar como punto de inicio para el segundo salto. 11. (b) Paseo cromosómico a partir de cada punto obtenido en los saltos 12. Inicio 13. Gen de interés 14. Paseos bidireccionales Figura 20-19 Principales diferencias morfológicas entre el teosinte salvaje y el maíz domesticado 1. Teosinte 2. Maíz moderno 93 Figura 20-21 Amniocentesis 1. Recogida de una muestra de líquido 2. Centrifugación. 3. Placenta 4. Cavidad amniótica 5. Pared uterina 6. Fracción líquida 7. Células 8. Estudios bioquímicos y enzimáticos 9. Cultivo celular 10. Estudios bioquímicos y cromosómicos (cariotipo) Figura 20-22 Métodos para introducir un transgén 1. Disparador de partículas 2. Tungsteno recubierto de DNA 3. Inyección 4. Transformación 5. Virus 6. Transgén Figura 20-23 Dos resultados de la transformación con vectores simples de levadura 1. Gen X1 2. Doble entrecruzamiento en 1 y 2 3. Plásmido 4. Marcador 94 5. Gen X1 6. Núcleo 7. Cromosoma 8. Gen X2 9. Entrecruzamiento sencillo en 1 10. Gen X1 11. Marcador 12. Gen X2 Figura 20-24 Infección por el plásmido Ti 1. Plásmido Ti 2. Genoma bacteriano 3. DNA cromosómico de la planta 4. Célula vegetal transformada 5. Agalla de la corona Figura 20-25 El plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens 1. Producción del tumor 2. Síntesis de nopalina 3. Utilización de la nopalina 4. Origen de replicación 5. Funciones de transferencia del T-DNA 6. Plásmido Ti Figura 20-26 Generación de una planta transgénica 95 1. Plásmido Ti cointegrado 2. Célula de planta de tabaco 3. Célula transformada 4. Cultivo celular 5. Plántula 6. Planta de tabaco transgénica 7. Célula de una planta transgénica Figura 20-27 Patrón de transmisión del T-DNA 1. Par cromosómico en una planta transgénica 2. Límites del T-DNA 3. Segmento de interés 4. Autopolinización 5. Descendencia Figura 20-28 Creación de transgenes en Caenorhabditis elegans 1. Región sincitial 2. Gónada 3. Núcleos 4. Micropipeta con una solución de DNA 5. Huevo 6. Unidad del DNA recombinante inyectado 7. Agrupación de transgenes extracromosómico 8. Agrupación de transgenes integrado 9. Cromosoma 96 Figura 20-29 Creación de transgenes en Drosophila melanogaster 1. (a) Elementos P 2. Gen de la transposasa 3. Autónomo 4. Extremo del elemento P 5. Extremo del elemento P 6. No autónomo 7. Deleción de la mayor parte del gen de la transposasa 8. (b) Método de inyección 9. Micropipeta con una solución de DNA 10. Núcleos 11. Anterior 12. Posterior 13. Embrión de Drosophila 14. Posición final de las células germinales 15. (c) Integración 16. Vector bacteriano 17. Cromosoma 18. Inserción 19. Segmento de DNA de interés Figura 20-30 Creación de transgenes en Mus musculus 1. Núcleo 2. Micropipeta con solución de DNA 97 3. Embrión de ratón de una sola célula 4. Cromosoma 5. Transgenes integrados Figura 20-31 Producción de células que contienen un gen específico noqueado 1. (a) Producción de células madre embrionarias con un gen noqueado 2. Gen clonado 3. Exón 2 4. Exón 1 5. Adición del gen tk+. 6. Inserción de neoR dentro del exón 2. 7. Vector dirigido 8. Adición del vector dirigido. 9. Cultivo de células madre embrionarias de ratón 10. (b) Inserción dirigida del vector mediante recombinación homóloga 11. Resultados posibles 12. Gen diana en el cromosoma 13. Cromosoma con la inserción dirigida 14. Inserción ectópica (aleatoria) 15. Gen de cualquier cromosoma 16. Cromosoma con una inserción aleatoria 17. No se produce inserción 18. Gen de cualquier cromosoma 19. Cromosoma inalterado 20. (c) Selección de las células portadoras del gen noqueado 98 21. Análogo de la neomicina 22. Mata a las células neoS 23. Ganciclovir 24. Mata a las células tk+ 25. Adición al medio. 26. Célula sin inserción 27. Célula con la inserción dirigida 28. Célula con una inserción aleatoria 29. Células portadoras de la mutación dirigida Figura 20-32 Producción de un ratón con un gen específico noqueado 1. Mutación dirigida 2. Cromosoma normal 3. Células ES de un ratón marrón 4. Ratón marrón 5. Hembra negra 6. Embrión en estado de blastocisto 7. a/a; M/M más A/A; M/m Embrión alterado 8. Embrión 9. Madre adoptiva 10. Macho quimérico recién nacido (portador de células originarias de dos líneas de ratones) 11. a/a; M/M más A/A; M/m 12. Adulto quimérico 99 Error: Figura incompleta. En la última columna de la parte (b) de la figura, falta el dibujo de un ratón en la parte superior, sobre los tres que hay. Debería ser un ratón NEGRO y con la COLA ENROLLADA, representado sobre un fondo verde y con un círculo en el lado superior derecho (al igual que el primer ratón de esta columna, aunque este es marrón y no negro). Debajo del dibujo debería aparecer la leyenda a/a; m/m. En la edición anterior hay un ratón dibujado en este lugar pero no tiene la cola enrollada ni está etiquetado como aa mm, que es el resultado del cruzamiento que falta. Figura 20-33 Terapia génica en ratones 1. Plásmido 2. Promotor de la metalotioneína de ratón (MP) 3. Gen de la hormona del crecimiento de rata (RGH) 4. Cigoto lit/lit 5. Madre adoptiva 6. Hijo transgénico 7. Pesos relativos 8. Ratones grandes 9. Ratones enanos lit/lit 10. Interpretación 11. Transgénico y grande 12. Enano 13. Grande 14. Enano Figura 20-34 Tipos de terapia génica en mamíferos 100 1. (a) Terapia génica en la línea germinal 2. Célula transgénica 3. Fase de blastocisto 4. Soma en mosaico 5. Gónada en mosaico 6. (b) Terapia génica somática 7. Transgén 8. Clones transgénicos Figura Problema 17 1. Niño 1 2. Transferencia de Southern 3. Digestión de DNA genómico con Xho 4. Sonda: gen D marcado con 32 P; Autorradiografías de transferencias de Northern (muestras de diferentes etapas del desarrollo) 5. Edad: 6. 1 año 2 años 3 años 4 años 7. Intensidad de las bandas escaneadas: 8. Muestras de enzima 9. Tinción de la enzima activa 10. Edad: 11. 1 año 2 años 3 años 4 años 12. Unidades de enzima activa: 13. Niño 2 14. Transferencia de Southern 101 15. Digestión de DNA genómico con Xho 16. Transferencias de Northern 17. Edad: 18. 1 año 2 años 3 años 4 años 19. Intensidad de las bandas escaneadas: 20. Muestras de enzima 21. Tinción de la enzima activa 22. Edad: 23. 1 año 2 años 3 años 4 años 24. Unidades de enzima activa: 102 TABLAS Tabla 20-1 Algunas enfermedades genéticas comunes Errores innatos del metabolismo Incidencia aproximada entre los nacidos vivos 1. Fibrosis quística (proteína de un canal 1/1600 caucasianos de cloro defectiva) 2. Distrofia muscular de Duchenne 1/3000 chicos (ligada al X) (proteína muscular defectiva) 3. Enfermedad de Gaucher 1/2500 judíos Ashkenazi; 1/75000 otros (glucocerebrosidasa defectiva) 4. Enfermedad de Tay-Sachs 1/3500 judíos Ashkenazi; 1/35000 otros (hexosaminidasa A defectiva) 5. Pentosuria esencial (condición 1/2000 judíos Ashkenazi; 1/50000 otros benigna) 6. Hemofília clásica (factor de 1/10000 chicos (ligada al X) coagulación VIII defectivo) 7. Fenilcetonuria (fenilalanina 1/5000 irlandeses celtas; 1/15000 otros hidroxidasa defectiva) 8. Cistinuria (transportador de membrana 1/15000 de la cisteína defectivo) 9. Leucodistrofia metacromática 1/40000 (arilsulfatasa A defectiva) 10. Galactosemia (galactosa-1-fosfato 1/40000 uridil transferasa defectiva) 103 11. Anemia falciforme (cadena de la β- 1/400 negros en Estados Unidos globina defectiva). En algunas poblaciones de África Occidental, la frecuencia de heterocigotos es del 40% 12. Talasemia (cadena de la globina 1/400 en algunas poblaciones reducida o ausente) mediterráneas Nota: Aunque una inmensa mayoría de las más de 500 enfermedades genéticas recesivas reconocidas son extremadamente raras, en conjunto constituyen una carga enorme de sufrimiento humano. En consistencia con las mutaciones mendelianas, la incidencia de algunas de estas enfermedades es mucho más alta en ciertos grupos raciales que en otros. Fuente: J. D. Watson, M. Gilman, J. Witkowski y M. Zoller, Recombinant DNA, 2ª edición. Copyright 1992 de Scientific American Books. 104